マイクロタイタープレート形式で液体希釈法により、第一、第二ラインの薬のための結核菌の複合体の抗菌薬感受性試験

結核菌の治療に利用できる薬剤は比較的少ないため、どの薬剤にも耐性が懸念されます。このビデオ記事では、12種類の微生物薬に対するM結核の抗生物質耐性を同時に試験する手順を説明しています。したがって、M結核の抗菌薬耐性を迅速に検出する能力は、ここで抗生物質感受性をテストするために耐性株の増加を制御する努力において非常に重要です。

M結核は、最初に固体またはブロス培地、細菌懸濁液で増殖します。接種物を調製し、インキュベーション後のファーストラインおよびセカンドラインの薬物を含む12種類の薬物の異なる濃度を含むマイクロタイタープレートに添加する。各ウェルの成長範囲は、ミラーボックスを使用して手動で決定するか、半自動プレートリーダーを使用して決定します。

得られたデータは、試験した各薬剤の最小阻害濃度を示し、試験した結核菌がどの抗生物質に耐性を持つかを示しています。これらの結果は、結核の治療に適した薬剤を選択するのに役立ちます。こんにちは、私の名前はナンシー・エックで、ミネソタ州ロチェスターのメイヨークリニックにあるMyco Bacteriology Laboratoryの所長です。

今日は、結核菌の抗生物質感受性試験を行う方法について説明します。マクロブロス希釈のような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、薬剤ごとにMICが決定され、12種類の抗生物質が同時に試験されることです。手順を実演するのは、私の研究室の品質専門家であるカート・ジュードで、実験室のベンチで働いています。

この手順の準備として、血液寒天プレート、3 つの Middlebrooks 7 H 10 プレート、生理食塩水 Tween ガラス ビーズ チューブ、および患者の名前と検体識別番号のマイクロタイター プレートにラベルを付けます。さらに、血液寒天培地と7枚のH 10プレートに純度としてラベルを付けます。これらの7つのH 10プレートのうちの1つに1対1のコロニーカウントとして、もう1つに1から50のコロニーカウントとしてラベルを付けます。

次に、トレイをパススルーに置きます。次に、レベル3のバイオセーフティBSL3施設で働くために、しっかりとしたフロントガウン、ヘッドカバーグローブ、シューズカバー、人工呼吸器を着用して準備します。ここでは、パッパマスクを使用しています。

次に、パススルーからトレイを取り出します。次に、BSLの3つの施設で、生物学的安全キャビネットの表面を消毒します。次に、消毒剤を染み込ませたペーパータオルをフードの内側、ペーパータオルの隣の通気孔パネルから約6インチの位置に置きます。

接種ループ、ピペッター、チップ、適切な廃棄物処理容器、ニーファイ、TER、およびボルテックスを配置します。フードの準備ができたら、OADCと生理食塩水ビーズチューブを備えたMcFarland 0.5標準A 7 H nineブロスを備えたラックと一緒に、生物をペーパータオルの上に置きます。このセットアップは、中実から行われます。

患者の検体から固体培地培養物から接種物を調製します。滅菌ループを使用してコロニーをこすり落とし、生理食塩水トゥイーンガラスビーズチューブに移します。サスペンションを30〜60秒間ボルテックスします。

サンプルを目視検査し、McFarland標準と比較します。転送される金額は、標準以上である必要があります。そうでない場合は、細菌サンプルとボルテックスをさらに追加します。又。

マクファーランド基準が一致したら、接種物を15分間沈殿させて、より大きな細菌の塊が定着するのを待ちます。次に、nefi TERを使用して、懸濁した細菌の密度をゼロまで測定します。ニーファイター。

まず、空の生理食塩水ビーズトゥイーンチューブをニーファイにセットします。キャリブレーションボタンを押して装置をゼロにし、次にMcFarland 0.5スタンダードをニーファイにセットして、キャリブレーションボタンをもう一度押します。機器のキャリブレーションが完了したら、McFarland標準を取り外し、接種材料を挿入します。

接種物の測定値は、マクファーランドの標準的な測定値と等しくなければなりません。読み取り値が低すぎる場合は、チューブを取り外し、プレートからさらに細菌を移します。その後、ボルテックスしてサンプルを再度読み取ります。

読み取り値が高すぎる場合は、生理食塩水トゥイーンをチューブボルテックスに追加します。その後、サンプルをもう一度読みます。細菌の濃度がマクファーランドの基準と一致するまで、必要に応じて接種物の調整を続けます。

次に、200マイクロリットルのピペットと長いエアロゾル耐性ピペットチップを使用して、チューブの上部3分の1から100マイクロリットルの接種物を取り除きます。底部に沈降している塊を避けるために、ミドルブルックセブンHナインブロスは、接種ブロスを20秒間ゆっくりと渦巻き、接種物をプレート化しますメーカーのパッケージからマイクロタイタープレートを取り外すことから始まります。乾燥剤が青色の場合、またはホイルパッケージが損傷している場合は、使用しないでください。

プレートには、各ウェルで試験される12種類の抗菌薬がすでに含まれており、その中には最も効果的な第一選択薬や第二選択薬も含まれています。エアロゾルが発生しないように注意しながら、7 H nineブロス接種液を慎重にtrthに注ぎます。次に、ここに示すようにラベルを外側にしてマイクロ滴定プレートを置き、12チャンネルピペッターを使用して各ウェルに100マイクロリットルの接種材料を追加します。

次に、コロニーカウントを行うためのプレートを準備します。まず、ポジティブコントロールウェルから1マイクロリットルのサンプルループを1対1でラベル付けされた7つのH10プレートに移して、原液プレートを調製します。次に、ここに示すように、ループを使用してプレートに縞

次に、1〜50希釈を調製するために、ポジティブコントロールウェルから1マイクロリットルのループを移し、50マイクロリットルの水ストリークでチューブに渦巻く。この希釈液の1マイクロリットルをプレートに1〜50とラベル付けしました。tthから50マイクロリットルの接種物を、適切に標識された血液寒天培地と7枚のH 10プレートおよびストリークにピペッティングして、純度プレートに接種します。

次に、接種したtrthの上に別のtrthを積み重ね、それらを捨て容器にそっと置きます。マイクロタイタープレートに粘着シールを貼ります。次に、白い裏地を使用して、各ウェルをしっかりと押して適切な天井を確保し、しわがないことを確認します。

マイクロティッタープレートは、結核性殺虫剤を染み込ませたペーパータオルで拭いて消毒します。次に、マイクロタイタープレートをビニール袋に入れ、ヒートシールで閉じます。最後に、ニーファイ、ターボルテックス、プレート、チューブを含むすべての材料を結核性殺虫剤で拭いて消毒します。

ここでは、消毒を確実にするために十分な時間が経過した後、プロスプレーが使用されます。プレートはスコッチテープでテープで留められ、ビニール袋に入れられ、密封された供給品はバイオセーフティキャビネットから取り出され、パススルーに入れられます。

捨てられた赤い袋は、この時点でツイストタイで閉じられ、密封され、ガウン、ブーツ、手袋が取り除かれます。控え室に進んで手を洗った後、再び手を洗った後、人工呼吸器を取り外して消毒して保管し、新しいガウンを着てBSLスリースイートを出ます。次に、廃棄容器をオートクレーブ滅菌します。

これに続いて、マイクロタイタープレートと7つのH 10および血液オーガープレートを、5〜10%CO2の摂氏35〜37度のインキュベーターで右側を上にして、BSLの2つの実験室でインキュベートします。これは、プレートがしっかりと密封され、ビニール袋に入っており、結核菌の生成時間は約12〜24時間であるため、コントロールの底部に細胞ペレットが形成されると成長が見られるまでに少なくとも1週間かかるため、許容されます。さて、10日目に、密封されたSTマイクロティッターブレードをミラーボックスのプラットフォームに置いて、手動ミラー読み取りを実行します。

電気スタンドを使用して成長を視覚化し、必要に応じて調整して最高のコントラストを得ます。この場合、H11とH12の生育制御ウェルをミラーを見て確認します。成長がある場合、ここに示すように、井戸は曇っているように見えるか、堆積物があるように見えます。

この例に示すように成長がない場合、井戸は透明に見えます。この場合、プレートをインキュベーターに戻し、最大21日間インキュベートを続けます。各条件について、成長をコントロールと比較します。

それでは、各薬物レコードについて、成長がない最初の希釈液。これは、ビジョンなどの自動プレートリーダーを使用して結果を調べるための薬剤の最小阻害濃度またはMICであり、Myco TB a STプレートソフトウェアを開き、バーコードを外側に向けて密封されたプレートを所定の位置に記録することから始まります。ここに示すように、成長は濁りとして、またはコンピューター画面上のウェルの底に細胞の堆積物として表示されます。

まず、成長制御を調べます。以前と同じです。これが成長にマイナスの場合は、プレートを最大21日間インキュベーターに戻します。

これが陽性の場合は、各薬剤の画面上で成長を示さない最初のウェルに触れて結果を記録します。場合によっては、バクテリア、沈殿物、または薬物が井戸の底に沈殿します。トレーリングとして知られるこの現象は、同じサイズのペレットを持ついくつかの井戸によって示され、実際にはプラスの成長とは見なされません。

次に、7枚のH10プレートと血液寒天プレートを検査して、細菌濃度を決定し、純度を評価します。血液寒天プレートは、48時間後に成長を示さないはずです。血液寒天プレート上の成長は、急速に増殖する細菌による汚染を示しています。

成長がある場合は、マイクロタイターテストを繰り返す必要があります。7つのH 10純度プレートは、1つの生物の成長を持っている必要があります。EM型結核は、バフ、色、しわ、荒れているように見えるはずです 汚染されている場合、マイクロタイターテストは純粋な培養物から繰り返す必要があります。

細菌濃度を評価するには、7つのH 10プレート上のコロニーを数えます。次に、添付の文書の表を使用して、コロニー数を計算します。結核菌は、患者の検体から増殖し、抗生物質耐性を評価したところ、このビデオで説明されているように、ここに示されているプレートでは、12種類の薬剤が濃度を上げて存在し、上部が最高濃度、下部が最低濃度です。

薬物の最小阻害濃度(MIC)は、成長を示さなかった薬物の最低濃度で示され、ここに示されている画像では、臨床検査基準研究所によって確立された標準化されたブレークポイントを使用して丸で囲まれています。ここに示されているデータは、この結核株がイシドとリファンピンに耐性があることを示唆しています。In vitroでは、oin、moxifloxacin、streptomycin、およびrifabutinを含む他のいくつかの薬剤で見られる高いマイクは、これらの薬剤に対するEM結核株の耐性を示唆しています。

MICの結果は、結核の治療に経験のある感染症の専門家が個別の治療計画を立てるために使用する必要があります この技術を習得すると、1つの分離株を設定するのに約40分かかります。この手順を試行する際には、これが呼吸器病原体であり、エアロゾルを発生させると、このビデオを見た後、結核菌の設定方法、マイクロブロス希釈法を使用した抗菌薬感受性試験について十分に理解する必要があることを覚えておくことが重要です。結核菌の取り扱いは非常に危険であり、必要な場所では常に呼吸保護などの予防策を講じる必要があることを忘れないでください。