Name: マイクロタイタープレート形式で液体希釈法により、第一、第二ラインの薬のための結核菌の複合体の抗菌薬感受性試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: 学ぶマイクロタイタープレートを用いた液体希釈法によるMycobacterium tuberculosisの抗菌薬感受性試験。12種類の抗結核薬の最小発育阻止濃度を同時に測定し、薬剤耐性パターンを迅速に判定する方法です。

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私たちは、試験期間中に彼らの助けのためにメイヨークリニックMycobacteriology研究室の検査技師に感謝いたします。

各研究室では、接種の準備のためとプレートに接種のピペッティングに適切なバイオセーフティレベルを決定するために、その制度生物学的安全管理者と共同でリスク評価を実行する必要があります。マイクロタイタープレートに接種し、プラスチックの接着シールで密閉されるまで、私たちの研究室では、我々は生物学的安全性レベル3実験室（BSL3）プラクティスを活用する。これらのプレートは、熱にも密封であるビニール袋、内側に配置されます。マイクロタイタープレートのインキュベーションと解釈読書はバイオセーフティーレベル2実験室（BSL2）で実施される。 1。材料のラベリング<ol><li>ラベル血液寒天プレート、三ミドルブルック7H10プレート、ミドル7H9ブロス、生理食塩水、トゥイーンガラスビーズのチューブとBSL2の適切な識別子（例えば、患者名、医療記録番号）を持つマイクロタイターASTプレート。 </li><li>ラベル血液寒天培地と"純度のチェック"などのメッキ7H10。接種の定期的なコロニー数は、生物の適切な濃度は、試験で使用されていることを確認することをお勧めします。実行コロニー数は"1 / 1コロニー数"と"50分の1コロニー数"で標識7H10プレートの二つを持っている必要があります。 </li></ol> 2。 BSL3に入るテクノロジストの準備<ol><li>適切な個人保護具は、BSL3で作業する必要があるとソリッドフロントガウン、頭部カバー、手袋、靴カバー、および人工呼吸器が含まれています。各機関は、所属機関の産業衛生責任者と共同で独自の呼吸保護計画を確立する必要があります。当研究室では、我々はパワー空気浄化マスク（PAPRs）とフィットHEPAフィルタを通した、N95ハーフ顔の呼吸器を含む利用可能ないくつかの呼吸器を、持っている。 </li></ol> 3。生物学的安全キャビネットの準備<ol><li> BSL3では、表面を消毒し、空気の通気パネルから約6インチ消毒液で浸したペーパータオルを配置することによって、生物学的安全キャビネット（BSC）を準備する。 </li><li>廃棄物の左側の容器、および右側の小さいnephlometerとボルテックスを置きます。 </li><li>接種ループ、pipetorsとヒントは、ペーパータオルの横に配置されています。 </li><li>生物（ブロス中または固体培地上）とペーパータオルの上でマクファーランド0.5標準でラックを置きます。 </li></ol> 4。比濁計のキャリブレーション<ol><li>比濁計で生理食塩水、トゥイーンのガラスビーズ管を配置し、生理食塩水、トゥイーンのブランクを使用してゼロに楽器を設定します。 </li><li>比濁計のマクファーランド0.5標準を置いて、製造元の指示に従って、キャリブレーション。 </li></ol> 5。接種の準備<ol><li> ≥0.5マクファーランド標準が得られるまで、適切に標識された生理食塩水、トゥイーンガラスビーズのチューブに滅菌ループを使用して固形培地からBSC、スクレープのコロニーでの作業。 </li><li>視覚的にサンプルを検査し、マクファーランド標準と比較する。 </li><li> 30〜60秒間ボルテックスのサンプル。 </li><li>接種材料は、（タイマーを設定）15分のために解決することができます。 </li></ol> 6。マイクロタイタープレートの接種<ol><li>ステップ4.1と4.2でマクファーランド0.5に校正された比濁計を用いて生理食塩水、トゥイーンブロスで接種を調整します。これは、30分（メーカー仕様につき）以内に完了する必要があります。 </li><li> 200μLピペッターと生理食塩水ビーズ、トゥイーンのチューブのTOP 3分の1 回の接種を100μLを削除するには、LONGエアゾール耐性をピペットチップを使用してください。ミドル7H9ブロスに接種する。 20秒間ゆっくりと渦を接種7H9ブロス。 </li><li>メーカーのパッケージからASTマイクロタイタープレートを取り外します。箔のパッケージが破損している場合は乾燥剤が青色の場合、または使用しないでください。 </li><li>滅菌チューブに滅菌水50μLをピペットで50倍希釈の準備のために後で使用するために1:50希釈チューブを準備します。 </li><li>慎重に溝に7H9ブロス接種を注ぐ。エアロゾル発生を避ける。 </li><li>あなたのラベル面を上にしてASTマイクロタイタープレートを置きます。 </li><li>各ウェルに接種を100μLを追加するには、12チャンネルピペッターを使用してください。 </li><li>コロニーカウントのための希釈液を調製する： <ol type="a"><li> 1月1日希釈は、"1 / 1"とラベル7H10プレート上に1μlのループをストリーキングでも陽性対照（H12）から調製される。 </li><li> 50分の1希釈がよくポジティブコントロール（H12）から1μlのループを接種し、上記で調製した水管の50μlをチューブにそれを旋回することによって調製される。 "1 / 50"というラベルの付いたプレートにこの希釈のストリーク1μL。 </li></ol></li><li>適切に標識された血液寒天培地と分離用7H10プレートとストリークの上に50μLをピペッティングすることによりトラフから純度のプレートに接種する。 </li><li>の場所ASTのマイクロタイタープレート上に接着剤シール。シールの白いバックを使用して十分なシール性を確保するために各ウェルにしっかりと押します。折り目を避けてください。 </li><li>ヒートシールやテープとビニール袋と密接に結核菌消毒剤と場所のマイクロタイタープレートに浸したペーパータオルでそれを拭いてマイクロタイタープレートを消毒する。 <ol type="a"><li>ビニール袋がある主な板の漏れや流出でなければならないすべての培養液が含まれていることを確認するために二次的コンテナとして機能します。 </li></ol></li></ol> 7。材料と生物学的安全キャビネットの消毒<ol><li>エアロゾルを製作するのを避けるために、廃棄容器に静かにそれを配置する前に接種したトラフの上に別のトラフを配置。 </li><li>結核菌消毒剤でダウン拭いてnephlometer、ボルテックス、プレート、チューブ、等を含むすべての材料を消毒し、BSCから取り外す前に、製造元の指示に従って消毒を保証するために適切な時間を待つ。例えば、Prospray、我々が使用する結核菌消毒剤は、抗酸菌を殺すために15分かかります。 </li><li>オートクレーブの前に医療用ごみ袋とシールの廃棄容器を置きます。 </li></ol> 8。インキュベーション<ol><li>プレートを下にメディアとの注意を払って培養する必要のあるすべての液体をこぼしたり、飛散しないように注意してください。 </li><li> BSL2実験室で5〜10％CO 2で5〜10％のCO 2で35〜37℃のインキュベーターでASTのマイクロタイタープレートのプレート、7H10と血液寒天プレートをインキュベートする。 <ol class="lalpha"><li>プレートはしっかりと密封されて、内側密封ビニール袋なので、私たちの研究室では、これは許容範囲です。 </li></ol></li><li> 3回以上のマイクロタイターASTプレートは、製造元の指示に従ってインキュベーターを重ねる必要があります。 </li></ol> 9。代表的な結果結果の解釈： 封印されたASTマイクロタイタープレートは、手動で補助としてまたはVizion（TREK診断）などの自動プレートリーダーでミラーを使用して読み取ることができます。プレートは、できるだけ早く接種後7日間として調べることができます。彼らは正かどうかを判断するための位置H11とH12での成長制御の井戸を調べて（すなわち、ウェルの底にある細胞の預金を持っている）。成長のコントロールウェルが正でない場合は成長のコントロールウェルが陽性になるまで（例えば、10日目、14日目）定期的に、プレートをreinc​​ubateと再検討する。 <ol type="a"><li>ミラーの読み取り： <ol type="i"><li>場所は、プラットフォームにASTマイクロタイタープレートを密封。 </li><li>インキュベーションの7日後に成長のコントロールウェルを読んで、これは負、reinc​​ubate ASTマイクロタイタープレートの場合はtrue。 </li><li>成長のコントロールが許容できる場合には、薬物を含むウェルをお読みください。各薬剤のために、成長の制御と薬剤の井戸を比較しても成長を持たない最初の希釈を記録。 </li><li>成長は、濁度として、あるいはウェルの底にある細胞の預金として表示されます。 </li></ol></li><li>楽器はリード：メーカーの指示に従って、以下の手順では、読書がVizionのプラットフォームで行われる方法の例は次のとおりです。 <ol type="i"><li>ログインします。 </li><li> "MYCOTB"ASTプレートのソフトウェアを使用してください。 </li><li>ユーザーが直面しているバーコードで密封されたプレートを置きます。成長は、濁度として、あるいはウェルの底にある細胞の預金として表示されます。 </li><li>成長のコントロールを読んで、これは負、reinc​​ubate ASTマイクロタイタープレートの場合は、プラスの成長を示していない各薬剤の最初のウェルに画面をタッチするプレートを読んでいれば。 </li></ol></li></ol>純度のプレートをお読みください。血液寒天プレートは48時間後には成長を示してはならないと7H10純度のプレートは、ある生物の種類のコンフルエントな成長が必要です。汚染された場合、ASTマイクロタイターテストは、純粋培養から繰り返す必要があります。 よく下の表を使用して、陽性コントロールのコロニー数を計算します。 コロニーカウントキー<table border="1"><tbody><tr><td> ＃コロニーは、"1 / 1"というラベルの付いたプレートでカウント </td><td> "1 / 50"というラベルの付いたプレートでカウント＃コロニー </td><td> 接種コロニーカウント（CFU / mL）を </td></tr><tr><td> &lt;50 </td><td> 0 </td><td> &lt;5 × 10 4 </td></tr><tr><td> 50から100 </td><td> 0から2 </td><td> 5 × 10 4〜1 × 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> ≤10 </td><td> 5 × 10 5〜1 × 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> &gt; 10 </td><td> &gt; 5 X 10 5 </td></tr></tbody></table> 結核tuberculoの一部の菌株でパラアミノサリチル酸とが続くことがありますSIS。これは、ペレットを持っているすべての井戸を見て、エンドポイントとして、次の希釈と同じサイズのペレットを持つ最初のウェルを使用して解釈することができます。抵抗は、この薬ではまれである。 <img src="/files/ftp_upload/3094/3094fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 MYCOTBプレートを使用した代表的な結果。 <table border="1"><tbody><tr><td> 薬剤の略語 </td><td> 薬 </td><td> MICのμ/ mLの </td></tr><tr><td> OFL </td><td>オフロキサシン</td><td> 16 </td></tr><tr><td> MXF </td><td>モキシフロキサシン</td><td> 8 </td></tr><tr><td> RIF </td><td>リファンピン</td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> AMI </td><td>アミカシン</td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> STR </td><td>ストレプトマイシン</td><td> 16 </td></tr><tr><td> RFB </td><td>リファブチン</td><td> 8 </td></tr><tr><td> PAS </td><td>のp -アミノサリチル酸</td><td> ≤0.5 </td></tr><tr><td> ETH </td><td>エチオナミド</td><td> 5 </td></tr><tr><td> CYC </td><td>サイクロセリン</td><td> 4 </td></tr><tr><td> INH </td><td>イソニアジド</td><td> 2 </td></tr><tr><td> KAN </td><td>カナマイシン</td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> EMB </td><td>エタンブトール</td><td> 4.0 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs. Presented at 50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 Sept. 12, Boston, MA, , Abstract 2450 (2010).</li>
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<li>Bergmann, J. S., Woods, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+ESP+Culture+System+II+for+Testing+Susceptibilities+of+Mycobacterium+tuberculosis+Isolates+to+Four+Primary+Antituberculosis+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs.</a> J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).</li>
</ol>

開示することは何もありません。

プラス成長のコントロールを持つASTのマイクロタイタープレートの例を図1に示されており、各薬剤のエンドポイントのMIC（μg/ ​​mlの）が円で囲まれている。当研究室で行われた研究では、ASTマイクロタイタープレート法は、 結核菌の感受性試験のためのゴールドスタンダード寒天比例の方式と同等であることが示された。 ASTマイクロタイタープレートと寒天の割合の方法14時と21日間の最終的な解釈と伝統的な寒天の割合の方式と比較した場合、結果の迅速な報告がマイクロタイターASTマイクロタイタープレートで得られた、respectively.The ASTマイクロタイタープレートは、最初のテストの利点を有しており、耐性菌との過度の遅延を防ぐことができます同時にセカンドラインの薬剤。 ASTマイクロタイタープレートには、APMよりもセットアップや読みする方がはるかに簡単ですし、そのようなVIZION、手動ミラーと半自動化システムの両方は、プレートを読み取るために使用することができます。結核の薬剤耐性検査のMIC値の可用性は、特に&quot;ボーダーライン&quot;感受性とのそれらの分離株については、従来の臨界濃度の値に対する相対医師に有益な新しい情報を提供することがあります。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> ASTマイクロタイタープレートと接着剤シール</td><td> TREK診断、オハイオ州クリーブランド</td><td> MYCOTB </td></tr><tr><td>マクファーランド0.5標準</td><td> TREK診断、クリーブランド、オハイオ州</td><td> E1041 </td></tr><tr><td>ミドルブルック7H10プレート</td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>血液寒天プレート</td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>滅菌は、1μLループします</td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ループは10μL </td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td> Sensititre生理食塩水 - ツイーンガラスビーズスープ</td><td> TREK診断、クリーブランド、オハイオ州</td><td> 27143 </td></tr><tr><td> 7H9 OADCスープ</td><td> TREK診断、クリーブランド、オハイオ州</td><td> T3440 </td></tr><tr><td>ロングピペットチップ</td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>無菌トラフ</td><td> TREK診断、クリーブランド、オハイオ州</td><td></td></tr><tr><td> 結核菌 </td><td> ATCC </td><td> 27294 </td></tr><tr><td> Pipeters：1000、200、20μL </td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>ヒント1000、20、20μL </td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペッター</td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター5〜10％のCO 2 </td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>ビニール袋、小型の、CO 2透過性</td><td>ポリプラスチック、デラノ、PA </td><td></td></tr><tr><td> TBの消毒剤（このようなProSpray C - 60など） </td><td> Certolインターナショナル、コマースシティ、CO </td><td> PSC60/32 </td></tr><tr><td>ミラーボックスリーダー</td><td>フィッシャー</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロタイタープレート形式で液体希釈法により、第一、第二ラインの薬のための結核菌の複合体の抗菌薬感受性試験

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

抗菌剤耐性の迅速な検出は、耐性結核菌（MTB）の増加を制御するための努力に重要です。マウンテンバイクの抗菌薬感受性試験（AST）は伝統的に比率の寒天法によるか、または/バクテック（Becton Dickinson社、スパークス、MD）、VersaTREK（TREK診断、クリーブランド、オハイオ州）またはバクテなどの機器上でmacrobroth試験によって行われているALERT（ビオメリュー、ヘーゼルウッド、ミズーリ）。と考えながら、寒天の割合の方法は、ASTの&quot;ゴールド&quot;スタンダードは、労働集約的であり、薬物のない寒天と比較して薬物含有寒天培地上にコロニー数を実行することで抵抗の計算が必要になります。薬剤を含まない培地と比較して薬物含有培地上≥1％の成長率がある場合は、生物は、その薬剤に耐性と考えられている。 macrobrothメソッドは、最初の行の薬（イソニアジド、エタンブトール、リファンピン、およびピラジナミド）のインスツルメンテーションとテストのブレークポイント（&quot;クリティカル&quot;）の薬物濃度が必要です。ここで説明する方法では、96ウェルマイクロタイタープレートフォーマットで[MYCOTB（TREKの診断）]市販されており、最初の（イソニアジド、リファンピン、エタンブトール）およびセカンドライン治療薬（アミカシン、両方を含む結核の治療に使用される12抗菌剤の濃度を増加含まれていますサイクロセリン、エチオナミド、カナマイシン、モキシフロキサシン、オフロキサシン、パラアミノサリチル酸、リファブチン、およびストレプトマイシン）。ピラジナミド、最初の行の薬は、酸性試験条件の必要性に起因するマイクロタイタープレートに含まれていません。マイクロシステムの利点は、従来の寒天の割合（21日）と比較して前後の設定と高速ターン（14日）の使いやすさの両方が含まれています。さらに、プレートはブロスまたは固形培地のいずれを用いて調製した接種材料から設定することができます。マイクロタイタープレートフォーマットが新しくなるとマウンテンバイクが研究室で独自の安全性の課題を提示するので、このプロトコルは安全に設定する方法を説明するので、インキュベートし、マイクロタイタープレートをお読みください。

結核菌の抗菌薬感受性試験は厳しいが、患者のケアのための非常に重要です。このマイクロタイタープレートフォーマットは、12抗マイコバクテリア薬のテストを提供し、適切な治療に役立つだろう最小発育阻止濃度（MIC）値を、提供します。

薬剤耐性結核菌（Mtb）の増加を抑制する取り組みにおいて、薬剤耐性の迅速な検出は極めて重要である。...

結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の治療に利用可能な薬剤は比較的少なく、あらゆる薬剤への耐性獲得が懸念されています。本ビデオ論文では、M tuberculosisの12種類の異なる抗菌薬に対する耐性を同時に検査する手順について解説します。したがって、M tuberculosisの薬剤耐性を迅速に検出する能力は、耐性株の増加を抑制する取り組みにおいて非常に重要です。ここでは、抗菌薬感受性を試験する方法について述べます。M tuberculosisをまず固体培地または液体培地で培養し、細菌懸濁液を作成します。接種量を調製し、一次薬剤および二次薬剤を含む12種類の薬剤を異なる濃度で分注したマイクロタイタープレートに添加します。インキュベーション後、各ウェルの増殖程度をミラーボックスを用いて手動で、または半自動プレートリーダーを用いて判定します。得られたデータは、テストした各薬剤の最小発育阻止濃度を示し、テストした結核菌株がどの抗菌薬に耐性を持っているかを示します。これらの結果は、結核治療に適した薬剤を選択するのに役立ちます。こんにちは、私はナンシー・エックです。ミネソタ州ロチェスターのメイヨー・クリニックにあるマイコバクテリオロジー研究室のディレクターを務めています。本日は、結核菌（mycobacterium tuberculosis）の薬剤感受性試験の方法について説明します。マクロブロス希釈法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、各薬剤のMIC（最小発育阻止濃度）を決定でき、かつ12種類の抗菌薬を同時に試験できる点にあります。実際の操作手順については、当研究室の品質管理スペシャリストであるKurt Judeが、実験ベンチにて実演します。血液寒天地培地、Middlebrooks 7H10培地3枚、生理食塩Tweenガラスビーズ管、およびマイクロタイタープレートに、患者名と検体識別番号を記入して準備します。さらに、血液寒天培地と7H10培地に「純度確認用」とラベルを貼ります。これらの7H10培地のうち1枚に「1:1コロニー数」、もう1枚に「1:50コロニー数」と記入してください。次に、トレイをパスボックスに入れます。続いて、前方閉鎖型ガウン、ヘッドカバー、手袋、シューズカバー、および呼吸用保護具を着用し、バイオセーフティレベル3（BSL 3）施設での作業準備を整えます。ここでは、PAPR（電動ファン付き呼吸用保護具）を使用します。次に、パススルーからトレイを回収します。続いて、BSL3施設内で、生物安全キャビネットの表面を消毒します。その後、消毒液に浸したペーパータオルをフード内に置き、ペーパータオルの隣にあるエアベントパネルから約6インチ離した位置に配置します。接種ループ、ピペッターとチップ、適切な廃棄物容器、nephi、TER、およびボルテックスを用意します。フードの準備が整ったら、OADCを含む seven H nine broth と生理食塩水ビーズチューブを入れたラックと共に、微生物をペーパータオルの上に配置します。このセットアップは固体培地から行います。患者検体の固体培地培養物から接種源を調製します。滅菌ループを用いてコロニーを掻き取り、サリンTweenガラスビーズチューブに移します。懸濁液を30〜60秒間ボルテックスします。サンプルを目視で確認し、マクファランド標準液と比較します。分注した量は標準液と同等か、それ以上である必要があります。そうでない場合は、細菌サンプルを追加し、再度ボルテックスミキサーで撹拌してください。マクファーランド標準液と一致させた後、細菌の大きな凝集塊を沈殿させるため、接種液を15分間静置します。次に、nefi TERを用いて懸濁した細菌の密度を測定し、ゼロ点調整を行います。nephi ter。まず、生理食塩水ビーズが入った空のチューブをネフェロメーターにセットします。キャリブレーションボタンを押して計器をゼロ点調整し、次にMcFarland 0.5標準液をネフェロメーターにセットして、再度キャリブレーションボタンを押します。計器の校正が完了したら、McFarland標準液を取り出し、接種液を挿入します。接種菌液の測定値は、マクファーランド標準液の測定値と一致させる必要があります。測定値が低すぎる場合は、チューブを取り出し、プレートからさらに細菌を移してください。その後、ボルテックスで攪拌し、サンプルを再度測定します。読み取り値が高すぎる場合は、チューブにサリネTweenを加えてボルテックスします。その後、サンプルを再度測定してください。細菌の濃度がマクファーランド標準液と一致するまで、必要に応じて接種量を調整し続けます。次に、200 µLピペッターとフィルター付きロングピペットチップを使用して、チューブの上部3分の1から100 µLの接種液を採取します。Middlebrook 7H9ブイヨンに沈殿した凝集塊を避けるため、接種済みのブイヨンを20秒間ゆっくりとボルテックスして接種液を均一にします。まず、メーカーのパッケージからマイクロタイタープレートを取り出します。乾燥剤が青色であるか、またはアルミ箔パッケージが破損している場合は、使用しないでください。プレートの各ウェルには、最も効果的な第一選択薬および第二選択薬を含む、テスト対象の12種類の抗菌剤がすでに分注されています。エアロゾルが発生しないよう注意しながら、7 H9ブロス接種液をチューブに慎重に注ぎます。次に、図のようにラベルを外側に向けてマイクロタイタープレートを設置し、12チャンネルピペッターを使用して、各ウェルに接種液を100 µLずつ加えます。次に、コロニー計数を行うためのプレートを準備します。まず、陽性対照ウェルからサンプルを1 µLループで採取し、「1 to 1」と表記された7 H 10プレートに移して、未希釈プレートを作成します。その後、ループを用いて、ここに示すようにプレートに画線塗布を行います。次に、1/50希釈液を調製するため、陽性コントロールウェルから1 µLループで分取し、50 µLの滅菌水が入ったチューブに入れて撹拌します。この希釈液1 µLを、「1 to 50」と表記したプレートに塗抹します。純度確認用プレートへの接種は、tryptic soy brothから接種液50 µLを適切にラベル付けした血液寒天培地および7 H 10培地にピペッティングし、単離 streaking を行います。次に、接種済みのtrthの上に別のtrthを重ね、慎重に廃棄容器に入れます。マイクロタイタープレートに粘着シールを貼ります。その後、白いバッキングを用いて各ウェルをしっかりと押し付け、シワが入らないようにして適切に密閉します。結核菌用消毒剤を浸したペーパータオルでマイクロタイタープレートを拭き、消毒します。次に、マイクロタイタープレートをプラスチック袋に入れ、ヒートシールで密閉します。最後に、ピペット、ボルテックスミキサー、プレート、チューブを含むすべての器具を、結核菌用消毒剤で拭いて消毒します。ここでは、消毒を確実にするために十分な時間を経過させた後、pro sprayを使用します。pro sprayの処理時間は15分間です。プレートをスコッチテープで固定してプラスチック袋に入れ、密封した用品をバイオセーフティキャビネットから取り出してパススルーボックスに移動させます。廃棄用の赤色バッグを閉じ、ツイストタイで封印します。この時点で、ガウン、ブーツカバー、および手袋を脱ぎます。前室へ移動して手を洗い、その後、レスピレーターを外します。再度手を洗った後、レスピレーターを消毒して保管し、新しいガウンを着用してBSL-3施設から退出します。次に、廃棄容器をオートクレーブで滅菌します。続いて、マイクロタイタープレートと7枚のH 10および血液寒天プレートを、BSL 2ラボ内の35～37 °C、5～10% CO2のインキュベーターで、正立状態で培養します。プレートは密閉され、プラスチック袋に入っているため、この方法は許容されます。Mycobacterium tuberculosisの世代時間は約12～24時間であるため、コントロールウェルの底部に細胞ペレットが形成され、増殖が確認できるまでには少なくとも1週間かかります。10日目に、密閉したASTマイクロタイタープレートをミラーボックスのプラットフォームに設置し、手動でミラー読み取りを行います。デスクランプを使用して増殖の視認を補助し、最適なコントラストが得られるように適宜調整します。この例では、ミラーで確認し、増殖コントロールウェル（H 11およびH 12）をチェックします。増殖がある場合、ここに示すように、ウェルが濁っていたり、沈殿物があるように見えたりします。この例のように増殖が見られない場合、ウェルは透明に見えます。この場合は、プレートをインキュベーターに戻し、最大21日間まで培養を継続してください。各条件について、コントロールと増殖を比較します。次に、各薬剤の記録について、増殖が見られない最初の希釈段階を確認します。これが、その薬剤の最小発育阻止濃度（MIC）となります。自動プレートリーダー（Visonなど）を使用して結果を確認するには、まずMycoTB ASTプレートソフトウェアを開いてログインします。バーコードを外側に向けて、密封されたプレートをセットしてください。ここでは、増殖が濁度として、あるいはウェルの底に細胞が沈殿している状態でコンピュータ画面に表示されます。まず、増殖コントロールを確認します。前述の手順と同様です。増殖が陰性である場合は、プレートを最大21日間インキュベーターに戻してください。陽性である場合は、各薬剤について、増殖が見られない最初のウェルを画面上でタッチして結果を記録します。場合によっては、細菌、沈殿物、または薬剤がウェルの底に沈殿することがあります。この現象は「トレーリング（trailing）」として知られており、同じサイズのペレットが複数のウェルに認められることで示されますが、実際には陽性の増殖とはみなされません。次に、7枚のH 10培地と血液寒天培地を検査し、細菌濃度を決定して純度を評価します。血液寒天培地では、48時間後に増殖が見られないはずです。血液寒天培地で増殖が認められた場合は、急速に増殖する細菌による汚染を示しています。菌の増殖が認められる場合は、マイクロタイター試験を繰り返す必要があります。7 H 10 純粋培養プレートでは、1種類の菌のみが増殖している必要があります。Type EM tuberculosisは、淡黄色で、しわ状で、粗い外観を呈します。コンタミネーションが認められた場合は、純粋培養からマイクロタイター試験をやり直す必要があります。細菌濃度を評価するために、7枚のH 10プレート上のコロニー数を数えます。次に、付属の書面にある表を用いて、コロニー数を算出してください。患者検体からMycobacterium tuberculosisを培養し、本ビデオで説明した方法で抗生物質耐性を評価しました。ここに示すプレートには、12種類の異なる薬剤が濃度勾配で配置されており、上部が最高濃度、下部が最低濃度となっています。薬剤の最小発育阻止濃度（MIC）は、増殖が認められない最低薬剤濃度によって示され、ここに示す画像ではClinical and Laboratory Standards Instituteによって設定された標準的なブレークポイントを用いて円で囲まれています。ここに示されたデータは、この結核菌株がIsidおよびRifampinに耐性を持つことを示唆しています。in vitroにおいて、oin、moxifloxacin、streptomycin、およびrifabutinを含む他のいくつかの薬剤で認められた高いMICは、このEM結核菌株がこれらの薬剤に対して耐性を持つことを示唆しています。MICの結果は、結核治療に精通した感染症専門医が個別の治療計画を策定するために使用する必要があります。この手法に習熟すれば、1つの分離株のセットアップに約40分かかります。この手順を行う際は、本菌が呼吸器系病原体であり、エアロゾルが発生し得ることに留意することが重要です。このビデオを視聴することで、微量液体希釈法を用いたMycobacterium tuberculosisの薬剤感受性試験のセットアップ方法について十分に理解できたはずです。Mycobacterium tuberculosisを扱うことは非常に危険であるため、必要に応じて呼吸器保護などの予防措置を常に講じてください。

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Research

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