Name: 哺乳動物の組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 34 s
Description: 学ぶレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法による哺乳動物組織の精密分離技術。Leica A-S-L-M-Dを用いて標的細胞を正確に採取し、RNA抽出や分子解析に応用する方法を解説します。

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哺乳動物の組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

また、レーザーマイクロダイセクション（LMD）と呼ばれるレーザーキャプチャー顕微鏡は、、ユーザーは冷凍またはホルマリン固定、パラフィン包埋組織切片から細胞または組織の小さな数字を分離することができます。 LMDの技法は、熱に不安定なの上にどちらかに置か膜、または下に、組織切片に依存しています。一つの方法では、集光レーザーエネルギーは、組織切片から持ち上げことができる基盤となる細胞、上に膜を溶かすために使用されます。その他では、レーザーのエネルギーは、選択したセルが収集装置に分類できるように、組織に&quot;描かれた&quot;パスに沿って箔を気化。各テクニックは、数ミクロンの最小分解能で細胞を選択することができます。 DNA、RNA、タンパク質、および脂質試料を単離し、微小解剖試料から分析することができる。このビデオでは、我々は試料を装着し、キャプチャチューブのセットアップ用器具、試料調製の一般的な考慮事項を、初期化、LMDの原則への導入を含む7つのセグメントでライカAS - LMDレーザーマイクロダイセクション装​​置の使用を、示す、キャプチャコントロールを調整し、組織標本をキャプチャする、顕微鏡を揃える。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、少数の細胞に相当するものと小さいとして、純粋な細胞集団のサンプルを分離するために調査官が可能になります。これは実験結果を混乱させることが近隣の汚染物質、無料ですが、目的の細胞の分析を行うことができます。

レーザーキャプチャー顕微鏡法（レーザーマイクロダイセクション（LMD）としても知られる）により、凍結または...から少数の細胞や組織を単離することが可能になります。

こんにちは、ロブ・エドワーズです。私はカリフォルニア大学アーバイン校のレーザーキャプチャー顕微鏡施設のディレクターを務めています。ここでは、当施設に導入しているレーザーキャプチャー顕微鏡の使用方法について説明します。当施設では、約3年前に購入したLeica A-S-L-M-Dを使用しています。レーザーキャプチャーシステムには2つの異なるタイプがあります。一つはスポット溶接のような方式で、プラスチック膜の下にガラススライド上の組織片を配置し、その組織を膜で覆う形式です。次に、レーザー光源を用いてメンブレンを融解させ、実質的に組織をメンブレン上にスポット溶接し、その後、捕捉した組織とともにメンブレンを取り除きます。それでは、LCMシステムを起動するために、ここにあるいくつかの装置を順番に電源ONにします。まず、こちらのASLMDコントロールボックスの電源を入れます。次に、コンピューターを起動します。捕捉する細胞を特定するために蛍光光学系が必要な試料を使用する場合は、蛍光照明用の水銀ランプを点灯させます。今回のデモンストレーションでは、水銀ランプは使用しません。処置前後の検体の高品質な画像を撮影したい場合は、ロジックボックスとコンピュータの電源を入れた後、ここでスポットカメラを個別にオンにします。次に、レーザー電源制御ユニットの電源を入れます。このユニットは、装置底面背面にあるキーでオンにします。最後に、コンピュータモニターの電源を入れます。画面上には、習熟しておく必要のある操作コントロールがいくつかあります。これらを頻繁に使用することになります。これは典型的なMicrosoft Windowsベースのプログラムであるため、いくつかのメニューについて説明します。ですが、まずはここのデスクトップについてお話ししましょう。顕微鏡が実際に捉えている映像を表示するライブウィンドウがあります。メニューバーの上部にあるライブイメージボタンで表示でき、フリーズボタンを切り替えてからファイルメニューを使用することで、例えば抽出前と抽出後のように、分離した組織の一部の静止画をキャプチャして記録することが可能です。顕微鏡は、ヘマトキシリン対比染色組織をキャプチャするか、あるいは蛍光染色組織をキャプチャするかによって、明視野モードまたは蛍光モードのいずれかで動作させることができます。次の2つのボタンには、顕微鏡ステージの平面に焦点を合わせる検体モード（specimen mode）と、ガラススライドを退避させて回収チューブ上部の回収された組織を可視化できるコレクターモード（collector mode）があります。これは品質管理のための設定です。メニューバーの次には、回収したい組織や細胞の部分を特定するために使用する一連の描画ツールがあります。そして、画面の右側には、図形描画オプションやカットオプション、カット制御ボタンなどの追加の描画・キャプチャツールが配置されています。また、下部のコントロールパネルには、ステージ下の顕微鏡部分であり、組織をキャプチャするためのアイナーチューブを保持するコレクターデバイスがあります。A、B、C、Dと表記されたこれら4つのボタンで、キャプチャする検体の直下にどのチューブを移動させるかを制御します。これは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）用に処理された典型的な組織凍結切片の例です。これらは、ペンフォイルスライド上で回収されたマウス胚頭部の冠状切片です。これらは 8 µm の凍結切片であり、乾燥後にヘマチンで対比染色され、使用まで -80 °C で保存されていました。これらのスライドを顕微鏡にセットするために、顕微鏡に付属している専用のホルダーを使用します。組織はステージの平面下にあるエプンドールチューブに回収されるため、組織はスライドのこちら側にあります。したがって、スライドホルダーには、このように組織側を下にしてセットします。スライドをそこに挿入すると、バネの圧力によって固定されます。そして、この穴がそのまま残ります。スライドホルダーを、これら2つのガイドの間に、顕微鏡ステージ上に配置します。ステージ後部のクリップの下に、検体を固定するための小さな突起があることに気づくはずです。これを挿入すると、カチッという感触があります。次に、実際に組織を回収するためのアイナー管を設置します。0.2 mLまたは0.5 mLのエッペンドルフチューブのいずれかを選択して使用でき、これらは小さなホルダーに装着し、さらにそれをステージ下の専用スロットにあるトレイに設置します。これにより、組織は実際にエッペンドルフチューブのキャップ上部に捕捉されます。ここでは例示のために0.5 mLのチューブを使用しています。キャップをこのように差し込み、下から滑り込ませます。すると、キャップの縁が突起によって固定され、キャップがこのように下にクリップされます。その後、このキャップ全体をホルダーに入れます。核酸、特にRNA分離を目的として回収する場合、トリゾール溶液を数百µL直接キャップに入れることができます。トリゾール試薬にはフェノールやその他の腐食性化学物質が含まれているため、当然ながらこれを装置内にこぼさないようにすることが重要です。こちらは先ほど申し上げた顕微鏡コントローラーです。この装置では、対物レンズ、照明、およびフォーカスが完全に電動化されています。したがって、フォーカスノブはこちらの上部にあります。ステージのY方向移動制御は、こちらのノブで行います。こちらがXの照明調整コントロールです。左下にアイリス（絞り）コントロールがあり、これで照明強度を調整します。顕微鏡は各倍率で設定された照明レベルを記憶しています。そのため、対物レンズを切り替えると、照明が自動的に調整されます。そして、コントローラーの右側にあるのが、対物レンズを切り替えるための対物レンズ turret コントロールです。この装置には、4x、10x、20x、40x、63x の5つの対物レンズが搭載されています。実際に組織をキャプチャするための最初のステップは、画面に表示されている内容がそのままキャプチャされるように顕微鏡を調整することです。レーザーメニューオプションに移動して「calibrate」を選択し、「continue」をクリックして承諾します。現在、4倍の設定になっており、膜の比較的広い領域が確認できます。組織が存在しないことに注意してください。スライドの一角でアライメントを行います。レーザーによって画面の右上にクロスハッチ（格子状の切り込み）が作成されているので、マウスを使用してそれを画面の中央に配置し、そのクロスハッチ上でクリックします。すると、コンピューターが別のクロスハッチを切り出します。それに合わせてアライメントし、クリックすると、さらに3つ目のクロスハッチが切り出され、そこでアライメントを行います。顕微鏡の4倍対物レンズのキャリブレーションが完了し、アライメントが整ったため、実際に組織をキャプチャできる状態になりました。アライメントの過程で、切削されたクロスハッチ（格子状の切り込み）がかなり太かったことに気づいたかもしれません。これは、レーザー制御出力が非常に高い設定になっていたためです。それほどの切断能力は必要ないと思われます。そこで、線を切断してレーザー出力を調整する方法を説明します。画面上にフリーハンドで対角線を描き、キャップを選択してから「start cut」を押すと、コンピュータが定義した線に沿って切断を行います。ラインがどれほど太くなっているか分かります。レーザー出力を下げる必要があります。そこで、出力を調整します。レーザーメニューからコントロールを選択します。強度が最大に設定されていることがわかります。ここからレーザー強度を約30まで下げて、設定を確定します。ここで新しく線を描いてカットすると、焼灼された組織または膜の幅がかなり狭くなっていることがわかります。したがって、一般的な原則として、組織の気化量を最小限に抑えるために、レーザー制御出力を可能な限り低い設定にする必要があります。それでは、このミラーリングアイを用いて、実際に組織をキャプチャする方法を実演します。現在は4x対物レンズを使用しており、比較的大きな領域の組織のキャプチャを試みます。この眼の中心から水晶体全体を単離します。そのため、フリーハンドで切除します。画面上部の描画コントロールを使用して、切除を行います。キャプチャする検体の周囲に線を引きます。ここでは非常に低い倍率でこれを行っています。より正確な切り出しや、より小さな組織領域に関心がある場合は、当然ながら、より高い倍率でキャプチャすることが可能です。切り出す領域を選択しましたので、「図形描画（draw shapes）」メニューに移動します。通常、私は「閉じた線（closed lines）」オプションをオンにしています。「閉じた線」機能とは、対象物の周囲に不規則な形状を描いた際に、キャプチャしたいオブジェクトを完全に囲んでいなくても、形状の開いた端点間に直線を描画する機能のことです。切り出す領域が確定しましたので、切断プロセスを開始します。コントロールボックスがレーザーを領域に集中させ、ほぼ完全に切り離されるのがわかります。大きな組織片をキャプチャする際、組織が完全にとれず、一部がぶら下がったままの状態（hanging Chad）になることがよくあります。そのため、まずはもう一度カットし直してみてください。そうすれば、レーザーが組織の輪郭に沿って追従します。あるいは、組織がぶら下がっている部分に小さなスペースを描いてそこを切断することで、組織を切り離すことも可能です。これで、この組織部位を採取できました。前述の通り、コレクターモードに切り替えて、その組織片が実際にコレクターまたはイノーターチューブキャップの中に入っていることを確認できます。次に、コレクター制御ボタンを押し、顕微鏡の視野を切り替えます。これで、内視鏡チューブの内表面が確認でき、画面の右下に採取された組織片が見えます。実際にピントを合わせると、個々の細胞を確認することができ、選択した組織が正しく採取されたことが検証されました。さて、回収される組織は本質的に舞い落ちる葉のようなものであるため、回収プロセスは100%の効率で行われるわけではありません。回収された組織断片のごくわずかな割合がエプンドーチューブの蓋の中に落ちないことがありますが、目的の組織の回収が完了した後の損失率は非常に低くなります。次のステップは、当然ながら、回収した組織が入ったエプンドーチューブを装置から取り出し、しっかりとキャップすることです。これを行うには、このようにホルダーをまっすぐ静かに引き上げます。チューブのキャップが直立した状態を保つように注意しながら、トレイからホルダーを取り外し、その後、非常に慎重にチューブを引き抜きます。このようにスライドさせ、ホルダーから外した後、蓋ではなくインナーをこのように移動させます。あらかじめ蓋にトリオールの一滴を滴下しておいた場合、組織の可溶化プロセスは既に始まっているため、研究室に戻ってRNA抽出を完了させることができます。マイクロスケールのRNA抽出キットを製造しているメーカーは数多くありますが、私たちはAmon社の製品を推奨しています。以上の手順で完了です。本日は、ここUC Irvineのレーザーキャプチャー顕微鏡施設をご案内しました。組織からのRNA分離に向けた準備として、ペンフォイルコーティングスライドから凍結切片組織をキャプチャーする方法を実演しました。ご視聴ありがとうございました。皆様のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションがうまくいくことを願っております。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、3Dオルガノタイプ共培養モデルのレーザー解剖をミクロン単位の精度で説明しています。3D器官型モデルでは、線維芽細胞などの間質成分をがん上皮細胞と3次元共培養します。3Dモデルは、浸潤とがん-間質の相互作用を生理学的に近い条件で研究できるようにする実験ツールとして機能します。...

レーザーマイクロダイセクション:3D器官型培養モデルから浸潤する結腸直腸癌細胞を分離する技術

顕微解剖は、広範囲の組織内のDNA、RNA、およびタンパク質の試験のために使用されている。レーザーキャプチャー顕微鏡（LCM）は、最も一般的に使用される方法ですが、新しい製粉技術、mesodissectionは、最近になって提供されています。私たちは、 結核菌肉芽腫の組織スライドを組み込みmesodissectedホルマリン固定パラフィンからのRNA抽出を示しています。...

回復への新規マイクロダイセクションアプローチ<em&gt;結核菌</em肺肉芽腫、ホルマリン固定パラフィン包埋から&gt;特異的転写

個々のドーパミンニューロンの単離または直接または間接的な免疫組織化学との腹側被蓋領域は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを用いて実証されている。赤外線レーザーを用いてガラススライドから組織を単離するため、赤外および紫外レーザーの組み合わせを使用して膜のスライドからパラメータが議論されている。...

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション - 個々のドーパミンニューロンの単離と全体の腹側被蓋領域の実証

このプロトコルの目標は、下流のRNA分析のために不均一な前立腺組織から純粋な細胞型の集団を分離する効果的な方法として、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用することです。...

RNA分析のためのヒト前立腺上皮のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

ここでは、下流の RNA 解析のための小柱網 (TM) を隔離するため再現性のあるレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) のためのプロトコルについて述べる.TM での遺伝子発現の変化を分析する能力は、TM...

遺伝子発現解析のためのマウスの目から非常に純粋な小柱網のキャプチャ マイクロダイゼクション

骨細胞の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るために、レーザー捕捉微細解剖(LCM)プロトコルが開発されました。現在の研究は、マウス大腿骨のセクションに焦点を当てています。しかしながら、ここで報告されるLCMプロトコルは、任意の硬質組織の細胞における遺伝子発現を研究するために使用することができる。...

新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

このプロトコルは、マウス胚の新鮮な凍結切片から軟骨および骨を分離するためのレーザー捕捉マイクロセクションを記述する。軟骨および骨はクレシルバイオレット染色によって急速に視覚化され、正確に集めることができるので、トランスクリプト工学的分析のための高品質のRNAを得ることができます。...

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

レーザーマイクロディション(LMD)は、グリオーマの不均一性と侵入を媒介する経路を明らかにするために使用できる、敏感で再現性の高い技術です。ここでは、レーザーLMDを用いて、トランスクリプトーム解析を用いて、グリオーマ組織から離散領域を分離するための最適化されたプロトコルについて述べている。...

腫瘍性異種性、オンコストリーム、および浸潤の空間・分子特性解析のための神経膠腫部分領域のレーザー捕捉微小切除

レーザーマイクロダイセクションを使用してRNAシーケンシングのために個々の線虫組織を単離するプロトコルが記載されている。このプロトコルは、種固有の遺伝子ツールキットを必要とせず、単一組織サンプルのレベルで異なる種間で遺伝子発現プロファイルを比較することを可能にする。...

種にとらわれない単一組織アプリケーションのためのレーザーマイクロダイセクション

このプロトコルは、レーザーマイクロダイセクションを使用して組織学分解細胞集団を濃縮するための、染色された薄い組織切片画像から病理学的に確認された関心領域を人工知能駆動でセグメンテーションするためのハイスループットワークフローを記述します。この戦略には、関心のある細胞集団を示す境界をレーザー顕微鏡に直接転送することを可能にする新しいアルゴリズムが含まれる。...

腫瘍微小環境のマイクロスケールプロテオミクス分析のための工業化された人工知能誘導レーザーマイクロダイセクション

本プロトコルは、パラホルムアルデヒド固定および最適切断温度化合物埋め込みマウス肝組織の定義された組織領域からRNAをレーザーキャプチャマイクロ解剖を用いて単離し、ターゲットを絞った下流遺伝子発現解析を可能にする方法を説明しています。...

パラホルマルデヒド固定マウス肝組織のレーザーキャプチャ顕微解剖によるRNA解析

学ぶレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法による哺乳動物組織の精密分離技術。Leica A-S-L-M-Dを用いて標的細胞を正確に採取し、RNA抽出や分子解析に応用する方法を解説します。

哺乳動物の組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

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