siRNAによる単純ヘルペスウイルス感染未成熟樹状細胞におけるオートファジーの阻害

エレクトロポレーションキュベットを2つ取ります。1つのキュベットには、オートファジー誘導タンパク質であるFIP200の産生を阻害するように設計された小さな干渉RNA(siRNA)が含まれています。

2番目のキュベットには、FIP200産生を阻害しないコントロールとしてスクランブルsiRNAが含まれています。

未熟な樹状細胞(iDC)を追加します。siRNAの細胞侵入のためにエレクトロポレーションし、細胞をプレーティングします。

内在化されたsiRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体に結合します。

FIP200特異的siRNAとの複合体は標的mRNAを切断してFIP200産生を阻害し、対照siRNA処理iDCはFIP200を産生します。

細胞を採取し、単純ヘルペスウイルスを加えます。ウイルスエンベロープと細胞膜の融合により、放出されたDNAは核に入り、ウイルスタンパク質とヌクレオカプシドの産生につながります。

ウイルス蛋白質は核ラミンを破壊するFIP200は、シグナル伝達カスケードを引き起こす複合体を形成し、破壊されたラミンのオートファジーを誘導して分解の標的とし、ウイルスヌクレオカプシドの細胞質への脱出を促進します。

siRNAを介したFIP200産生の阻害は、ラミンオートファジーを制限し、ヌクレオカプシドの逃避を防ぎます。

細胞は、siRNA誘発性オートファジー阻害を評価する準備ができています。

アドヒアランス後 3.5 日目に、1,200 万個の iDC を 50 ミリリットルのチューブに移します。それらを300倍gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。並行して、フローサイトメトリー分析を実行して成熟状態を監視します。

iDCをフェノールレッドを含まない5ミリリットルのOptiMEMで穏やかに洗浄し、300倍gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞を200マイクロリットルのOptiMEMに再懸濁し、細胞濃度を100マイクロリットルあたり600万細胞に調整します。

FIP200特異的またはスクランブルされたsiRNAのいずれかの75ピカモールを4mm電極キュベットに加え、100マイクロリットルの細胞懸濁液をそれぞれのキュベットに移します。エレクトロポレーション装置を使用してiDCを直接パルスします。

エレクトロポレーション後、iDCを新鮮な予熱されたDC培地を含む6ウェルプレートに移し、1ミリリットルあたり100万細胞の最終濃度で細胞を播種し、インキュベーターに入れます。48時間後、エレクトロポレーションされたiDCの形態を顕微鏡で調べ、細胞スクレーパーで細胞を採取し、15ミリリットルのチューブに移します。

0.01%EDTAを添加した1ミリリットルのPBSでウェルをすすぎ、溶液をそれぞれのチューブに移します。次に、原稿に記載されているように、siRNA条件ごとに細胞を分割します。

500,000個の細胞を使用して、成熟状態と細胞生存率を評価します。ウェスタンブロット分析に100万個の細胞を使用して200の特異的なノックダウン効率を検証し、残りの細胞をHSV-1感染実験に使用します。