Name: の形態素解析ショウジョウバエ幼虫末梢感覚ニューロンの樹状突起と軸索 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学ぶショウジョウバエ幼虫の末梢感覚ニューロン形態解析法。GFP標識遺伝モザイクと共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いて、樹状突起と軸索の詳細な構造を可視化し、神経発生における遺伝プログラムを解明する。

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著者らは、資金調達のために理研に感謝。我々はまた、遺伝的および免疫組織化学プロトコルに関する議論のためにCagri Yalgin、キャロラインDelandre、とジェイパリッシュに感謝。

試薬の1.Preparation <ol><li>のCa + + -フリーHL3.1生理食塩水28を準備する。 <ol><li> mMで：70のNaCl、5のKCl、20のMgCl 2、10飽和NaHCO 3、5 HEPES、115スクロース、および5トレハロース、pHは7.2。滅菌濾過し、4℃で保存します。 注：CA + + - free溶液は、解剖時の筋収縮を防ぎます。 </li></ol></li><li>ポリ- L -リジン（PLL）カバースリップを行います。 <ol><li> -20℃で4.2ミリリットルの水に100mgのPLLを溶解し、エッペンドルフチュー​​ブや凍結で300μlアリコートを作る</li><li>コーティングのカバースリップは、最初の雪解けアリコートを、のddH 2 Oで10ミリリットルにそれを起動してコダックフォト-フローの20μlのを追加する前に、最終的なPLL濃度は0.7 mg / mlのです。 </li><li> PLL溶液中で30分のための水没のカバースリップは、削除して乾燥させ、その後水と乾燥で簡単にすすいでください。二回繰り返します。治療をカバースリップ最後の約1ヶ月。 </li></ol></li></ol> 2。遺伝的交雑<ol><li> ToはMARCMのクローンを生成する。ここでパン- DAのドライバ11,27を使用して例のクロスは、次のとおりです。 FRT2A X hsFLP、Gal4の109（2）80、UAS - mCD8：：GFP、浴槽- Gal80 FRT2A/SM5-TM6B </li><li> FLPアウトのクローンを生成する 。ここにクラスIV固有のドライバ8を使用して例のクロスは、次のとおりです。 PPK - Gal4のX YW、hsFLP、UAS - FRT - CD2、Y +ワンストップFRT - mCD8：：GFP </li></ol> 3。胚のコレクション<ol><li> 25℃コレクションの瓶の中にショウジョウバエの交配を維持° Cと酵母ペースト30,31の薄い層でリンゴジュース寒天プレート29スプレッドに胚を収集する。 </li></ol> 4。胚の熱ショックの治療<ol><li>胚が敷設されている時にりんごジュースの寒天プレートに反対して空の皿を置きます。パラフィルム（図2）これらの二つのプレートの周囲に封をします。 </li><li>熱ショック時に、水没の目eの水浴中でプレートとは、金属の重量を使用して、それを押したままにします。 </li><li> MARCMの胚の<ol><li> 2Hのための胚を収集し、囲まれた10センチメートルペトリ皿で​​培養するには、追加の2時間25℃で組織を湿らせた。 注：熱ショックプロトコルを調整するには、クローンが生成される頻度を変更します。 </li><li>単一の孤立したニューロンを目指すクローンの数が少なく、、38で1時間、水浴で沈めると熱ショック℃での</li><li>クローンの数が多いほど、38〜45分の熱ショック° Cの場合は、追加の30分のためにもう一度、RT 30分で熱ショックを回復する。 </li></ol></li><li> 38で1HのためにFLPアウト24時間のための胚、および熱ショックを収集℃に</li></ol> 5。クローンのスクリーニング<ol><li>熱ショック後は、防水配置と場所湿らせたティッシュに囲まれた10cmのペトリ皿にリンゴジュース寒天プレートの蓋を取り外します。文化ワンダまでの胚および25℃で、その後の幼虫° CING第3齢幼虫。 注：特に培養条件、栄養は、DA樹状アーバ形態32,33を変更することが示されている。成長する幼虫は常に酵母ペーストへのアクセス権を持っていることを確認してください。必要に応じて貼り付け、酵母を監視し、補充する。 </li><li>プロトコルの以降で、この点から、ゆっくりと昆虫鉗子を使用して幼虫を操作。 </li><li>簡単に言うと、ゆっくりと水道水の幼虫をリンスし、寒天プレート上に置きます。 注：このステップは、バックグラウンド幼虫の表面上に食べ物や汚れから自家蛍光を減少させる。 </li><li>強力な蛍光解剖顕微鏡下で幼虫を調べます。体壁のGFP陽性ニューロン/細胞と幼虫を識別します。 </li></ol> （6）樹状突起のin vivoイメージング <ol><li> 80％グリセロールの小滴とうつ病のスライドグラスに幼虫を置きます。幼虫を固定するためにスライドにカバースリップを配置。空気が幼虫とcoversliの間に残っていないことを確認してください頁</li><li>静かに関心のニューロンの可視化を可能にする幼虫をロールバックするためにカバースリップを押してください。イメージmCD8：：共焦点顕微鏡を介してGFPで標識された樹状アーバー。 </li></ol> 7。幼虫の解剖 開始する前に注意してください：DAニューロンの樹状突起は、解剖の開始後に急激に低下する。良好な樹状突起の形態を確保するために以下の5分で、個々の幼虫を解剖。 <ol><li>次の変更で以前に34に記載のようにSylgard板の上に第3齢幼虫をさまよう解剖： <ol><li> DAニューロン軸索末端のイメージングのための、CNSが損なわれていないと分節神経が壊れていないことを確認してください。幼虫を開いた後、最初に慎重に体壁に気管の接続を切断してから、ゆっくりと全体の腸を取り除く。 </li><li>単独でのイメージング樹状突起の場合、平坦に取り付け可能にするためにCNSを取り除く。 </li></ol></li></ol> 8。 Fixat幼虫のフィレットのイオンとブロッキング<ol><li>それでもSylgardプレートに固定幼虫で、そっと回転シェーカー上で室温で20分のためにPBS中4％PFAで固定して下さい。 </li><li>固定した後、幼虫組織の痕跡を（脂肪体、気管など）を取り外します。 </li><li> Sylgardプレートとシェーカー上で3倍の10分（0.1％トリトンX - 100を含むPBS）をPBSTで洗浄する。軸索の末端を調べる場合、Sylgardのプレート上にフィレットを保持します。 （染色の樹状突起の場合には、このステップ34で、0.5 mlチューブに幼虫のフィレットを転送することが可能です） </li><li>シェーカーでPBSTで5％正常ロバ血清（NDS）で、室温で20分のための幼虫をブロックする。 </li></ol> 9。幼虫のフィレットの染色<ol><li>一次抗体のブロッキング溶液とインキュベートすることにより囲まれた小さなタッパーウェアの容器に° Cがティッシュを湿らせ一晩4（NDS / PBST 5％）を取り外します。 </li><li> 4℃からチューブを外し、室温でさらに1時間インキュベートする。 </li><li> PBSTで6倍の10分を洗ってください。二次antibを追加odyは、（5％でNDS / PBST）、およびカバーは、フルオロフォアの光退色34を防止する。 </li><li> 2時間室温でどちらインキュベート、または一晩4℃で、室温で一時間が続く。 </li><li> PBSTで幼虫6倍の10分を洗浄し、取り付けに進みます。 </li></ol> 10。樹状突起の検査のために幼虫のフィレットの取付け<ol><li>解剖ハサミや頭部（口のフックを含む）、および34（気門を含めて）後部を切断する外科用メスを用いて可能な限り平坦各幼虫のフィレットをマウントします。 </li><li>スライドダウンキューティクル側での幼虫のフィレットを配置し、80％グリセロールでマウントし、そして"速い"マウント34に対してマニキュアとカバーの両側をシール。 </li><li>永久的な取付けと鮮明な画像のための<ol><li> PLLのカバースリップ上でPBSのドロップに解剖幼虫のフィレット筋肉側を下に置く、それはすぐにカバースリップを遵守します。 </li><li> howeve、実装後できるだけ大量の液体を削除します。rはそれが完全に乾燥することはできません。 </li><li>エタノール系列を通してカバースリップを（添付の幼生フィレット付き）を取る：35％エタノール、50％、70％、95％、続いて、最後に10分間ごとに100％エタノールの2倍（2番目の100パーセントEtOH溶液を頻繁に変更する必要があります。 ）、最終的に、キシレンの2〜3倍に10分を洗浄する。 </li><li>洗浄したスライド上でDPX封入（Distyreneの可塑剤をキシレン ）のドロップを入れて、慎重に上にフィレットサイドダウンカバースリップを置く。暗所で保管し、イメージングの前に設定してDPXに1日待つ。 </li></ol></li></ol> 11。軸索末端の検査のために幼虫のフィレットの取付け<ol><li>分節性神経は解剖、固定時にそのままPNSとCNSとの間で実行されている、と末梢感覚神経の細胞体からVNCへの軸索のトレースを可能にするために染色してください。 </li><li>うつ病のスライドの80％グリセロール中でそれぞれの幼虫のフィレットキューティクル側を下にマウントします。 DAの細胞体から軸索へのトレース共焦点顕微鏡下でVNC。注：VNCの同族セグメントにそれぞれ体壁のセグメントのプロジェクトでPNSニューロン。 </li></ol> 12。代表的な結果： 代表的な結果は、図3-5に示します。図。図3は、共焦点顕微鏡下で生体内でキャプチャされたクラスIVダニューロン、全体のアーバーを示しています。図。 4は正しく形態を維持するために修正されている免疫組織化学的に標識されたクラスIIIのニューロンの樹状突起の部分のクローズアップを示しています。関連するはめ込みショー失敗解剖と固定（抗GFP抗体で染色の両方）の後に発生する可能性が低下。図。図5にCNS内の単一のクラスIV軸索の末端（抗GFP、緑色）、すべてのクラスIVの末端は、抗CD2（マゼンタ）と共染色される。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig1.jpg"> 1プロトコルの概要を示します 。 A）を収集し、熱ショック胚。 B） GFP陽性DAニューロンのクローンと幼虫を選択し、[画像のライブ幼虫で樹状突起をGFPで標識した。 c）の幼虫を摘出し、免疫組織化学的にフィレットを染色。 D）染色したフィレットをマウントし、イメージ樹あずまやDAニューロンのクローンの軸索投射を。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig2.jpg"> 熱ショック用リンゴジュース寒天プレートの2】図 。プレートを取る（白い矢印、AB）、（赤の矢印B）上に別​​のペトリ皿を追加し、パラフィルム（青矢印、B）の周りシール。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig3.jpg"> mCD8の樹状突起の in vivo画像で 図3：：第3齢幼虫のクラスIV（v'ada）ニューロンを示すGFP標識MARCMのクローン（2.1のように遺伝子型）。スケールバーは50μmのです。 d/3111/3111fig4.jpg"/&gt; 図4 mCD8：：成功郭清と固定（緑）の後に良好な形態を示す、抗GFP抗体で染色されたクラスIIIニューロン（ddaA）のGFP標識MARCMのクローン。失敗した解剖と固定（マゼンタ）の後に発生する挿入図の樹状突起の劣化（白矢印）。スケールバーは25μmのです。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig5.jpg"> 図5第3齢幼虫幼虫VNC。単一のクラスVI（VDAB）軸索の末端（2.2のような遺伝子型）のFLPアウトクローンを抗GFP抗体（緑）を使用して検出される。抗CD2は、すべてのクラスIV末端（マゼンタ）のラベルを付けます。スケールバーは25μmのです。

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<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Larval+NMJ+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
<li>Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+Drosophila+neuropile%3A+a+strategy+for+the+standardised+characterisation+of+genetically+amenable+neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites.</a> Dev Biol. 260, 207-225 (2003).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ショウジョウバエ幼虫のDAニューロンモデルは、制御のニューロンの形態と回路形成そのメカニズムを調べる一つの優れた遺伝システムを提供します。 MARCMは、一般的に標識のためにと体DAニューロンのクローンを生成するために使用されます。 MARCMのために私達はどちらか汎神経（例えば、Gal4の C155）またはDAニューロン固有のドライバを使用してください。汎神経ドライバを直接使用すると、株式公開センターから広く利用可能ないくつかの銘柄を使用することが可能です。しかし、DA -ニューロン固有のドライバを使用すると顕著なクローンはCNSで生成されないので、有利であることができる、そしてそのようなクローンはDA軸索末端の解析を困難にすることができます。一般的に使用されるDA固有のGal4の行のリストは、下野ら（2009）27で発見できます。 FLPアウトは、研究者が併用異所的に単一のラベルが付いたニューロンにGAL4 - UASのバイナリシステム35と測定の形態を用いて遺伝子を発現する際に特に有用である。加えてイメージングD...

<table border="1"><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> SZX16蛍光解剖顕微鏡（GFPHQフィルター付） </td><td>オリンポス</td><td> SZX16 </td><td></td></tr><tr><td>昆虫鉗子を生きる</td><td> FST </td><td> 26030〜10 </td><td></td></tr><tr><td> 26ミリメートルXの76ミリメートルうつ病のスライドガラス</td><td> Toshinriko（株） </td><td> T8 - R004 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184（またはSilpot 184） </td><td>ダウコーニング</td><td> 3097358-1004 </td><td></td></tr><tr><td>ポリ- L -リジン</td><td>シグマ</td><td> P - 1524 </td><td>この製品は、最も効果的であることが証明され</td></tr><tr><td> DPX封入剤</td><td>シグマ</td><td> 44581 </td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗GFP </td><td>インビトロジェン</td><td> - 11122 </td><td>希釈1:500 </td></tr><tr><td>ラット抗CD8 </td><td> Caltag </td><td> 5H10 </td><td>希釈1:200 </td></tr><tr><td>マウス抗CD2 </td><td> ABD serotec </td><td> MCA443R </td><td>希釈1:700 </td></tr><tr><td>マウス抗Fasciclin2 </td><td> DSHB </td><td> 1D4 </td><td>希釈午前1時10分</td></tr></table>

の形態素解析ショウジョウバエ</em遺伝モザイクを使用>幼虫末梢感覚ニューロンの樹状突起と軸索

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

神経系の発達には、正確なニューロンのクラス特有の樹状突起の発達と軸索の配線が続くニューロンの位置と同一の正確な仕様が必要です。最近ショウジョウバエの幼虫の末梢神経系（PNS）の樹状分枝（DA）の感覚ニューロンは、ニューロンの分化の両方の一般とクラス固有のメカニズムを解明するための強力な遺伝的モデルとなっている。 4つの主要なDAニューロンのクラス（I - IV）1があります。彼らは、増加する樹状突起の複雑さの順に名前が付けられ、それらの分化2-10の遺伝的制御のクラス固有の相違点を持っています。 1）それが2）、DAニューロン樹状突起が広がる、ショウジョウバエで利用できる強力な遺伝学的ツールを活用することができますので、DA感覚システムは、樹枝状形態の制御11から13の背後にある分子メカニズムを調べるために実用的なモデルです。光学的にCLEの下にだけ2次元のそれは容易にin vivoでの高分解能で可視化することAR幼虫のクチクラ、3）樹枝状形態におけるクラス固有の多様性は、単純な比較高度に分岐した樹枝状の木の形成を制御する重要な要素を見つけるために比較分析を容易に、そして4）樹状あずまや固定観念別のDAニューロンの形状は、形態学的統計分析を促進する。 DAニューロンの活動は、幼虫の運動中枢パターン発生器14から16の出力を変更します。別のDAニューロンのクラスは、異なる感覚モダリティを持っており、それらの活性化は、14,16-20異なる行動反応を誘発する。さらに別のクラスには、腹側神経索のショウジョウバエ幼虫の中枢神経系（VNC）21に型通りに軸索投射を送る。これらの予測は、樹状フィールド7,22の体壁のDAニューロンの感覚モダリティと位置の両方の地形表現で終了、23。 DA軸索突起のよって検査は、地形図7,22,23、だけでなく、簡単な回路を変調幼虫の運動14から17までの配線の基礎となるメカニズムを解明するために使用することができます。 ここではMARCM（抑制性細胞マーカーを持つモザイク解析）1,10,25とFLPアウト22,26,27技術（図1に要約）を介して24マーキングDAニューロンを生成し、遺伝的モザイクを分析する実用的なガイドを提示する。

の樹状分枝感覚ニューロン<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の末梢神経系は、一般とニューロンの分化のニューロンクラス特有のメカニズムの両方を解明するために有用なモデルです。我々は樹状突起分枝の神経細胞遺伝学的モザイクを生成して解析するための実用的なガイドを提示する。

神経系の発達には、ニューロンの位置とアイデンティティの正確な特定と、それに続くニューロンのクラス特異的な樹状突起の正確な...

本手順の全体的な目的は、ショウジョウバエ幼虫における樹状突起分枝ニューロンの詳細な形態を可視化することです。まず、胚を回収して成熟させ、熱ショック誘導によるflippase発現を用いてGFP標識された遺伝的クローンを生成します。次に、蛍光ニューロンクローンを持つ幼虫を選別し、その樹状突起のABA（arborization）を撮影します。溶岩（lava）のイメージング後、それらを解剖および固定し、免疫染色を行います。これにより、試料をマウントし、共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いて樹状突起の分布および軸索末端の形態を可視化することが可能になります。本日は、遺伝的モザイクを用いたsula下部末梢感覚OIDおよび軸索の形態解析プロトコルを実演します。この手法は、神経アイデンティティ、樹状突起の形状、および外部配線を制御する遺伝的プログラムとは何かという、神経発達分野における重要な問いに答える一助となります。まず、アップルジュースプレートに胚を回収することからこのプロトコルを開始します。ヒートショックは38 °Cの恒温水槽で行い、その時間は胚の遺伝子型および目的とするクローンのサイズによって異なります。本プロトコルでは、pand dendritic arborization neuron ドライバーを持つ胚からmarkumクローンを作製します。ヒートショックを行う前に、マーカー胚を湿らせたティッシュで囲み、25 °Cで2時間保持します。空のプレートとパラフィルムを用いて回収プレートを浸漬可能にし、ヒートショックの準備をします。次に、マーカー胚を1時間ヒートショックし、小型のクローンまたは単一ニューロンの標識を生成させます。クローン数を増やすには、バス内で45分間インキュベートし、続いて室温で30分間、さらにバス内で30分間インキュベートする延長ヒートショックを行います。フリップアウトクローンを生成するために、24時間連続で胚を回収します。本プロトコルでは、クラス4特異的ドライバーを使用します。フリップアウト胚に1時間のヒートショックを行い、その後ヒートショック後の処理を行います。回収プレートを10 cmのペトリ皿に入れ、湿らせた組織と培地で囲みます。胚培養中は胚を25 °Cに保ち、必要に応じて酵母ペーストを補充してください。栄養状態は神経発達に決定的な影響を与えるためです。3齢幼虫が収集できるまで培養を維持し、3齢幼虫を水道水で軽く、優しくすすいでからアガープレートに transferred します。次に、高倍率の蛍光解剖顕微鏡と昆虫用ピンセットを用いて幼虫を観察します。体壁にGFP陽性ニューロンを持つ幼虫を特定し、80% glycerol を1滴垂らした凹面スライドグラスに transferred します。カバーガラスをスライドの上に載せて、幼虫を固定します。幼虫とカバーガラスの間に気泡が残らないようにしてください。標準的な共焦点顕微鏡を用いて、幼虫の角質層を通して目的のニューロンを可視化します。観察角度を改善するために溶岩の位置を変更するには、カバーガラスをそっと押し、溶岩を転がします。まず、昆虫ピンセットを用いて溶岩をSILガードプレートに移動させることから本プロトコルを開始します。次に、前端と後端をピンで固定します。次に、カルシウムフリーHL 3.1バッファーを加えます。次に、前後軸に対して垂直に、larvaの両端を半分まで切断します。その後、2本の気管の間の正中線に沿って切断します。腸を慎重に取り除く前に、体壁への各気管接続部を注意深く切断します。これにより、PNSとCNSの間を走行する分節神経を無傷に保つことができます。幼虫をセルガードプレートにピンで固定したまま、PBSで調製した4% Para formaldehyde中で、緩やかに回転するシェーカーを用い、室温で20分間固定します。各解剖操作は5分以内に完了させてください。そうしないと、樹状突起認証ニューロンの神経突起が分解し始めます。固定後、余分な幼生組織を取り除きます。その後、フィレットをPBSTで10分間ずつ3回洗浄します。洗浄後、幼虫をブロッキング液中で室温にて20分間、緩やかに振盪しながらインキュベートします。ブロッキングが完了したら、ブロッキング液を一次抗体溶液に交換します。サンプルを湿らせたティッシュで囲った小さなプラスチック容器に入れ、4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、室温でさらに1時間インキュベートを継続します。次に、ラバのフィレをPBSTで10分間ずつ6回洗浄します。続いて二次抗体を加え、蛍光色素の光退色を防ぐため、フィレを遮光容器に入れます。室温で数時間、または4°Cで一晩インキュベートし、その後室温で1時間おきます。最後に、フィレをPBSTで10分間×6回洗浄します。これで組織をマウントする準備が整いました。軸索末端を可視化するには、幼虫のフィレのキューティクル側を下にして、ディプレッションスライド上の80% glycerolにマウントしてください。樹状突起のより鮮明な画像を得るには、PLLコートカバーガラスを用いて永久標本を作成します。カバーガラスをコーティングするため、PLLを分注します。これを2回蒸留水で10 millilitersまで希釈し、Kodak photo flowを20 microliters加えます。カバーガラスをPLL溶液に30分間浸し、取り出した後、自然乾燥させます。次に、水で軽くすすいで空気にさらし、再び乾燥させます。この工程を2回繰り返します。PLL浴から始めて処理したカバーガラスの有効期間は約1ヶ月です。次に、解剖した幼虫のフィレを、PLL処理したカバーガラス上のPBSの一滴に筋肉側を下にして載せます。ティッシュペーパーを用いることで、フィレットはすぐにカバーガラスに密着します。可能な限り液体を取り除きますが、完全に乾燥させないように注意してください。次に、35% ethanolから始まり、続いて50%、70%、95%、100%、そして最後に2回目の100% ethanolまでの、10分間ずつの連続的なエタノール浴により、幼生フィレットを脱水させます。エタノール浴の後、キシレンで10分間の浴を2〜3回行います。次に、清潔なスライドガラスにDPXを1滴落とし、カバーガラスを注意深くDPXの上に載せ、裏返した状態で満たします。スライドガラスを暗所に保管し、DPXが固まるまで1日待ちます。in vivoおよび焦点顕微鏡を用いた組織のイメージングを行う前に、このような画像を撮影することが可能です。これは、クラス4の樹状突起分枝ニューロンの全樹状突起です。また、こちらは形態を保存するために適切に固定された、IHCラベル済みクラス3ニューロンの樹状突起の拡大図です。挿入図は、解剖および固定が不十分だった場合に起こり得る分解を示しています。このオーバーレイは、CNSにおける単一のクラス4軸索末端を示しています。軸索は抗GFP抗体で緑色に、すべてのクラス4末端は抗CD2抗体でマゼンタ色に共染色されています。この手順を行う際は、末梢から中枢神経系（CNS）に向かって軸索を追跡し、迅速にサンプルの解剖と固定を行うことが重要です。各個体の末梢神経系（PNS）ニューロンは、腹側神経索（vent nerve cord）の認知セグメントに向かって分節的に投射していることを念頭に置いておくと有用です。また、樹状突起のみを可視化したい場合は、解剖時にCNSを除去し、染色の工程をプレート上ではなくチューブ内で行うことができます。樹状突起のイメージングのためにこれらのフィレをマウントする場合、まずマウスフックで頭部を、スパークルで後部を切除してください。快楽的な調製のために。

morphological-analysis-drosophila-larval-peripheral-sensory-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は段階的な準備をする手順を説明...

ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚

出典:Ting, C., et al., Analyzing Dendritic morphology in Columns and Layers.J. Vis.

ショウジョウバエの髄質層と柱にまたがる樹状突起形態の解析

我々は、中枢神経系における単一ニューロンを標識するための技術（CNS）の提示...

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

ショウジョウバエの幼虫の樹状樹枝状（DA）ニューロンを用いて、神経細胞の形態形成の研究は、免疫蛍光によって、神経や表皮タンパク質のその場可視化で恩恵を受ける。私たちは、幼虫の体壁から筋肉組織を除去することにより、ダニューロンと周囲の表皮細胞の免疫蛍光分析を向上させる手順を説明します。...

の除去<em&gt;ショウジョウバエ</em感覚ニューロンおよび表皮細胞の免疫蛍光分析のための幼虫の切り身から&gt;筋肉組織

二つの画像解析アルゴリズム、「 ショウジョウバエ NMJ形態計測」および「 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測を」自動的ショウジョウバエ神経筋接合部（NMJ）の9つの形態学的特徴を定量化するために、 作成されました 。...

高スループットとのマルチパラメトリック定量化のための2個のアルゴリズム<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;神経筋接合部形態

この研究は、後期第16段階ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学法を詳述している。 FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、神経発達中にモーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供する。...

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。...

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

このプロトコルは当てて神経細胞樹状パターン形成の複雑さ (NDAC)...

ショウジョウバエのニューロン樹状分枝複雑さの定量解析

ここで固定、取付け、イメージング、およびイメージ作成後の手順でショウジョウバエの大人の足に蛍光タンパク質を持つ軸索ターゲットを視覚化するプロトコルについて述べる。...

大人のキューティクルをショウジョウバエ脚運動ニューロン軸索を可視化します。

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレース方法について説明する。...

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

ここでは、ショウジョウバエメラノガスターで3つの単純な傷害誘発軸索変性(軸索死)アッセイを行い、切断された軸索とそのシナプスの形態学的および機能的保存を評価するプロトコルを提供する。...

ショウジョウバエメラノガスターにおける軸索死における軸索とそのシナプスの形態学的および機能的評価

学ぶショウジョウバエ幼虫の末梢感覚ニューロン形態解析法。GFP標識遺伝モザイクと共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いて、樹状突起と軸索の詳細な構造を可視化し、神経発生における遺伝プログラムを解明する。

の形態素解析ショウジョウバエ幼虫末梢感覚ニューロンの樹状突起と軸索

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