CRISPR-Cas9システムを用いたCAR-T細胞の遺伝子改変

T細胞の懸濁液から始めて、キメラ抗原受容体またはCARおよびCRISPRレンチウイルスの遺伝子を保有するCARレンチウイルスで処理します。

CRISPRレンチウイルスには、ガイドRNAとCas9ヌクレアーゼの遺伝子、および抗生物質耐性遺伝子が含まれています。

CAR レンチウイルスと CRISPR レンチウイルスはどちらも T 細胞と相互作用し、RNA を放出します。

これらのRNAは逆転写され、対応するDNAに変換され、T細胞DNAに組み込まれます。

これにより、CARタンパク質、ガイドRNA、Cas9タンパク質の合成が可能になります。

ガイドRNAはCas9と複合体を形成し、T細胞DNA上の標的遺伝子を特異的に認識して結合します。

一方、Cas9はDNAを切断し、二本鎖切断を作成します。

この切断は、エラーが発生しやすい修復メカニズムである非相同末端結合によって修復され、標的遺伝子修飾が起こります。

これにより、キメラ抗原受容体を持つ遺伝子組み換えT細胞が生成されます。

細胞を抗生物質で処理して、未改変のT細胞を排除し、遺伝子組み換えCAR T細胞を選択的に単離します。

顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子を破壊するには、原稿に記載されているように、ガイドRNAを利用します。トランスフェクション試薬を室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、70%から90%のコンフルエンシーに達した293T細胞にそれらを添加し、トランスフェクトした細胞を摂氏37度、5%CO₂で培養してレンチウイルスを作製します。

24時間と48時間で、ウイルス含有上清を収穫し、50ミリリットルの超遠心チューブで超遠心分離によって濃縮し、将来の使用のために摂氏マイナス80度で凍結します。次に、初日にT細胞を優しく再懸濁してロゼットを破壊します。

BSL-2 plus 承認された実験室で、CAR T 細胞を生成するには、刺激された T 細胞に CAR19 レンチウイルスと GM-CSF を標的とする CRISPR レンチウイルスを追加します。3日目と5日目に、形質導入に成功したピューロマイシン耐性を有するレンチCRISPR編集T細胞について、1ミリリットルあたり1マイクログラムのピューロマイシン濃度のピューロマイシン二塩酸塩で細胞を処理します。