の形態素解析ショウジョウバエ幼虫末梢感覚ニューロンの樹状突起と軸索

本手順の全体的な目的は、ショウジョウバエ幼虫における樹状突起分枝ニューロンの詳細な形態を可視化することです。まず、胚を回収して成熟させ、熱ショック誘導によるflippase発現を用いてGFP標識された遺伝的クローンを生成します。次に、蛍光ニューロンクローンを持つ幼虫を選別し、その樹状突起のABA（arborization）を撮影します。

溶岩（lava）のイメージング後、それらを解剖および固定し、免疫染色を行います。これにより、試料をマウントし、共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いて樹状突起の分布および軸索末端の形態を可視化することが可能になります。本日は、遺伝的モザイクを用いたsula下部末梢感覚OIDおよび軸索の形態解析プロトコルを実演します。この手法は、神経アイデンティティ、樹状突起の形状、および外部配線を制御する遺伝的プログラムとは何かという、神経発達分野における重要な問いに答える一助となります。

まず、アップルジュースプレートに胚を回収することからこのプロトコルを開始します。ヒートショックは38 °Cの恒温水槽で行い、その時間は胚の遺伝子型および目的とするクローンのサイズによって異なります。本プロトコルでは、pand dendritic arborization neuron ドライバーを持つ胚からmarkumクローンを作製します。ヒートショックを行う前に、マーカー胚を湿らせたティッシュで囲み、25 °Cで2時間保持します。

空のプレートとパラフィルムを用いて回収プレートを浸漬可能にし、ヒートショックの準備をします。次に、マーカー胚を1時間ヒートショックし、小型のクローンまたは単一ニューロンの標識を生成させます。クローン数を増やすには、バス内で45分間インキュベートし、続いて室温で30分間、さらにバス内で30分間インキュベートする延長ヒートショックを行います。

フリップアウトクローンを生成するために、24時間連続で胚を回収します。本プロトコルでは、クラス4特異的ドライバーを使用します。フリップアウト胚に1時間のヒートショックを行い、その後ヒートショック後の処理を行います。

回収プレートを10 cmのペトリ皿に入れ、湿らせた組織と培地で囲みます。胚培養中は胚を25 °Cに保ち、必要に応じて酵母ペーストを補充してください。栄養状態は神経発達に決定的な影響を与えるためです。

3齢幼虫が収集できるまで培養を維持し、3齢幼虫を水道水で軽く、優しくすすいでからアガープレートに transferred します。次に、高倍率の蛍光解剖顕微鏡と昆虫用ピンセットを用いて幼虫を観察します。体壁にGFP陽性ニューロンを持つ幼虫を特定し、80% glycerol を1滴垂らした凹面スライドグラスに transferred します。

カバーガラスをスライドの上に載せて、幼虫を固定します。幼虫とカバーガラスの間に気泡が残らないようにしてください。標準的な共焦点顕微鏡を用いて、幼虫の角質層を通して目的のニューロンを可視化します。

観察角度を改善するために溶岩の位置を変更するには、カバーガラスをそっと押し、溶岩を転がします。まず、昆虫ピンセットを用いて溶岩をSILガードプレートに移動させることから本プロトコルを開始します。次に、前端と後端をピンで固定します。

次に、カルシウムフリーHL 3.1バッファーを加えます。次に、前後軸に対して垂直に、larvaの両端を半分まで切断します。その後、2本の気管の間の正中線に沿って切断します。

腸を慎重に取り除く前に、体壁への各気管接続部を注意深く切断します。これにより、PNSとCNSの間を走行する分節神経を無傷に保つことができます。幼虫をセルガードプレートにピンで固定したまま、PBSで調製した4% Para formaldehyde中で、緩やかに回転するシェーカーを用い、室温で20分間固定します。各解剖操作は5分以内に完了させてください。

そうしないと、樹状突起認証ニューロンの神経突起が分解し始めます。固定後、余分な幼生組織を取り除きます。その後、フィレットをPBSTで10分間ずつ3回洗浄します。

洗浄後、幼虫をブロッキング液中で室温にて20分間、緩やかに振盪しながらインキュベートします。ブロッキングが完了したら、ブロッキング液を一次抗体溶液に交換します。サンプルを湿らせたティッシュで囲った小さなプラスチック容器に入れ、4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、室温でさらに1時間インキュベートを継続します。

次に、ラバのフィレをPBSTで10分間ずつ6回洗浄します。続いて二次抗体を加え、蛍光色素の光退色を防ぐため、フィレを遮光容器に入れます。室温で数時間、または4°Cで一晩インキュベートし、その後室温で1時間おきます。

最後に、フィレをPBSTで10分間×6回洗浄します。これで組織をマウントする準備が整いました。軸索末端を可視化するには、幼虫のフィレのキューティクル側を下にして、ディプレッションスライド上の80% glycerolにマウントしてください。

樹状突起のより鮮明な画像を得るには、PLLコートカバーガラスを用いて永久標本を作成します。カバーガラスをコーティングするため、PLLを分注します。これを2回蒸留水で10 millilitersまで希釈し、Kodak photo flowを20 microliters加えます。

カバーガラスをPLL溶液に30分間浸し、取り出した後、自然乾燥させます。次に、水で軽くすすいで空気にさらし、再び乾燥させます。

この工程を2回繰り返します。PLL浴から始めて処理したカバーガラスの有効期間は約1ヶ月です。次に、解剖した幼虫のフィレを、PLL処理したカバーガラス上のPBSの一滴に筋肉側を下にして載せます。

ティッシュペーパーを用いることで、フィレットはすぐにカバーガラスに密着します。可能な限り液体を取り除きますが、完全に乾燥させないように注意してください。次に、35% ethanolから始まり、続いて50%、70%、95%、100%、そして最後に2回目の100% ethanolまでの、10分間ずつの連続的なエタノール浴により、幼生フィレットを脱水させます。

エタノール浴の後、キシレンで10分間の浴を2〜3回行います。次に、清潔なスライドガラスにDPXを1滴落とし、カバーガラスを注意深くDPXの上に載せ、裏返した状態で満たします。スライドガラスを暗所に保管し、DPXが固まるまで1日待ちます。

in vivoおよび焦点顕微鏡を用いた組織のイメージングを行う前に、このような画像を撮影することが可能です。これは、クラス4の樹状突起分枝ニューロンの全樹状突起です。また、こちらは形態を保存するために適切に固定された、IHCラベル済みクラス3ニューロンの樹状突起の拡大図です。

挿入図は、解剖および固定が不十分だった場合に起こり得る分解を示しています。このオーバーレイは、CNSにおける単一のクラス4軸索末端を示しています。軸索は抗GFP抗体で緑色に、すべてのクラス4末端は抗CD2抗体でマゼンタ色に共染色されています。

この手順を行う際は、末梢から中枢神経系（CNS）に向かって軸索を追跡し、迅速にサンプルの解剖と固定を行うことが重要です。各個体の末梢神経系（PNS）ニューロンは、腹側神経索（vent nerve cord）の認知セグメントに向かって分節的に投射していることを念頭に置いておくと有用です。また、樹状突起のみを可視化したい場合は、解剖時にCNSを除去し、染色の工程をプレート上ではなくチューブ内で行うことができます。

樹状突起のイメージングのためにこれらのフィレをマウントする場合、まずマウスフックで頭部を、スパークルで後部を切除してください。快楽的な調製のために。