の選択熱帯熱マラリア原虫寄生虫

この手順の全体的な目標は、ヒトの脳内皮細胞に結合するためのマラリア原虫、fpar、および寄生虫を選択することです。これは、最初にマラリア原虫、fpar、および寄生虫の培養物をインキュベートすることによって達成されます。これらは、感染した赤血球と感染していない赤血球の混合物とヒトの脳内皮細胞の層を含んでおり、次のステップは、培養物で数回洗浄することにより、感染していない赤血球と結合していない赤血球を洗い流すことです。次に、中程度で新鮮な赤血球を添加して、寄生虫の個体数をさらに成長させます。

数週間後の最後のステップは、十分なパラグラフに達したらすぐに全体的な選択を繰り返すことです。最終的に、顕微鏡検査は、HBE five iに結合した大量の寄生虫を示すために使用されます。この方法は、細胞持久力プロセスに関与する寄生虫リガンドや宿主受容体分子の同定など、脳マラリア領域における重要な疑問に答えるのに役立ちます。

白血球枯渇フィルターを通すことにより、白血球から赤血球を分離することにより、グループO陽性の全血からヒト赤血球を調製します。細胞を1000Gで10分間遠心分離し、ReeseはペレットをすべてのPMIで使用します。不完全、中程度。

この洗浄手順をもう一度繰り返してから、ペレットを再度懸濁します。50%ヘマトクリット値のPMI不完全培地では、赤血球は摂氏4度で1週間保存されます。培養Odium Valsparは赤血球に感染しました。

RPMI完全培地を2%ヘマトクリット値で使用し、37°Cで3%の二酸化炭素、1%の酸素、96%の窒素と毎日インキュベートします。寄生虫の発生段階を評価するために宝石塗抹標本を作成します。培地を500 Gで5分間回転させることにより、培地を毎日交換します。

上清を吸引し、週に一度、新鮮なRPMI完全培地を追加します。寄生虫を5%Dソルビトール水で処理することにより、寄生虫を同期させます。選択アッセイは、最低5%〜10%のParsitが観察されるリングステージ培養の翌日に実施されてもよい。

さらに。hbe 5つの眼細胞の60ミリメートル皿あたり30マイクロリットルのP細胞体積を形成するのに十分な寄生虫培養が必要です。ヒト脳微小血管内皮細胞株またはH back fiveiを受け取るために、2マイクログラム/センチメートル二乗のフィブロネクチンと滅菌生理食塩水を皿に加えることにより、60ミリメートルの組織培養皿を準備します。

皿を摂氏37度で5〜20分間インキュベートし、次にフィブロネクチン溶液を吸引します。次に、イオン化および遠心分離リースにより25センチメートル四方の組織フラスコからHBE 5 I細胞を回収し、細胞ペレットを10ミリリットルのDMEMに懸濁し、完全な培地にします。次に、この細胞懸濁液の1.5ミリリットルをフィブロネクチン処理組織培養皿に加え、培養物が50〜100%coの流暢さに達し、寄生虫培養物がアッセイの日に細胞aianの準備が整うまで、摂氏37度および5%二酸化炭素で2〜3日間インキュベー

HBE 5 Iの培養は、50〜100%coの流暢さである必要があります。寄生虫の培養物は、少なくとも5〜10%のパラと2%のヘマトクリットを持つ色素性栄養型段階にある必要があります。まず、培養フラスコから1.5ミリリットルの寄生虫培養物をピペットで移し、15ミリリットルの遠心分離管に移します。

培養物を500Gで5分間遠心分離し、10ミリリットルで再度曲げます。作りたての温かいDMEMの不完全、中程度。最終遠心分離が完了した後、この洗浄ステップを2回繰り返します。

アズベリーはDMEMの不完全で、中程度、およびDMEMの1.5ミリリットルで30マイクロリットルのペレットを再使用します。不完全な培地、1%BSAを補充。次に、hvacの60ミリ皿を取り出します。5。

眼球は培地を吸引し、3ミリリットルのDMEMで2回洗浄します。不完全な媒体。寄生虫の溶液、HPE 5つの眼細胞の皿を加え、組織培養インキュベーターで合計75分間インキュベー

インキュベーション中に2回、インキュベーション後に皿を静かに揺らし、渦巻かせることにより、寄生虫を懸濁します。プラスチック製のパスタピペットを使用して培地を吸引し、3ミリリットルの温かいDMEM不完全培地を追加して皿を5回洗い、最後の洗浄後に皿を静かに揺らし、倒立顕微鏡で皿を調べます。感染していない赤血球がまだたくさん見える場合は、上記のように洗浄手順を繰り返してそれらを取り除きます。

皿から培地を吸引した後、Resusは、温めたRPMI完全培地に新鮮な赤血球の40マイクロリットルの詰められた細胞量を懸濁し、皿に細胞懸濁液を追加します。皿をエアサイトインキュベーションチャンバーに入れます。次に、3%の二酸化炭素、1%の酸素、96%の窒素で皿に3分間ガスを入れます。

そして、チャンバーを摂氏37度のインキュベーターに一晩置きます。このインキュベーション中に、ステージ上の分裂した寄生虫が破裂し、マイツが赤血球を再活性化します。翌日、リングステージの寄生虫を洗浄して収穫します。

RPMIの不完全な培地では、以前と同様の方法で、より激しい培地のピペッティングとプレートの揺さぶりが見られます。使用した培地はすべて保管してください。これには再懸濁した赤血球が含まれ、15ミリリットルの円錐管に入っています。倒立顕微鏡でプレートをチェックし、すべての赤血球が皿遠心分離機から除去されたことを確認します。

寄生虫をペレット化するために洗浄されたプレートからの培地を含むチューブは、上清のResusを5ミリリットル懸濁して廃棄します。RPMIは培地を完成させ、混合物を25センチ四方のフラスコに入れて培養します。寄生虫は、十分な材料が得られ、新しい選択ラウンドを実行できるようになるまで、2〜4週間培養されます。

選択されていないHB3寄生虫は、hbe 5つの眼細胞への低レベルの結合を示します。この画像は、2%グルタルアルデヒドで固定し、ギムサで染色したhbeの5つの眼細胞を顕微鏡で1000倍拡大して可視化したところです。感染していない赤血球と結合していない感染した赤血球を洗い流した後、桃を採取しました。選択の各ラウンドの後、ますます多くの寄生虫が内皮細胞に結合し、選択を5ラウンドの選択後に短い時間間隔で繰り返すことができます。

高結合性寄生虫集団は、ここに示すように、HB3つのHBE寄生虫で得られます。この表は、HE 5への結合に成功して選択されたマラリア原虫alspar株の要約を示しています。HB 3は、5ラウンドの選考の後、TNFが活性化したHE five Iでも選択されたことに注意してください。

DD 2株は、非選択DD 2と比較して、HBE 5 Iへの結合の増加を示さなかった。この400倍の倍率の画像は、選択前にマラリア原虫アルスパーHB3つの寄生虫がHD MEK真皮内皮細胞に結合していることを示しています。ここでは、マラリア原虫アルスパーHBの3つの寄生虫の同じ真皮内皮細胞株への結合が、4ラウンドの選択後に示されています。

この図は、選択前のマラリア原虫スパーHB3つの寄生虫のHP ME肺内皮細胞への結合を示しています。現在、マラリア原虫スパーHB3寄生虫のH HP ME細胞への結合は、4ラウンドの選択後に増加しています。hd e、CおよびH HP ECのための培養液はわずかに異なるが、選択のためのプロトコルはhbe 5 I.Afterのような方法のこの手順に従うことと同じだったR-T-P-C-Rまたはマイクロ分析は、選択されていないおよび選択された寄生虫の変異体表面抗原の転写を特徴付けるような追加の質問に答えるために実行することができる。