カチオン性ポリマーを用いたナチュラルキラー細胞におけるウイルス形質導入の増強

ナチュラルキラー(NK)細胞を取り上げます。ウイルス酵素と蛍光タンパク質をコードする改変RNA分子を含むレンチウイルスベクターを追加します。

カチオン性ポリマーを加え、細胞とウイルスを沈殿させます。

ポリマーはウイルスと細胞の両方の負電荷を中和し、膜融合を促進します。

RNAはDNAに逆転写され、宿主ゲノムに組み込まれ、蛍光タンパク質の発現を可能にします。

サイトカインインターロイキン-2、またはIL-2を添加した培地を追加します。

IL-2は、導入遺伝子の発現を維持しながらNK細胞の生存と増殖を促進する細胞内シグナル伝達を引き起こします。

混合物をNK細胞上の特定の免疫受容体に結合する抗体でコーティングされたウェルに移し、抗ウイルスサイトカインを放出させます。

放出されたサイトカインを定量化して、サイトカイン産生に対するポリマーの影響を評価します。

蛍光色素を添加して、壊死細胞のDNAを標識します。

フローサイトメトリーを使用して、生細胞を同定し、蛍光タンパク質のシグナルを定量して、ポリマー誘導形質導入の効率を測定します。

マウスまたはヒト初代NK細胞を、5、10、および20のMOYで、ポリブレン、硫酸プロタミン、またはデキストランの存在下で、培地1ミリリットルあたり0.5 x 10⁵の24ウェルプレートのウェルに懸濁します。

プレートを1,000倍gで60分間遠心分離します。次に、上清をデカントせずに、5.2%の二酸化炭素を注入した摂氏37度のインキュベーターで細胞を一晩培養します。細胞を10ミリリットルのPBSで洗浄した後、IL-2を含む2ミリリットルのRPMI 1640培地を使用して細胞を再懸濁します。

細胞を採取する前日に、96ウェルの高タンパク質吸収性ポリスチレンプレートに1ミリリットルあたり2.5マイクログラムの抗NKG2Dモノクローナル抗体をコーティングし、プレートを室温または冷蔵庫で一晩インキュベートします。翌日、100マイクロリットルのPBSを使用して、各ウェルを3回洗浄します。

最初にプレートを軽くたたいて、形質導入されたNK細胞を採取します。次に、100マイクロリットルの細胞を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。活性化後16〜18時間、マルチチャンネルピペットを使用して上清を収集します。次に、ELISAキットの組換えサイトカインを使用して、標準曲線を生成し、上清中のインターフェロンガンマなどのサイトカインを定量します。

NK細胞の生存率をテストするには、形質導入の4日後に、10ミリリットルの冷たいPBSで細胞を2回洗浄します。次に、細胞を回収し、アネキシン-V / 7-アミノ-アクチノマイシンDを使用して染色します。フローサイトメトリーを使用して、形質転換されたNK細胞のうち壊死細胞の割合を決定し、テキストプロトコルに従ってデータを分析します。