の選択熱帯熱マラリア原虫寄生虫

本手順の全般的な目的は、ヒト脳内皮細胞に結合するPlasmodium falciparum寄生虫を選別することです。これは、まず感染赤血球と非感染赤血球の混合物を含むPlasmodium falciparum寄生虫の培養液をヒト脳内皮細胞の層とともにインキュベートし、次に培養液で数回洗浄して非感染赤血球および非結合赤血球を洗い流すことで達成されます。その後、寄生虫集団をさらに増殖させるために、新鮮な赤血球を添加します。

数週間後の最終ステップとして、十分なパラサイト数に達し次第、全体の選択を繰り返します。最終的に、顕微鏡観察を用いて、HBE 5iに結合した大量のパラサイトを確認します。この手法は、サイトアドヒーレンス（細胞接着）プロセスに関与するパラサイトのリガンドや宿主受容体分子の同定など、脳マラリア分野における重要な疑問の解決に役立ちます。

白血球除去フィルターを用いて、O型陽性の全血から赤血球と白血球を分離し、ヒト赤血球を調製します。細胞を 1000 G で 10 分間遠心分離し、ペレットを PMI Incomplete medium で再懸濁します。

この洗浄工程をもう一度繰り返し、その後ペレットを再懸濁します。50%ヘマトクリットのPMI不完全培地において、赤血球を4 °Cで1週間保存します。Odium Valspar感染赤血球を培養します。

2%ヘマトクリットを含むRPMI完全培地を用い、37°C、3%二酸化炭素、1%酸素、96%窒素の条件下で毎日インキュベートします。ギムザ染色塗抹標本を作成し、寄生虫の発育段階を評価します。培養液を500 Gで5分間遠心分離し、毎日培地を交換してください。

約1週間に一度、上澄みを除去し、新鮮なRPMI完全培地を添加します。5% D-ソルビトール水溶液で処理し、寄生虫を同期させます。リングステージの培養液に少なくとも5%から10%の寄生虫が観察された翌日に、選択アッセイを行うことができます。

さらに、hbe5i細胞を播種した60 mmディッシュ1枚あたり、30 µLのP細胞体積を形成するのに十分な量の寄生虫培養液が必要です。60 mm組織培養ディッシュに2 µg/cm²のフィブロネクチンと滅菌生理食塩水を加え、ヒト脳微小血管内皮細胞株（Hback5i）用の準備を行います。

ディッシュを37 °Cで5〜20分間インキュベートし、その後、フィブロネクチン溶液を吸引して除去します。次に、25 cm²のティッシュカルチャーフラスコから、トリプシン化と遠心分離によってHBE5I細胞を回収します。細胞ペレットを10 mLのDMEM完全培地に懸濁させます。この細胞懸濁液1.5 mLをフィブロネクチン処理した組織培養ディッシュに加え、37 °C、5% CO₂で2〜3日間、コンフルエンシーが50〜100%に達するまでインキュベートします。これにより、アッセイ当日に寄生虫培養のサイトシンが準備されます。

HBE 5 I培養物は、50%から100%のコンフルエンシーである必要があります。一方、寄生虫培養物は、色素を持つトロフォゾイト（栄養体）段階にあり、寄生率が少なくとも5%から10%、ヘマトクリット値が2%である必要があります。まず、培養フラスコから1.5 millilitersの寄生虫培養液をピペットで採取し、15 milliliter遠心チューブに移します。

培養液を 500 G で5分間遠心分離し、10 milliliters の新しく調製した温かい DMEM 不完全培地で再懸濁します。最後の遠心分離が完了した後、この洗浄ステップを2回繰り返します。

DMEM不完全培地を加え、30 µLのペレットを1% BSAを添加した1.5 mLのDMEM不完全培地で再懸濁させます。次に、hvac.Fiveの60 mmディッシュを回収します。

眼細胞の培地を吸引し、3 mLの不完全DMEM培地で2回洗浄します。寄生虫懸濁液をHPE-5眼細胞のディッシュに加え、組織培養インキュベーターで計75分間インキュベートします。

インキュベーションの休止期間中に2回、インキュベーション後にディッシュをゆっくりと揺らし、回転させて寄生虫を懸濁させます。プラスチック製パスタピペットを用いて培地を吸引し、3 mLの温めた不完全DMEM培地を加える操作を5回繰り返し、ディッシュを洗浄します。最後の洗浄後、プレートをゆっくりと揺らしてから、倒立顕微鏡下でディッシュを確認します。未感染の赤血球がまだ多く見られる場合は、上記の手順に従って洗浄操作を繰り返し、それらを除去してください。

ディッシュから培地を吸引した後、新鮮な赤血球のパッキングセルボリューム 40 µL を、温めた RPMI 完全培地で再懸濁し、その細胞懸濁液をディッシュに加えます。ディッシュを気密性のインキュベーティングチャンバーに入れます。その後、3% 二酸化炭素、1% 酸素、96% 窒素で3分間ガス置換を行います。

そして、チャンバーを37°Cのインキュベーターに一晩置いてください。このインキュベーション中に、分裂期の寄生虫が破裂し、メロゾイトが赤血球に再侵入します。翌日、洗浄によって輪状期の寄生虫を回収します。

前と同様の方法でRPMI不完全培地を用いますが、培地のピペッティングとプレートの揺動はより強力に行います。再懸濁された赤血球を含む使用したすべての培地を、15 mLコニカルチューブに回収します。倒立顕微鏡でプレートを確認し、遠心機にかけたディッシュからすべての赤血球が除去されていることを確認してください。

洗浄したプレートから寄生虫をペレット化するために回収した培地を含むチューブから、上清を捨てます。5 mLのRPMI完全培地で再懸濁し、混合液を培養用の25 cm²フラスコに入れます。十分な量が得られ、次回の選択が行えるようになるまで、寄生虫を2〜4週間培養します。

未選択のHB3寄生虫は、HBE5細胞に対して低い結合能を示します。この画像は、2%グルタルアルデヒドで固定し、ギムザ染色を施したHBE5細胞を1000倍の倍率で顕微鏡観察したものです。写真は、非感染赤血球および未結合の感染赤血球を洗浄した後で撮影されました。選択を繰り返すごとに、より多くの寄生虫が内皮細胞に結合するようになり、5回の選択後は、より短い時間間隔で選択を繰り返すことが可能です。

HB3 HBE寄生虫を用いて、ここに示す方法で高結合性の寄生虫集団を得ます。この表は、HE5への結合について選択に成功したPlasmodium alspar株の要約を示しています。なお、HB3は5ラウンドの選択後、TNF活性化HE5 Iにおいても選択されたことを記します。

DD two株は、非選択のDD twoと比較して、HBE five Iへの結合能に増加を示しませんでした。この400倍拡大画像は、選択前のplasmodium alspar HB three寄生虫のHD MEK真皮血管内皮細胞への結合を示しています。ここでは、4回の選択ラウンド後の、同じ真皮血管内皮細胞株に対するplasmodium alspar HB three寄生虫の結合を示しています。

この図は、選択前のplasmodium spar HB three寄生虫のHP ME肺内皮細胞への結合を示しています。4ラウンドの選択後、H HP ME細胞に対するplasmodium spar HB three寄生虫の結合は増加しました。hd e、C、およびH HP ECの培地はわずかに異なりますが、選択に使用したプロトコルはhbe five Iの場合と同様です。この手順に続いて、RT-PCRやマイクロアナリシスなどの手法を用いることで、未選択および選択後の寄生虫における変異表面抗原の転写特性などの追加的な疑問を解決することが可能です。