イメージングG -タンパク質共役受容体（GPCR）を介するシグナル伝達事象その制御走キイロタマホコリカビ

この手順の全体的な目標は、高度な蛍光共焦点顕微鏡を適用して、dictyostelium discoid dium細胞における化学療法中のシグナル伝達イベントの時空間ダイナミクスを監視することです。次に、制御された化学療法誘引剤の勾配を画像化して、化学療法誘引剤濃度と蛍光強度の化学療法誘引剤との間の線形関係を確立します。第3のステップは、サイクリックA MP勾配センシングに関与するシグナル伝達イベントをイメージングするための不動細胞システムを取得することです。

最後のステップは、生細胞における2つのG PCR R制御シグナル伝達イベント、ヘテロ三量体Gタンパク質の活性化、およびPIP 3の産生を同時にモニタリングすることです。最終的には、化学療法誘引剤でシミュレートされた単一細胞の蛍光強度の時空間変化。サイクリックA MPは、高度な共焦点顕微鏡によるライブセルイメージングを通じて視覚化できます。

この手法の主な利点は、生命細胞のシグナル伝達イベントに関する空間的な時間情報を取得できることです。このライフスタイル測定により、A-G-P-C-Rシグナル伝達ネットワークがどのようにして化学療法誘引成分を検出し、適切な応答を生成することができるかをよりよく理解することができます。手順を実演するのは、ライフスタイルイメージング方法の専門家であるShu博士で、22°Cの振とう培養物からD 3トリヒ培地で成長する化学療法誘引剤環状A MP収穫細胞に走化性であるdsco dium細胞を生成します。

非栄養発生緩衝液中の細胞を400 Gで5分間遠心分離することにより、細胞を2回洗浄します。室温で、DBバッファー内の細胞を1ミリリットルあたり7番目の細胞の10の2倍の密度で懸濁します。10ミリリットルの発生緩衝液中の2,000万個の細胞を250ミリリットルのフラスコに移し、100RP Mで22°Cで1時間振とうします。

次に、次の6時間にわたって6分ごとに100マイクロリットルの7.5マイクロモルサイクリックAMPストックを10ミリリットルの細胞に送達して、75アノモルサイクリックAMPの最終濃度を達成します。次に、今度は200 Gsで遠心分離することにより、環状A MP化学療法誘引剤コンピテントセルを回収し、次に2.5ミリモルカフェインを含むDBバッファーで細胞を再懸濁します。細胞を再び摂氏22度で20分間振とうします。今回は200RPMで、走化性のために細胞を塩分化します。

まず、DBバッファーに1マイクロモルの環状AMPとAlexa 5 94の新しく調製した30ミリリットルの溶液を1マイクロリットルあたり0.1マイクログラムでマイクロピペットに埋め戻します。次に、フェムトチップをマイクロピペットホルダーに取り付け、チューブを圧力供給装置に接続します。安定したグラジエントを確立するには、マイクロピペットアセンブリを電動マイクロマニピュレーターに取り付けます。

1ウェルのラボテックチャンバーに6ミリリットルのDBバッファーを充填し、その後、視野内のフェムトチップである明視野光学センターを使用して、共焦点顕微鏡の40倍オイルレンズにチャンバーを取り付けます。次に、圧力供給をオンにし、補償圧力を70 Hector Pascalsに設定して、サイクリックA MP Alexa 5 94混合物の勾配を確立します。543ナノメートルのレーザーラインによる励起を使用して、所望の濃度のサイクリックA MPとAlexa 5 94蛍光の混合物をモニタリングすることにより、サイクリックA MPグラジエントを可視化します。

最後に、マイクロマニピュレーターの自動位置決め機能を使用して、マイクロピペットを任意の位置に置き、位置1、位置2、位置3を設定して、細胞が曝露される勾配を操作します。カフェイン処理後、細胞のアリコートを取り出し、細胞を500Gで3分間ペレット化します。室温で緩衝液を取り出し、細胞を5番目の細胞の10倍/ミリリットルに希釈します。

2.5ミリモルカフェインを含む新鮮なDBバッファーを使用。次に、1ミリリットルの細胞懸濁液を1つのウェルチャンバーに適用します。細胞を10分間接着させた後、緩衝液を慎重にピペットで取り出して付着していない細胞を取り除き、カフェインを含む同量の新しいDB緩衝液と交換してイメージングを開始し、顕微鏡下で目的の細胞を見つけます。

次に、定常勾配に曝露された細胞内のシグナル伝達成分のダイナミクスをモニターします。実験の前に、細胞を5マイクロモルのLAトゥルーレントBで10分間処理します。このスキームは、この映画の指向性センシングの簡単なシグナル伝達経路を示しています。

周期的なA MPグラジエントが、PIP 3プローブを発現する細胞であるDディスコスト細胞の急速な走化性をどのように誘導するかがわかります。P-H-G-F-Pは緑色で表示されます。Alexa 5 94で視覚化されたグラデーションは赤で表示されます。ここは。

環状A MP濃度と蛍光色素の強度との間に線形関係を求める簡単な方法です。Alexaの5 94は、Alexaの1ミリリットルあたり10マイクログラムと混合された2マイクロモルのサイクリックA MPの希釈シリーズによって。5 94 が表示されます。

次に、Alexa 5 94の強度による勾配の周期的なA MP濃度の定量的測定を確立する簡単な方法をグラフィカルに示します。この図は、アクトン重合阻害剤であるラットトゥルーレントBによって運動性が抑制された細胞が、依然として指向性センシング能力を維持していることを示しています。細胞はPIP 3プローブP-H-G-F-Pを発現し、緑色に見えますが、赤色の勾配はLexi 5 94によって視覚化されます。

この動画では、非分極化された単純化された細胞システムと操作可能なサイクリックA MP刺激の採用が、方向センシングの基本的な問題にどのように対処できるかを見ることができます。ハイテンポな空間分解能でのライブセルイメージングの応用を実証するために、ここではPIP 3の二相性発現を示す緑色の細胞を示します。定常的な周期的なA MP勾配への曝露に応答して、赤色で示されています。

この画像は、PIP 3 生産の動力学の測定に関心のある領域を示しています。ここでは、定常勾配への曝露による細胞の前面と背面でのPIP 3産生の動態を示しており、前面と背面のPIP 3産生がそれぞれ黒と灰色で表されています。ライブセルイメージングを応用して、サイクリックA MP刺激からPIP 3産生までの指向性センシング特異的シグナル伝達ネットワークのダイナミクスを系統的に測定しました。

このスキームは、サイクリックA MP刺激からPIP 3生成までの指向性センシングのシグナル伝達ネットワークを示しています。各コンポーネントの動力学は、同じ色の線で表されます。この最初の図では、一様に適用された周期的なA MP刺激が持続的なGタンパク質の活性化を引き起こし、それが一過性のPIP 3産生を引き起こす様子がこの動画で表現されています。

G細胞とpH細胞の虹色の画像は、均一に加えられた周期的なA MP刺激が細胞末梢での持続的なGタンパク質活性化を引き起こし、同時に一過性のPIP 3産生を引き起こすことを示しています。ここでは、一様に適用されたサイクリックA MP刺激によるGタンパク質の活性化とPIP 3産生の動態が示されています。これらの実験を試みる際には、反応性細胞、細胞のさまざまな遺伝的背景、および環境条件を取得することが鍵であることを覚えておくことが重要です。

イメージング取得条件はすべて細胞生理機能を変化させ、細胞の応答性を低下させる可能性があります。この手順に続いて、計算モデリングを適用して、シグナル伝達ネットワーク内の動的相互作用がどのように細胞の振る舞いを引き起こすかなどの追加の質問に答えることができます。この方法は、真核生物の化学療法税の分野の研究者に道を開きます。

私たちは、走化物センシングの計算モデルを開発することができます。このモデルを使用して、シグナリング イベントのダイナミクスをシミュレートできます。モデルの改良とライフスタイル測定の相互作用は、化学療法税のより深い理解につながる可能性があります。

このビデオをご覧になった後、高度な蛍光共焦点顕微鏡法を適用して生命細胞のシグナル伝達イベントをモニターする方法について理解を深めていただければ幸いです。うまくいけば、この方法をあなたの研究に適用できることを願っています。