TIRF顕微鏡法によるファゴソームの形成と閉鎖の可視化

IgGオプソニン化赤血球または赤血球が表面に付着したポリマーコーティングされたガラス底皿を取ります。

皿を全反射蛍光顕微鏡ステージに置き、生理学的温度に保ちます。

重合アクチンに結合する蛍光標識細胞質ペプチドを含むマクロファージを添加し、細胞骨格の視覚化を促進します。

イメージング中は、レーザービームを臨界角よりも優れた角度に向け、接触点で内部反射とエバネッセント波の発生を引き起こします。

エバネッセント波は、ガラスとサンプルの界面で蛍光色素を選択的に照らし、食作用のリアルタイムの視覚化を可能にします。

マクロファージFc受容体は、IgGオプソニン化赤血球に結合し、接触領域の周囲に受容体のクラスタリングを引き起こします。

クラスタリングは細胞内シグナル伝達経路とGTPアーゼの活性化を引き起こし、アクチン重合とダイナミン動員を促進し、偽足を形成します。

偽足は赤血球の周りに伸び、食細胞カップを形成します。

最終的に、擬足の先端が融合します。蓄積されたダイナミンは、細胞膜からのファゴソーム分離を媒介し、オプソニン化された赤血球を内在化します。

SRBCの非共有結合固定のために、2ミリリットルのIgGオプソナイズ細胞をポリリジンコーティングされた各皿に注ぎ、スイングローター遠心分離機でサンプルを遠心分離します。上清を廃棄し、2ミリリットルのPBSと10%BSAで粒子を1回洗浄します。

次に、粒子を2ミリリットルの新鮮なPBSと10%BSAで室温で30分間インキュベートし、続いて2ミリリットルのPBSで3回洗浄します。最後の洗浄後、PBSを2ミリリットルの摂氏37度無血清顕微鏡培地と交換します。

SRBCコード化された皿を顕微鏡ステージに置きます。次に、トランスフェクトされた目的の細胞を培養皿の底からこすり落とし、細胞を数回ピペットで移動させて、単一細胞懸濁液を実現します。トランスフェクトした細胞をSRBCコーティング皿に加えます。

ライブ取得ソフトウェアを起動します。蛍光タグ付きタンパク質を発現する細胞を見つけ、目的の細胞がフィールドの中央になるように皿の位置を調整します。1つの励起波長で0.01度刻みで、0〜5度の異なる角度で500枚の画像を取得します。

入射光がガラス媒体界面で完全に反射してエバネッセント波を生成する臨界角を決定するには、適切なイメージングソフトウェアで画像シーケンスを開きます。均一な蛍光を持つ細胞内の関心領域を選択します。

次に、[画像] タブで [スタック] を選択し、Z 軸プロファイルをプロットします。Z軸プロファイルを、X軸上の角度の関数で関心領域で測定された平均蛍光強度をプロットします。臨界角よりも優れたx軸の角度値は、顕微鏡セッション中に使用してTIRF信号を取得できます。