Name: 正常体温心停止と心肺蘇生法：虚血再灌流障害のマウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶ正常体温心停止と心肺蘇生法によるマウス虚血再灌流モデル。BUNや血清クレアチニン、組織学的解析で急性腎障害を評価し、治療介入の効果を検証する方法です。

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説明するすべての手順を研究し、すべての動物のプロトコルにおける動物の管理と使用のための健康ガイドラインの国立研究所に準拠して実施されていますがオレゴン健康科学大学動物実験用の委員会によって承認された。 1。外科的準備<ol><li>マウスの重量を量る。説明する手順は、gの20〜25重量C57BL / 6マウスで実行されます麻酔は、イソフルラン3から4パーセントを使用してインダクションボックスに誘導し、その後、空気/酸素混合物中のイソフルラン1.5から2.5パーセントを使用して維持されます。 </li><li>目に潤滑剤を塗布し、加熱パッド上に動物の仰臥位に配置します。テープを使用して4四肢を固定化する。後肢足が中立位置で録音されることがあります、しかし、前肢は胸骨圧迫の間に完全な胸壁の遠足を可能にするために、できるだけ胸壁に近いとして保護する必要があります。 </li><li>直腸温度プローブを注油して置きます。温度は37.0を維持するために設定されている電子温度調節器（Digi - Keyはセンス、コールパーマー、バーノンヒルズIL）、℃に接続された加熱パッドとランプを使用して制御されます。それは動物内の温度勾配は、非流動状態の間に開発できる可能性があるため、それは温度を測定し、関心の器官の近くに制御することが重要です。 </li><li> 2.5センチメートル22 GAテフロンカテーテル（Insyte - W、BD、フランクリンNJ）と直角イントロ（IN Frova紹介者、クックメディカル、ブルーミントン）のカット先端を使用して気管を挿管する。気管挿管の他の方法が許容される、しかし、斜めイントロデューサーの使用は、静脈​​カテーテルの挿入のための外科的露出を最適化する少し延長位置、の首の適切な位置決めが可能。気管内カテーテルのハブは、切歯に縫合糸のループで固定し、胸部圧迫の間に頭部を固定するためにわずかな張力で保持されます。 </li><li>機械的に140μL、150回/分に設定されて齧歯類の人工呼吸器とマウスを換気する。このプロトコルは常に20〜25グラムの動物で行われるため、これは重量の調整はされません。麻酔を過剰深めるしないでください。この損なう蘇生などのエンド呼気圧力を適用するために人工呼吸器を設定しないでください。 </li><li>無菌操作や手術用顕微鏡を使用して、頸静脈に事前にフラッシュされるPE - 10カテーテルを配置。どちらの側も使用できますが、オペレータに最も近い側の使用は、胸骨圧迫や他の操作中にカテーテルdislodgementの可能性が減少することができます。 0.5％bupivicaine、0.1 mLのは、術後疼痛を制御するために、創傷の端にinfitratedています。 </li><li>シアノアクリレート系外科用接着剤で皮膚の閉鎖にPE - 10カテーテルを固定します。 </li><li>皮下心電図の電極を配置し、監視装置に接続します。信号自体の信号経路と最大化に細心の注意を払うことが蘇生の成功に不可欠です。すべてのワイヤーが動作して表面に固定されていることを確認し、信号の交差を最小限に抑え、信号経路内に絶縁体を（中空針または撚り線で空気のような）最小限に抑えることができます。 nonstrandedリード線に接続されている固体針を購入または実験室で行うことができる。接続が完了すると、モニター上にEKG信号を最適化する。 </li></ol> 2。心停止<ol><li> 37.5℃ - 直腸温36.5 ° Cとして定義され、マウスが正常体温になっていることを確認静脈内、室温0.5 M塩化カリウムの40μLを管理し、心電図上のトレース等電点電気泳動を観察。体重の用量調整はレンジ内で20から25 gの必要はありません。逮捕のタイマーを開始します。 </li><li>人工呼吸器を外します。麻酔蒸気を中止してください。加熱パッドと心電図のモニタリングを妨げる可能性のある電子的なノイズを生成する任意の他の機器の電源を切ります。マウスオーバー絶縁毛布を置きます。 </li><li>毎分は、心停止時の温度を記録します。必要に応じて、加熱ランプは、正常体温の範囲にコアの温度を起動するために使用されることがあります。心停止時には、蘇生のために物資や機器（例えば、エピネフリンの注射器）を準備する。チェックリストは、生存に必須である途切れない蘇生を、確保するために役立ちます。 </li><li> 7分、心停止の30秒後に、人工呼吸器を再接続し、事前に逮捕の設定で一回換気量を維持し、180回/分に速度を増加させる。 </li><li> 8分で、300 BPMで胸骨圧迫を開始する。心電図上のモーションアーチファクトは、裁判官CPR率に使用することができます。胸骨圧迫は、人差し指と正中線の左に剣状突起とわずかに上に5 mmを納入してください。胸は、前後の距離の1/3-1/2を圧縮する必要があり、完全なリコイルは胸骨圧迫の間で許可されている必要があります。指の位置と最適な圧縮圧力は絶対に重要です。このモデルの生存率を達成するために失敗は、ほとんど常に次善のCPRによるものです。 </li><li> CPRの最初の30秒で、15μg/ mLのに希釈エピネフリンの0.5 mLを、煎じる。合計エピネフリンの投与量は8-12μgのです。慎重に自発的な循環（ROSC）のリターンのために心電図を観察。狭い複雑なQRS群は、圧縮アーチファクトとの間で見られている。 ROSCは通常、CPRを開始した後90秒と2分の間で発生します。 ROSCは3分で発生しない場合蘇生は放棄されます。頻繁に心室性期外収縮とEKG軸の変化は、ROSC後の最初の2分で観察され、ほとんどの場合2分で安定した洞性頻脈に解決されています。 </li><li>蘇生とエピネフリンの投与量の合計時間を記録します。毎分の心拍再開後の10分間温度を記録します。 </li><li> EKGのリードは通常、ROSC後の12〜15分以内に、自発呼吸の開始時に削除することができます。 </li><li>自発呼吸数が&gt; 60/minである気管を抜管する。 </li><li>食べ物と水への容易なアクセスを確保する、℃で最初の2時間の処置後、37に設定されて温度制御された表面上回復ケージにマウスを置きます。マウスが完全に麻酔から回復し、アクティブになっているときにケージは、標準的な術後の住宅の条件に移動させることができる。 </li></ol> 3。瀉血/灌流-固定と腎臓の収穫<ol><li> CA / CPR後24時間は、イソフルラン3から4パーセントで麻酔を誘導し、ホルマリンでの使用に適しているヒュームフード内の外科表面上に仰臥位での動物を確保する.. </li><li>徐々に5％に麻酔薬の蒸気濃度を増加させることにより麻酔を深め、自発呼吸の停止によって証明されるようにマウスが深く麻酔であることを確認してください。 </li><li>クラムシェルの開胸を行い、標準的な技術に応じて心臓の左心室の心尖部穿刺によりマウスを放血させる。 </li><li>同じ針を介して、ゆっくりと注入して0.9％生理食塩水を投与する。ニックネームはさみで右心耳、灌流/瀉血をacclerateする。開腹を行い、腎臓を観察。彼らはブランチングされている場合、生理食塩水は固定用ホルマリン4％に変更される場合があります。腎臓は、尿細管上皮壊死の定量化のためのフッ素ヒスイのBとパラフィンとステンドグラスに埋め込まれています。 </li></ol> 4。代表的な結果： CAが誘導されると、動脈圧（MAP）とゼロに近いの地域の腎血流量（RRBCF）ドロップを意味し、蘇生を開始するまで（ 図1）安定している。 CA / CPR後24時間、腎機能の血清指標（血中尿素窒素、BUNおよびクレアチニン）が有意に偽手術動物と比較して上昇している。 AST / ALTは、深遠な全身の虚血（ 図2）の証拠を提供し、また上昇です。好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）、腎血性傷害の感度の高い指標は、CA / CPR（ 図3）の後に大規模な上方制御24時間です。最後に、顕微鏡写真は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色（ 図4、パネルA）とフッ素ヒスイのBで染色した髄質尿細管上皮の広範な細胞死に充填尿細管上皮および管腔の菲薄化と虚血性腎傷害の典型的な斑状、髄質壊死を示す（ 図4、パネルB）。 <img src="/files/ftp_upload/3116/3116fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1心停止は心停止の期間を通じて、地域腎皮質血流量のほぼ完全な停止（RRCBF）で、その結果大腿動脈で測定された動脈圧（MAP）は、（影付きの平均としてここに示して、灌流圧のインスタント損失を誘発する面積）。胸骨圧迫とエピネフリンを返しますMAP正常にし、RRCBFと蘇生は着実にポスト蘇生期間に上昇する。14から許可を得て転載 。 <img src="/files/ftp_upload/3116/3116fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2 24時間処置後、血中尿素窒素（BUN）、血清クレアチニン、および尿細管細胞死の程度は、すべてのような偽の手順で処理した動物と比較してCA / CPRを受けた有する動物で有意に上昇です。偽処置動物と比較して、CA / CPRは、ここでCA / CPRマウスに肝機能酵素の大規模な上昇（ALT）アラニンアミノトランスフェラーゼとアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）によって証明される汎organismal虚血性傷害を、引き起こす。 <img src="/files/ftp_upload/3116/3116fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。ウエスタンブロットでは、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）、腎血性傷害の敏感な指標にポリクローナル抗体を使用して実行。尿サンプルは、（上記のA、B、C、およびDというラベルが付いています）すぐに前に（"プレ"）と4匹のCA / CPR（"24"）の後に24時間を得られた。 NGALは、大規模マウスにおいてアップレギュレートされCA / CPR後の尿は14から許可を得て転載 。 <img src="/files/ftp_upload/3116/3116fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。）ヘマ ​​トキシリンとエオシンでは、CA / CPR後の腎組織の24の短軸の肺門部の汚れ。管状プラグと延髄とcorticomedullary細管への斑状が明確なダメージがあります。矢印はcorticomedullary接合部の腫れ、濃縮した核と、破損した細管を指す。 B）Flouro -ヒスイBは、CA / CPRの後に、同じ動物で同じ地域の24を染色。フッ素ヒスイBの染色壊死細胞明るい緑、斑状corticomedullary尿細管壊死を示す。矢印はcorticomedullary接合部で明るくステンド損傷した細管を指す。これらの知見は、アキを開発し、AKIの他の動物モデルで生成されるものとは違って、人間から腎生検所見と実質的に類似しています。

<ol><li>Chertow, G. M., Lazarus, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+mortality+and+the+provision+of+dialysis+in+patients+with+acute+tubular+necrosis.+the+auriculin+anaritide+acute+renal+failure+study+group%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Predictors of mortality and the provision of dialysis in patients with acute tubular necrosis. the auriculin anaritide acute renal failure study group.</a> J Am Soc Nephrol. 9, 692-698 (1998).</li>
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<li>Hutchens, M. P., Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+epoxide+hydrolase+gene+deletion+reduces+survival+after+cardiac+arrest+and+cardiopulmonary+resuscitation%5BTitle%5D)+AND+%22Resuscitation%22%5BJournal%5D)">Soluble epoxide hydrolase gene deletion reduces survival after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation.</a> Resuscitation. 76, 89-94 (2007).</li>
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<li>Aufderheide, T. P., Lurie, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+by+hyperventilation%3A+A+common+and+life-threatening+problem+during+cardiopulmonary+resuscitation%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Death by hyperventilation: A common and life-threatening problem during cardiopulmonary resuscitation.</a> Crit Care Med. 32, 345-351 (2004).</li>
<li>Aufderheide, T. P., Sigurdsson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperventilation-induced+hypotension+during+cardiopulmonary+resuscitation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Hyperventilation-induced hypotension during cardiopulmonary resuscitation.</a> Circulation. 109, 1960-1965 (2004).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

マウスでの心停止と心肺蘇生の正常体温モデルはAKI、全身の血流の低下の最も一般的な臨床的な原因の病態生理および形態を複製するモデルでの評価の複数の手段を提供します。仮説検定は、遺伝子操作技術と実験用マウスのよく理解され特徴づけ解剖学や生理学の盛装へのアクセスによって促進されることがあります。 ここで説明したように、経験豊富な手の中に生存率は80％です。手術の準備と後の逮捕のケアは簡単ですが、逮捕されたマウスの実際の蘇生は、かなりの練習を必要とする困難な外科的スキルです。我々の経験では、成功した蘇生は経験の浅い外科医による個々の動物を蘇生の最初の30から50までの試みについての後に標準となり、そして一貫性のある傷害と蘇生はさらに練習を取る。特に、テクニックを学習の初期の段階（すなわち、最初の20の動物用）の間に、意味のある生存はまれであり、そして生存者は、不必要な苦痛を防ぐために、蘇生直後に安楽死されるべきである。初期研修の後、生存者が蘇生に続く分の活発な心臓の回復を示すとき、それは15分後のROSCのマークによって動物を存続し続けることが適当である。その時点で活発な自発呼吸努力を示...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>アボットメディカル</td><td> 06653〜5 </td></tr><tr><td>イソフルレン</td><td>アボットメディカル</td><td> 05260〜05（およびその他） </td></tr><tr><td>エピネフリン塩酸</td><td>複数の</td><td>複数の</td></tr><tr><td> Digi - Keyはセンスの温度コントローラ</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> EW - 89000〜00 </td></tr><tr><td> Angiocath IVキャス</td><td> VWR </td><td> 381134 </td></tr><tr><td> Frova角度気道イントロデューサー</td><td>クック</td><td> G27282 </td></tr><tr><td>マウス用MicroVentベンチレータ</td><td>ハーバード装置</td><td> 733591 </td></tr></tbody></table>

正常体温心停止と心肺蘇生法：虚血再灌流障害のマウスモデル

Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury

急性腎障害（AKI）は、高い死亡率1-4および最も頻繁に全身の血流の低下によって引き起こされている重大な病気の一般的な、非常に致死、合併症です。齧歯類モデルにおける全身の血流低下の5,6成功再現は、 7-9,9,10局所的虚血を用いるモデルを繰り返し臨床設定に変換されない結果を実証した、と遺伝子操作の完全なツールセットに全身の血流低下の欠如のアクセスを可能にする大規模な動物モデルを困難に満ちている事を。持っていますマウスで可能。11,12しかし、近年では心停止と心肺蘇生のマウスモデルは、モデルAKIに適応することができる浮上している。13はこのモデルは、臨床AKIに見られるように、生理的機能、解剖学的、および組織学的成果を確実に再現、急速に反復可能であり、そして遺伝子操作的手法、大動物への低コストの相対的な、そして使いやすさへのアクセスを含むマウス外科モデルの大きな利点のすべてを、提供しています。当社グループは、AKIの臓器特異的な結果の数を評価するために、このモデルの使用と豊富な経験を積んできました。14,15

周術期およびクリティカルケア関連の急性腎障害のための強力なモデルが提示される。それはほとんど臨床AKIの組織学的および機能的な変更を複製することが可能である心停止により誘発される全身の血流低下を使用する。

急性腎障害（AKI）は、重症疾患において一般的かつ極めて致死率の高い合併症であり、死亡率が高く1-4、その主な原因は...

この手順の全体的な目的は、正常体温下での全心虚血再灌流をモデル化し、この重要かつ一般的な疾患状態に対する介入の効果を評価することです。まず、心停止および蘇生（ca CPR）を行うため、麻酔を施し処置を施したマウスを準備します。次に、心停止を誘発します。その後、胸骨圧迫とエピネフリンを用いて、心停止状態のマウスを蘇生させます。最終的に、血中尿素窒素、血清クレアチニン、アラニンアミノ基転移酵素（ALT）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（AST）などの機能的アッセイ、および組織学的検査を行い、重大な臓器損傷を評価することができます。また、好中球ゼラチン結合リポカリンなどの早期バイオマーカーの存在を測定することも可能です。最後に、蘇生の結果を評価します。ここでは24時間後の経心的な灌流および腎臓の採取として示します。心停止および心肺蘇生の大型動物モデルなどの他の手法と比較して、このモデルの主な利点は、実験用マウスが低コストで普及しており、多くのトランスジェニック系統が利用可能であることです。まず、麻酔下にあるマウスの眼を潤滑剤で保護し、動物を加熱パッドの上に背臥位で配置します。次に、テープを用いて動物の四肢を固定します。後肢は中立位に配置し、前肢は胸壁の可動性を十分に確保して胸骨圧迫が行えるよう、可能な限り胸壁に近づけて固定してください。続いて、直腸温度プローブを潤滑剤を用いて挿入します。22ゲージのテフロンカテーテルと角度付き導入器を用いて、気管に挿管します。チューブの気管内留置の確認は、陽圧または陰圧のいずれを用いて行うことができます。陽圧を用いる場合は、少量の空気をチューブ内に注入します。チューブが食道ではなく気管内に留置されていれば、陰圧を用いた場合に胸部が対称的に挙上します。少量の液体を透明なチューブに入れ、それを気管内チューブに接続します。マウスの自発的な呼吸努力により、チューブ内の液体が移動します。気管内カテーテルをワイヤーのループで切歯に固定し、切歯にわずかな張力をかけることで、胸骨圧迫中に頭部が固定されるようにします。マウスを、140 µL、150回/分の設定のげっ歯類用人工呼吸器で機械換気させます。滅菌操作を行い、手術顕微鏡を用いて、あらかじめフラッシュ済みのPE 10カテーテルを頸静脈に留置します。PE 10カテーテルをシアノアクリレート系外科用接着剤で皮膚に固定します。皮下EKG電極を3箇所、各腋窩付近に1つずつ、および腹部左下腹部に1つ配置します。すべての配線が手術台に確実に固定されていることを確認してください。信号線の交差を最小限に抑え、信号経路内の絶縁体を最小限にします。接続後、モニター上のEKG信号を最適化します。マウスが正常体温であることを確認してください。室温の0.5 molar 塩化カリウムを40 µL静脈内に投与し、EKGの等

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外科手術による外傷、炎症反応を誘導する。サイトカイン、内因性リガンドは、虚血再灌流後に心筋梗塞サイズを調節することが知られています。我々は、開胸の影響を最小限に抑えるためにぶら下がって重みを使用してマウスの虚血再灌流の変更されたクローズド·胸のモデルを提示します。...

心筋虚血再灌流障害のマウスクローズド胸モデル

我々は、再現性を高めるために左前下行枝（LAD）に結紮の位置決めにおいてより明確にするために可能にするマウスモデルにおける心筋梗塞（MI）をシミュレートするための実験的虚血/再灌流（I / R）傷害を誘導するための外科的方法を紹介マウスでのMIの実験の。...

左前下の動脈の結紮を通して心筋虚血再灌流傷害のマウスモデル

このプロトコルの目標は、げっ歯類の虚血性心筋麻痺後の心筋の気絶を評価することです。...

心臓麻痺逮捕と気絶心筋関連のマウス単離された心臓モデル

マウスの心筋虚血/再灌流手術中、閉塞結紮の正しい配置は、通常、心筋蒼白の目に見える観察によって確認されます。本明細書では、観察された心筋蒼白を補うために、虚血および再灌流を心電図で確認する方法が、雄のC57Bl/6マウスにおいて実証される。...

表面パッド心電図を使用したマウスにおける心筋虚血および再灌流障害の確認

本稿では、マウスで人工心肺を実行する方法について説明します。この小説のモデルは臓器の損傷に関与する分子メカニズムの調査を促進します。...

マウス モデルにおける心肺バイパス: 新しいアプローチ

ここでは、輸血やラットの変力作用エージェントなしの単純復旧心肺モデルを説明するプロトコルを提案します。このモデルでは、長期の研究人工心肺の複数臓器の後遺症をことができます。...

輸血やラットの変力作用エージェントなし回復心肺モデル

本明細書では、マウスにおける左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを達成する方法を示す外科的処置について説明する。このモデルは、心筋梗塞の病態生理学とそれに付着した生物学的プロセスを調べるために高い関連性がある。...

左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを用いたマウス心筋梗塞モデル

ここでは、マイクロマニピュレーションによる左前下行冠動脈の精密結紮により、マウスの心筋梗塞または心筋虚血再灌流障害を誘発できる簡便で再現性のある方法について述べる。...

マウスにおける心筋梗塞および心筋虚血再灌流障害の誘発

換気を維持し、低酸素症を回避しながら左肺虚血再灌流(IR)損傷を引き起こすマウス手術モデル。...

口腔気管挿管と人工肺虚血再灌流手術のマウスモデル

このプロトコルは蘇生のための胸の圧迫を要求しない窒息の心停止の独特なマウス...

虚血および蘇生中の脳イメージングおよび脳生理学的モニタリングのためのマウス心停止モデル

学ぶ正常体温心停止と心肺蘇生法によるマウス虚血再灌流モデル。BUNや血清クレアチニン、組織学的解析で急性腎障害を評価し、治療介入の効果を検証する方法です。

正常体温心停止と心肺蘇生法：虚血再灌流障害のマウスモデル

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