哺乳動物の組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

こんにちは、ロブ・エドワーズです。私はカリフォルニア大学アーバイン校のレーザーキャプチャー顕微鏡施設のディレクターを務めています。ここでは、当施設に導入しているレーザーキャプチャー顕微鏡の使用方法について説明します。

当施設では、約3年前に購入したLeica A-S-L-M-Dを使用しています。レーザーキャプチャーシステムには2つの異なるタイプがあります。一つはスポット溶接のような方式で、プラスチック膜の下にガラススライド上の組織片を配置し、その組織を膜で覆う形式です。

次に、レーザー光源を用いてメンブレンを融解させ、実質的に組織をメンブレン上にスポット溶接し、その後、捕捉した組織とともにメンブレンを取り除きます。それでは、LCMシステムを起動するために、ここにあるいくつかの装置を順番に電源ONにします。まず、こちらのASLMDコントロールボックスの電源を入れます。

次に、コンピューターを起動します。捕捉する細胞を特定するために蛍光光学系が必要な試料を使用する場合は、蛍光照明用の水銀ランプを点灯させます。今回のデモンストレーションでは、水銀ランプは使用しません。

処置前後の検体の高品質な画像を撮影したい場合は、ロジックボックスとコンピュータの電源を入れた後、ここでスポットカメラを個別にオンにします。次に、レーザー電源制御ユニットの電源を入れます。このユニットは、装置底面背面にあるキーでオンにします。最後に、コンピュータモニターの電源を入れます。画面上には、習熟しておく必要のある操作コントロールがいくつかあります。

これらを頻繁に使用することになります。これは典型的なMicrosoft Windowsベースのプログラムであるため、いくつかのメニューについて説明します。ですが、まずはここのデスクトップについてお話ししましょう。

顕微鏡が実際に捉えている映像を表示するライブウィンドウがあります。メニューバーの上部にあるライブイメージボタンで表示でき、フリーズボタンを切り替えてからファイルメニューを使用することで、例えば抽出前と抽出後のように、分離した組織の一部の静止画をキャプチャして記録することが可能です。顕微鏡は、ヘマトキシリン対比染色組織をキャプチャするか、あるいは蛍光染色組織をキャプチャするかによって、明視野モードまたは蛍光モードのいずれかで動作させることができます。

次の2つのボタンには、顕微鏡ステージの平面に焦点を合わせる検体モード（specimen mode）と、ガラススライドを退避させて回収チューブ上部の回収された組織を可視化できるコレクターモード（collector mode）があります。これは品質管理のための設定です。メニューバーの次には、回収したい組織や細胞の部分を特定するために使用する一連の描画ツールがあります。

そして、画面の右側には、図形描画オプションやカットオプション、カット制御ボタンなどの追加の描画・キャプチャツールが配置されています。また、下部のコントロールパネルには、ステージ下の顕微鏡部分であり、組織をキャプチャするためのアイナーチューブを保持するコレクターデバイスがあります。A、B、C、Dと表記されたこれら4つのボタンで、キャプチャする検体の直下にどのチューブを移動させるかを制御します。

これは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）用に処理された典型的な組織凍結切片の例です。これらは、ペンフォイルスライド上で回収されたマウス胚頭部の冠状切片です。これらは 8 µm の凍結切片であり、乾燥後にヘマチンで対比染色され、使用まで -80 °C で保存されていました。

これらのスライドを顕微鏡にセットするために、顕微鏡に付属している専用のホルダーを使用します。組織はステージの平面下にあるエプンドールチューブに回収されるため、組織はスライドのこちら側にあります。したがって、スライドホルダーには、このように組織側を下にしてセットします。

スライドをそこに挿入すると、バネの圧力によって固定されます。そして、この穴がそのまま残ります。スライドホルダーを、これら2つのガイドの間に、顕微鏡ステージ上に配置します。

ステージ後部のクリップの下に、検体を固定するための小さな突起があることに気づくはずです。これを挿入すると、カチッという感触があります。次に、実際に組織を回収するためのアイナー管を設置します。

0.2 mLまたは0.5 mLのエッペンドルフチューブのいずれかを選択して使用でき、これらは小さなホルダーに装着し、さらにそれをステージ下の専用スロットにあるトレイに設置します。これにより、組織は実際にエッペンドルフチューブのキャップ上部に捕捉されます。ここでは例示のために0.5 mLのチューブを使用しています。

キャップをこのように差し込み、下から滑り込ませます。すると、キャップの縁が突起によって固定され、キャップがこのように下にクリップされます。その後、このキャップ全体をホルダーに入れます。核酸、特にRNA分離を目的として回収する場合、トリゾール溶液を数百µL直接キャップに入れることができます。トリゾール試薬にはフェノールやその他の腐食性化学物質が含まれているため、当然ながらこれを装置内にこぼさないようにすることが重要です。

こちらは先ほど申し上げた顕微鏡コントローラーです。この装置では、対物レンズ、照明、およびフォーカスが完全に電動化されています。したがって、フォーカスノブはこちらの上部にあります。ステージのY方向移動制御は、こちらのノブで行います。

こちらがXの照明調整コントロールです。左下にアイリス（絞り）コントロールがあり、これで照明強度を調整します。顕微鏡は各倍率で設定された照明レベルを記憶しています。そのため、対物レンズを切り替えると、照明が自動的に調整されます。

そして、コントローラーの右側にあるのが、対物レンズを切り替えるための対物レンズ turret コントロールです。この装置には、4x、10x、20x、40x、63x の5つの対物レンズが搭載されています。実際に組織をキャプチャするための最初のステップは、画面に表示されている内容がそのままキャプチャされるように顕微鏡を調整することです。

レーザーメニューオプションに移動して「calibrate」を選択し、「continue」をクリックして承諾します。現在、4倍の設定になっており、膜の比較的広い領域が確認できます。組織が存在しないことに注意してください。

スライドの一角でアライメントを行います。レーザーによって画面の右上にクロスハッチ（格子状の切り込み）が作成されているので、マウスを使用してそれを画面の中央に配置し、そのクロスハッチ上でクリックします。すると、コンピューターが別のクロスハッチを切り出します。それに合わせてアライメントし、クリックすると、さらに3つ目のクロスハッチが切り出され、そこでアライメントを行います。

顕微鏡の4倍対物レンズのキャリブレーションが完了し、アライメントが整ったため、実際に組織をキャプチャできる状態になりました。アライメントの過程で、切削されたクロスハッチ（格子状の切り込み）がかなり太かったことに気づいたかもしれません。これは、レーザー制御出力が非常に高い設定になっていたためです。

それほどの切断能力は必要ないと思われます。そこで、線を切断してレーザー出力を調整する方法を説明します。画面上にフリーハンドで対角線を描き、キャップを選択してから「start cut」を押すと、コンピュータが定義した線に沿って切断を行います。

ラインがどれほど太くなっているか分かります。レーザー出力を下げる必要があります。そこで、出力を調整します。

レーザーメニューからコントロールを選択します。強度が最大に設定されていることがわかります。ここからレーザー強度を約30まで下げて、設定を確定します。ここで新しく線を描いてカットすると、焼灼された組織または膜の幅がかなり狭くなっていることがわかります。

したがって、一般的な原則として、組織の気化量を最小限に抑えるために、レーザー制御出力を可能な限り低い設定にする必要があります。それでは、このミラーリングアイを用いて、実際に組織をキャプチャする方法を実演します。現在は4x対物レンズを使用しており、比較的大きな領域の組織のキャプチャを試みます。

この眼の中心から水晶体全体を単離します。そのため、フリーハンドで切除します。画面上部の描画コントロールを使用して、切除を行います。

キャプチャする検体の周囲に線を引きます。ここでは非常に低い倍率でこれを行っています。より正確な切り出しや、より小さな組織領域に関心がある場合は、当然ながら、より高い倍率でキャプチャすることが可能です。

切り出す領域を選択しましたので、「図形描画（draw shapes）」メニューに移動します。通常、私は「閉じた線（closed lines）」オプションをオンにしています。「閉じた線」機能とは、対象物の周囲に不規則な形状を描いた際に、キャプチャしたいオブジェクトを完全に囲んでいなくても、形状の開いた端点間に直線を描画する機能のことです。切り出す領域が確定しましたので、切断プロセスを開始します。コントロールボックスがレーザーを領域に集中させ、ほぼ完全に切り離されるのがわかります。

大きな組織片をキャプチャする際、組織が完全にとれず、一部がぶら下がったままの状態（hanging Chad）になることがよくあります。そのため、まずはもう一度カットし直してみてください。そうすれば、レーザーが組織の輪郭に沿って追従します。

あるいは、組織がぶら下がっている部分に小さなスペースを描いてそこを切断することで、組織を切り離すことも可能です。これで、この組織部位を採取できました。前述の通り、コレクターモードに切り替えて、その組織片が実際にコレクターまたはイノーターチューブキャップの中に入っていることを確認できます。

次に、コレクター制御ボタンを押し、顕微鏡の視野を切り替えます。これで、内視鏡チューブの内表面が確認でき、画面の右下に採取された組織片が見えます。実際にピントを合わせると、個々の細胞を確認することができ、選択した組織が正しく採取されたことが検証されました。

さて、回収される組織は本質的に舞い落ちる葉のようなものであるため、回収プロセスは100%の効率で行われるわけではありません。回収された組織断片のごくわずかな割合がエプンドーチューブの蓋の中に落ちないことがありますが、目的の組織の回収が完了した後の損失率は非常に低くなります。次のステップは、当然ながら、回収した組織が入ったエプンドーチューブを装置から取り出し、しっかりとキャップすることです。

これを行うには、このようにホルダーをまっすぐ静かに引き上げます。チューブのキャップが直立した状態を保つように注意しながら、トレイからホルダーを取り外し、その後、非常に慎重にチューブを引き抜きます。このようにスライドさせ、ホルダーから外した後、蓋ではなくインナーをこのように移動させます。

あらかじめ蓋にトリオールの一滴を滴下しておいた場合、組織の可溶化プロセスは既に始まっているため、研究室に戻ってRNA抽出を完了させることができます。マイクロスケールのRNA抽出キットを製造しているメーカーは数多くありますが、私たちはAmon社の製品を推奨しています。以上の手順で完了です。

本日は、ここUC Irvineのレーザーキャプチャー顕微鏡施設をご案内しました。組織からのRNA分離に向けた準備として、ペンフォイルコーティングスライドから凍結切片組織をキャプチャーする方法を実演しました。ご視聴ありがとうございました。皆様のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションがうまくいくことを願っております。