トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

この手順の全体的な目標は、再現性があり、一貫性があり、コスト効率が高く、RNAフリーの方法で、目立たない脳核から全RNAを収集することです。これは、最初にRNフリーの作業環境を準備し、首を切られたマウスから全脳を切除することによって達成されます。次に、マイクロメータで操作する組織チョッパーを使用して、均一なサイズの連続組織切片を切断します。

次に、関心のある脳領域を、RNAフリーの培地環境で組織を維持しながら、設定された直径の組織コアを使用してマイクロ解剖します。最後に、切除された脳核から全RNAが単離されます。最終的には、スペクトルフォトメトリックまたはフルオロメトリックアッセイを通じて、下流のCDNAライブラリ調製およびトランスクリプトームプロファイリングに十分な全RNA収量と品質を示す結果を得ることができます。

肉眼的解剖学的またはレーザーキャプチャ顕微鏡検査支援脳領域切除のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、個々のマウス脳から関心のある複数の個別の脳領域を再現性があり、十分なコストで収集できることです。この方法は、神経回路のない脳領域内の異なる転写産物発現プロファイルが、特定の行動特性、環境反応、および/または疾患状態と相関しているかどうかなど、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。顕微解剖の準備をするために、100ミリリットルのアール平衡塩溶液またはEBSSに0.44グラムの重炭酸ナトリウムと0.884グラムのグルコースを補給します。

EBSSをオートクレーブ可能なボトルまたはスクリュートップのフラスコに入れた0.1ミリリットルのDEPCで少なくとも12時間処理します。摂氏37度で。5インチと4分の3インチのガラスピペットを1リットルのガラスビーカーに入れ、毛が上を向いたアーティストのブラシを100ミリリットルのガラスメスシリンダーに入れます。

ピペットとブラシを覆うのに十分なDEPC処理水溶液を追加します。ビーカーとメスシリンダーをアルミホイルで覆い、DEPCと12時間のインキュベーション後、摂氏37度で少なくとも12時間インキュベートし、すべてのDEPC処理材料を摂氏100度を超える温度に少なくとも15分間インキュベートします。涼しい。EBSSを室温で保存する前に摂氏4度で保存します。

ビーカーとメスシリンダーからDD H2Oを注ぎ、材料が乾くまで摂氏100度以上でインキュベートを続けます。それらをインキュベーターから取り出し、室温で冷却し、後で使用するために保管します。実験当日は、すべての作業面を処理してRNAの汚染箇所を除去し、摂氏40度に設定されたウォーターバスでEBSSを維持し、緩衝と酸素化を行います。

EBSSは、ガスチューブをRNAフリーの牧草地ピペットに入れることにより、5%CO2と95%の酸素を浸潤させます。そして、ピペットをEBSSカバーに挿入し、EBSS容器の開口部を覆います。脳組織の連続切片化のための組織スライサーを設置します。

ティッシュスライサーの上面と下面を処理します。RNAコンタミネーションを除去するには、長方形のワットマンナンバー4、フィルターペーパーをティッシュチョッパーのプレキシガラス表面に貼り付けます。チョッパーアームに両刃のカミソリの刃を取り付けます。

マイクロメータをゼロに設定し、チョッパーアームの最小高さを調整して、カミソリの刃が濾紙をカットできるようにしますが、プレキシガラスプレートはカットできません。RNAフリーの60 x 15 mm細胞培養皿、組織cos 200 μリットルのRNAフリーマイクロピペットチップ、湾曲したハサミ、ドライアイス、組織採取用チューブなど、マイクロ解剖に必要なすべての追加材料を収集します。げっ歯類のギロチンを使用してマウスの首を切り落とし、後脳と視神経の両方を無傷で脳全体を取り除いた後、チューブをドライアイスの上に置きます。

60 x 15 mmのRNAフリー細胞培養皿の上部に脳を置きます。次に、それを組織サンプリング作業面に移します。RNAフリーのピペットを使用して、組織チョッパーに取り付けられた濾紙をEBSSで保存的に湿らせます。

EBSSで脳組織を濡らします。脳を組織チョッパーに移し、腹面を濾紙の上に置いて配置します。チョッパーブレードに垂直な正中線と、ブレードに隣接する脳の吻側縁

A-D-E-P-C処理されたアーティストのブラシを使用して、脳を静止させたまま脳の背側表面に穏やかな圧力を加えることにより、脳を静止させます。ブレードホルダーレバーを背側組織表面から約4〜5センチ持ち上げ、この位置に保持します。ブラシを脳の表面から取り外し、750マイクロメートルをダイヤルします。

マイクロメータを使用します。レバーを落とし、ティッシュを切り刻み、チョッパーブレードを静止させたまま750マイクロメートルの冠状部分を作成します。アーティストのブラシで転がす動きを使用して、ティッシュ部分をブレードの表面からそっとスワイプします。

直ちに組織切片をペトリ皿内の酸素化されたEBSSに入れます。このスライスは、マイクロダイセクションの準備が整いました。連続した脳切片がロストコーダル平面全体で取得されるまで、スライス手順を繰り返して、マイクロダイセクションを実行します。

まず、サンプルの照明が遮られないように照明を確認します。O2 CO2混合物の位置と流れを調整して、組織の緩衝された酸素化された環境を維持します。手順中に、関心のある領域を含む冠状脳切片を特定し、アーティストのブラシを使用して、ペトリ皿の底に平らに向けます。

適切な直径の組織コアを選択します。アーティストのブラシで冠状組織切片を所定の位置に保持し、組織コアの切断先端を組織切片の表面に下ろします。圧力をかけながら、ティッシュコアの先端をティッシュセクションに押し込み、ペトリ皿の底にしっかりと押し下げます。

ローリング円運動を使用して、関心領域が周囲の組織から解離していることを確認します。アーティストのブラシを使用して、ティッシュコアをティッシュセクションから慎重に持ち上げ、マイクロパンチを解放してEBSSに浮かべます。すぐにティッシュマイクロパンチをマイナス80°Cの安定した保存チューブに沈着させます ドライアイスの上に置いた。

組織はチューブの側面に容易に付着するはずです。チューブを含むマイクロサンプルをドライアイスに戻します。関心のある各脳領域について、このマイクロダイセクションを繰り返します。

マイクロダイセクションが完了したら、チューブを含む各サンプルのそれぞれのラベルまたはバーコードを記録します。組織サンプルをマイナス80°Cの冷凍庫に入れ、RNA抽出までして組織サンプルからRNAを抽出します。まず、RNAフリーのワークスペースを用意します。

Total RNA Isolation Kitのマニュアルに記載されているように、十分な量の磁気ビーズミックスと溶解結合溶液を調製します。マイナス80°Cの冷凍庫から組織サンプルを取り出し、チューブを直接ドライアイスの上に置きます。100マイクロリットルの溶解結合溶液をサンプルのチューブに加えます。

ヌクレアーゼフリーの0.5ミリリットルチューブサイズの乳棒をペレットミキサーに取り付け、低保持ヌクレアーゼフリーのピペットチップを使用して組織を均質化します。均質化したサンプルを、同じタイプのチップを使用して、丸底の96ウェル組織培養プレート上のウェルにすぐに移します。60マイクロリットルの100%イソプロパノールをサンプルに加えます。

ビーズミックス20マイクロリットルをサンプルに加え、ピペッティングで3〜4回上下させて混合します。total RNA isolation kit のプロトコール手順に従って、total RNA 抽出を完了します。最後に、得られた全RNAの総RNAの純度と濃度を測定するさまざまな脳領域のマイクロパンチからのデータをこの表に示します。

30マイクロリットルのevolution Bufferで言及されたRNAサンプルは、RNAシーケンシングアプリケーション用の市販のCD NA調製製品で使用するのに十分な全RNAを提供しました。さらに、RNA収量と2つの60対2の80比は、それぞれのマイクロダイセクションサンプルから得られた単一の値であり、各脳領域から得られた測定値を実証し、高いサンプル純度を確認します。この手順を試行する際には、RNAフリーまたはdsy処理された材料のみを使用して、作業面または組織サンプルのRNA汚染のリスクを最小限に抑えることを覚えておくことが重要です。