Name: 初期のニワトリ胚の形態形成の組織の変形を追跡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学ぶ初期ニワトリ胚の形態形成変形追跡法。蛍光リポフィリック色素やポリスチレン微粒子を用いた標識と、蛍光顕微鏡・光学コヒーレンストモグラフィーによるリアルタイム組織動態解析の手法を解説。

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この作品は、NIHの助成金R01 GM075200とR01 HL083393（LAT）によってサポートされていました。我々は、NIH T90 DA022871と放射線のMallinckrodt研究所からBAFのための奨学金支援を認める、と米国心臓協会からの助成金09PRE2060795からVDV用。

1。一般的な実験の準備<ol><li>層流フードの組織培養の培地を準備。 <ol><li>ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）（4.5グラム/ Lグルコース、重炭酸ナトリウム、およびL -グルタミンと1リットルの瓶）を希釈する。 10 mLのペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン抗生物質を追加。 </li><li>無菌トランスファーピペットでDMEM 100mLのを削除し、ニワトリ血清100mLで置き換えます。 </li><li>滅菌済み15 mLコニカルバイアルと凍結に一定分量DMEM/10％ニワトリ血清/ 1％の抗生物質を。 </li></ol></li><li>カルシウムとマグネシウムを添加したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を準備します。 100 mLの10X PBS、900mLの脱イオン水、及び濃カルシウムとマグネシウム溶液（100 mg / mLの塩化カルシウム2•2H 2 O、100mg/mLのMgCl 2•6H 2 O）1 mLを混和します。 </li><li>ハンバーガーとハミルトン1（すなわち、23から25 HHステージ5のための時間、または42で定義されているように、目的のステージに縦向きに卵をインキュベートHHステージ11〜12）は、-48時間。 </li><li>ろ紙キャリア方式を使用して卵から胚を削除します。 <ol><li> A150ミリメートルペトリ皿の側面に卵の底を割れる。下からシェルを離れて引いて、皿に卵の中身を空にします。 </li><li>鈍鉗子を使用して、卵からの厚い、粘性のある卵白を削除します。 </li><li>ワットマン＃2濾紙2〜3センチメートルの円をカット。直径インチろ紙の中央に単穴パンチ、パンチ穴を使用する。リングの中央の穴を通して見える胚を保つ方法で卵黄上にろ紙のいずれかのリングを置きます。 </li><li> microscissorsとろ紙の外径の周りにカット。細かいピンセットを用い、卵黄から用紙を取り除きます。 </li><li>ゆっくりと接着卵黄の粒子を除去するためにPBSで胚をすすいでください。 （HH5胚は残存卵黄を除去するために15〜20分限り、浸漬する必要がある場合があります）。お風呂からろ紙のアセンブリを取り外し、それ腹側を上に置く35mmの培養皿。リング間胚を挟んで、最初の頂上番目のフィルタ紙のリングを置きます。胚を保護するために - 濾紙のサンドウィッチ（2 cmの直径≈1.5）の外側の周りに金属リングを置く。 </li><li>培地に浸す胚を。明視野顕微鏡との適切な形態と胚の段階を確認してください。 </li></ol></li><li>その後の組織の解剖と標識のために先端の細いガラス針（1.5内径）（世界の精密機器、サラソタFL）を準備するためにピペットプラーを使用してください。 </li></ol> 2。 HHステージのDII標識磁性鉄粒子を用いて5胚<ol><li>室温で鉄粉の少量（鉄の減少、Mallinckrodtベイカー、（株）、ニュージャージー州フィリップスバーグ）にアルコールで飽和DIIの数滴を追加し、乾燥させる。 （これは通常、アルコールが蒸発した後に一緒にケーキにパーティクルが発生します。）凝集鉄粒子を分割するプルマイクロピペットの先端を使用して、マイクロ遠心チューブに転送し、それらを数回すすぎ、脱イオン水でカバー。 </li><li> HHステージ5胚の外胚葉の細胞を標識するために、培地の寛大な層で覆われた35mmの培養皿で収穫された胚（すなわち、全体のろ紙のアセンブリ）背側を上に置き、解剖顕微鏡下で皿を置く。卵黄膜を除去し、外胚葉の細胞を露出するガラス針を使用してください。 （ピアスの胚ではないに注意してください。） </li><li>パスツールピペットにラベル付け鉄粒子（脱イオン水で）の列を描画します。解剖顕微鏡、水没だけ胚上記液面との位置の下にピペットチップを使用する。指先との間でゆっくり前後にピペットをローリング、pipietteから粒子をゆすりますと胚全体でそれらを振りかける。 </li><li>胚の粒子で覆われると、慎重に約10分間37℃のインキュベーターに入れてください。インキュベーターから胚を取り出しD粒子を除去する強力な磁石を使用してください。 </li><li>図2A、Bに示すように、明視野および胚の蛍光画像の両方を取得するために接続されたビデオカメラと適切なフィルタ設定を使用して蛍光顕微鏡を使用して、 </li><li>ラベルの密度に注意してください。高密度の分布が必要な場合は、再び胚をラベル付けし、それに応じてインキュベーション時間を延長する（上述のように）追加の粒子を使用してください。ラベルがあまりにも密な場合は、すでにラベルの粒子を充填したマイクロ遠心チューブにラベルのない鉄粒子の少量を追加し、チューブの中身を混ぜる。新しい胚とラベリングのプロセスを繰り返し、再度ラベルの密度に注意してください。 </li></ol> 3。 HH11 - 12胚の光コヒーレンストモグラフィー（OCT）イメージングのためのポリスチレン微小ラベリング<ol><li> 35ミリメートルのペトリ皿にPBSで黒10μmの直径ミクロスフェア（Polysciences社、ウォリントン、ペンシルバニア州）の溶液を調製します。 （ビーズは、OCTのコントラストを生成するために十分な大きさが必要ですイメージング、しかし十分に小さいビーズの大きさは個々のセルの順になっていることなど。特定の値）をOCTシステムの解像度によって異なりますし、組織が検討されて。 PBSのmL当たり原液の一滴（2.6％固体ラテックス）は、一般的に十分です。 22ゲージの針を使用して10ccのシリンジにこのソリューションを引き出します。均一なビーズ分布を確保するために30秒間ボルテックスソリューション。 </li><li>ベベルコンピュータのハードドライブ2を使用して、引っ張らガラス針の先端。先端の直径は、ビーズが開口部を通って合うことができる十分な大きさでなければなりませんが、同時に、可能な限り小さく注入時の組織の傷を最小限に抑えます。 </li><li>シリンジを用いてビーズ溶液と傾斜のガラス針を埋める。軽くソリューションは、先端に達したことを保証するためにマイクロピペットをフリック。 </li><li>マイクロマニピュレータを用いて、胚とビューの同じフィールドにガラス針を配置。ビーズは、ピペットの先端部から外れ通過している必要があります。 <ol><li>ないBEAの場合dsはマイクロピペットを終了、詰まりがあるかもしれません。この場合、繰り返しは、新しいガラスの針で3.2から3.4を繰り返します。 </li><li>あまりにも多くのビーズが視界を曇らせる場合、あなたのピペットチップは広すぎる可能性があります。新しいピペットと新しい胚と手順3.2から3.4を繰り返します。 </li></ol></li><li>脳のチューブの内腔にピペットの先端を挿入します。ではない組織の腹床を貫通することを確認してください。ビーズと流体が内腔を入力するときは、組織の一時的な腫れが表示されます。これが成功した挿管を示し、現在、急速にガラスニードルを取り外します。 </li><li>明視野顕微鏡を用いて脳の管の内腔で十分なビーズの密度を確認してください。セクトに進む前に30分 - ビーズが20のために解決しましょう​​。 4。 </li></ol> 4。データ収集 *以下の方法がよく、上記の蛍光標識法に適しています。サンプルを転送するときしかし、ミクロスフェアの標識法と、ビーズが吹き飛ばされることがあるインキュベータとイメージングシステムの間で。このケースでは4.2（これは完全にサンプルの移動/撹拌を避ける）のステップに進むために最善の方法です。液体培地に浸漬しながら両方の方法では、胚を培養している。胚が完全に（いくつかの従来の組織培養技術の場合と同様に）水中ではない場合、組織の形状が大幅に異常に高い表面張力の負荷とひずみ分布によって変更される正確に通常の3 - D形態形成3、4をキャプチャするために失敗します。また、組織を沈めると、胚の形態およびマーカーの座標を妨げOCT画像の間に気液界面で観測された明るいコントラストを防ぎます。 <ol><li>胚培養（一般） <ol><li>最初の画像（明視野、蛍光、またはOCT）を取得した後、150mMのペトリ皿で​​7 35mmの培養皿（胚を含む）まで入れて、小さなビニール袋で全体のアセンブリを配置します。加湿用の袋に脱イオン水の滴をいくつか追加そして95％O 2 / 5％CO 2混合物でバッグを埋める。 37℃インキュベーターに胚を置く° C、次の撮影タイムポイントまでの希望時間（キューStabiletherm、アッシュビル、ノースカロライナ州）。この方法を使用して、実験は同じ日に複数の胚で行うことができます。 </li></ol></li><li>タイムラプス文化（自動） <ol><li>培養液1.2 mLを含む、デルタTディッシュ（Bioptechs、バトラー、ペンシルバニア州35ミリメートル、外径、テーパーのサイドウォール、0.17ミリメートル厚のガラスと23ミリメートルの中央開口部）にラベルされた胚を置きます。 </li><li> ° C BioptechsデルタT4培養皿のコントローラを（結露を防ぐために）使用して37℃に保たガラス蓋付き皿に蓋をする。ミニポンプ可変流量デバイス（フィッシャーサイエンティフィック）から供給される95％O 2 / 5％CO 2ガスの混合物で胚を表面かん流する。前の胚、熱に達すると暖かい（&lt;100℃）、ホットプレート上で脱イオン水を介してそれをバブリングすることによりガスを加湿する。この実験的なsの概略図ETアップを図1に示されています。 </li><li>自動的にユーザーが指定した時間間隔で画像を取得するためにソフトウェアを設定します。私たちの蛍光顕微鏡の場合、我々は（パーキンエルマー、ウォルサム、マサチューセッツ州）オープンラボソフトウェアを使用して、そして私たちのOCTシステムのために、我々は掃引源Thorlabsソフトウェア（ニュートン、NJ）を使用してください。このメソッドは現在のところに一つタイムラプス実験を扱うことができるだけなので時間は、それは文化のこれらのタイプは、夜間に実行できるようにするのが最善の方法です。一つは、イメージングシステム5のハードウェアとソフトウェアの両方と互換性のある自動翻訳の段階をインストールすることにより、この制限を回避可能性があります。 </li></ol></li></ol> 5。代表的な結果： ラベルは、各実験で自動的に追跡（Volocityを使用して、パーキンエルマー社）または手動（ImageJので手動トラッキングプラグインを使用して、NIH）されています。蛍光標識法では、我々は可能なマーカーの座標、を介して2Dサーフェスに合わせてMatlabのルーチンのgridfitを使用してください形態形成の表面の株は6,7を算出する。標準的な方程式は、関連する胚の座標系にこれらの値を変換するために使用されています。また、OCTの技術で、表面はセグメント化された画像のボリュームから生成されます（このようなMatlabやキャレット8など標準的なソフトウェアを介して取得）と株は、試料9の最大値または最小曲率の方向に計算することができます。 我々は初期のニワトリ胚の頭部倍形成中胚葉細胞の動きにラベルを付けたり、追跡するために私達の鉄の粒子の技術を使用していました。図2Aに示すように、蛍光標識した細胞は、全体の胚全体に分布していた。明視野と胚の蛍光画像は 、ex 卵培養中に異なる間隔で捕獲された。追跡されたラベル（図2B、C）の動きは、その後、ヘッド倍に形成した（図2D - F）の間に進化して形態形成のひずみ分布を計算するために使用されていました。 tは"&gt;同様に、私たちのポリスチレンマイクロスフェア技術は初期のニワトリ脳の半ばに後脳境界で組織の動きを追跡するために使用された。図3 BDに示すように、ビーズの動きは、縦とで組織の変形を特徴づける6時間と株のために追跡された円周方向は、マーカーの座標から計算した。この方法は、ビーズのようなはっきりと3 - D変形を扱うことができることに注意して脳の内腔（図3A）のすべての辺に固執する傾向がある。 <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig1.jpg" alt="図1"> 図1。タイムラプス組織培養のためのセットアップの概略図。 <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig2.jpg" alt="図2"> 図2。追跡蛍光ラベルを使用して初期のニワトリ胚での2次元組織の変形を定量化。 （）鉄の粒子を除去した後の明視野/ HHステージ5胚の蛍光像を合併。 DII -ラベルED外胚葉細胞（赤色）が全体の胚全体に分散されます。 （B、C）標識細胞の動きは、ImageJを用いて追跡した。ラベルの変位は、胚の座標（X、Y）で計算した。 AとBが同じ画像であることに注意してください。 （DF）ヘッド倍形成の間に長手方向のひずみ分布を進化の等高線プロット。長手方向のラグランジュ株は、（D）75分、（E）120分、およびインキュベーションの（F）165分後にHHステージ5（すなわち、AとB）と比較して計算された。これらの菌株はY軸（ステージ5胚で）に沿って元々指向の線要素の長さの変化を特徴付ける。追跡ラベルを使用すると、形態形成の菌株を計算する座標の詳細については、Filas ら （2007）6、Varner ら （2010）7で見つけることができます。 CとFが同じ画像であることに注意してください。スケールバー= 500μmの。 <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig3.jpg" alt="図3"> 図3 3次元組織Dの定量初期のニワトリ脳内eformations。背側に付着（黒矢印）と脳の管の腹側（白い矢印）の側面は、OCTの再建の横断section.Ventralビューで周辺組織から容易に識別できるものは半ば後脳境界付近の微小球の位置を示す（A）ポリスチレン微小球（B）HH12時と後に（C）インキュベーションの6時間（M：中脳、H：後脳）。ビーズのいくつかのグループが組織の全体的な変形を強調するために概説されています。 （D）縦（E ZZ）と円周は（Eθθ）ラグランジュの菌株は、これらの変形から計算した。半ば後脳の境界で正の縦と負の周方向の株が培養中にこの地域の延長軸方向と円周方向の短縮を反映している。形態形成の間に複雑な表面のために形態形成の系統の計算に関する詳細は、Filas ら （2008）9で見つけることができます。スケールバー= 200μmの。

<ol><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+beveling+micropipettes+using+a+computer+hard+drive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dry beveling micropipettes using a computer hard drive.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).</li>
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<li>Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+measuring+deformation+of+folding+surfaces+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis.</a> J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).</li>
<li>Yuan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-registered+optical+coherence+tomography+and+fluorescence+molecular+imaging+for+simultaneous+morphological+and+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging.</a> Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).</li>
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<li>Blanchard, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+tectonics%3A+morphogenetic+strain+rates%2C+cell+shape+change+and+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation.</a> Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

二つの組織の標識技術は、初期のニワトリ胚の元OVO文化のために表示されている。最初は同時に細胞の数百をラベル付けする磁性鉄微粒子を介して配信蛍光親油性色素を使用しています。蛍光染料は一般的に10月10日を使って周囲の組織から少しコントラストを示すようにしかし、この方法は、現在、光コヒーレンストモグラフィーと互換性がありません。したがって、我々は、タイムラプスのOCT解析のための組織を標識するためにポリスチレン微小球を使用して別の方法を示しています。この手法は3次元のデータセットが得られますが、注意は、組織からビーズが剥がれないよう注意する必要があります。適切な実験設定でこれらのメソッドのいずれかを使用すると、初期胚における信頼性の高い組織のラベリングとEX OVO開発を提供する必要があります。どちらの方法もすぐに利用できる、比較的低コストの材料（例えば、鉄粉、ポリスチレン微小球）を使用し、形態形成の間に定量化する組織の変形を有効にします。市販どちらの場合も組織のマーカーを簡単にかつ再現性胚組織に適用することができ、フィールドでの新規参入者にこれらの実験にアクセスできるよう、特殊な...

<table border="1"><table border="1"><tbody><tr><td> 材料/試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM - 高グルコース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P4083 </td><td></td></tr><tr><td>鶏血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16110-082 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D1408 </td><td> 10X </td></tr><tr><td>ワットマン＃2濾紙</td><td>ワットマン紙</td><td> 1002 090 </td><td> 90ミリメートルの直径</td></tr><tr><td>ガラスのマイクロピペット</td><td>世界の精密楽器（WPI） </td><td> TW150 - 6 </td><td> 1.5ミリメートル、内径</td></tr><tr><td> DII </td><td>インビトロジェン</td><td> D - 282 </td><td></td></tr><tr><td>鉄の減少</td><td> Mallinckrodtベイカー（株） </td><td> 5320 </td><td></td></tr><tr><td> 10μmの直径ミクロスフェア（黒） </td><td> Polysciences株式会社</td><td> 24294 </td><td></td></tr><tr><td>デルタTディッシュ（タイムラプス培養用） </td><td> Bioptechs </td><td> 04200415B </td><td>黒、厚さ0.17ミリメートル</td></tr><tr><td>デルタT4培養皿コントローラ</td><td> Bioptechs </td><td> 0420-4-03 </td><td></td></tr><tr><td>ミニポンプ可変流量デバイス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

初期のニワトリ胚の形態形成の組織の変形を追跡

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo 

胚上皮は、初期胚の原始的な器官を形成するために複雑な変形を（例えば、ねじり、曲げ折り、そしてストレッチ）を行います。これらの細胞の板の表面上で基準マーカを追跡することはそのような成長、収縮、およびせん断などの形態形成量を見積もるための十分に確立された方法です。しかし、すべての面の標識技術は、従来の画像診断法に迅速に適用可能であり、異なる利点と限界を有していない。ここで、我々は2つ​​の標識方法を説明し、各手法の有用性を示しています。最初の方法では、蛍光ラベル、数百は、磁性鉄粒子を用いて胚に同時に適用されます。これらのラベルは、形態形成時の2次元組織の変形量に使用されます。第二の方法、ポリスチレン微小球で3次元組織の変形を追跡するために非侵襲的光コヒーレンストモグラフィー（OCT）画像で造影剤として使用されています。これらの技術は成功しているLYは、初期の頭の倍、心臓、および脳の発達の物理的メカニズムをstudytheに私たちのラボで実施され、広い範囲の形態形成のプロセスに適応可能でなければなりません。

この記事では、表面のラベルを説明し、<em&gt; EX卵</em初期鶏胚における&gt;組織培養。タイムラプス明視野、蛍光、および光コヒーレンストモグラフィのイメージングへの従順の技術が提示されます。高い時空間分解能で追跡表面のラベルは、2次元および3次元の両方で計算される形態形成株（変形）として運動量を可能にします。

胚性上皮は、初期胚の原始器官を形成するために、複雑な変形（曲げ、ねじれ、折り畳み、伸展など）を起こします。...

本手法の全体的な目的は、初期発生における形態形成的な変形を測定するために、胚組織の標識および培養を行うことです。鶏胚初期の培養を開始するには、まずフィルターペーパーキャリア法を用いて卵から胚を取り出します。実験的な用途に応じて、抽出した胚を、磁性鉄粒子で導入する蛍光親油性染料またはポリスチレンマイクロスフィアで標識します。次に、蛍光顕微鏡または光干渉断層撮影（OCT）イメージングを用いて、培養中の標識を追跡します。得られた形態形成ひずみマップをイメージングすることで、2次元および3次元の両方において、組織の伸長、短縮、およびせん断が生じている領域を特定できます。こんにちは、私はBen Philisです。セントルイス・ワシントン大学生体医工学部のLarry Tabor博士の研究室に所属する大学院生です。この種の実験を開始する前に、モデルシステムにおける適切な組織培養技術、利用可能なイメージング手法、および実験から得たいデータの種類について検討することが重要です。例えば、組織の変形を2次元または3次元で分析することに関心がありますか？本日は、ニワトリ初期胚における2つの相補的な標識技術を紹介することで、これらの疑問のいくつかに答えます。こんにちは、私はビクター・ヴァーナーです。セントルイスのワシントン大学にあるラリー・テイバー博士の研究室で働いています。これら2つの手法では、ニワトリ胚の初期段階において、数百個の細胞を迅速かつ同時に標識します。これらの標識の動きを追跡することで、これらの細胞が最終的にどの組織に定着するかを特定できるだけでなく、初期胚を形成する組織レベルの変形を定量化することも可能になります。まず、Hamburger-Hamiltonの定義に従い、卵を目的のステージまで縦方向に設置して培養します。150 millimeterのペトリ皿の縁で卵の底を割り、底から殻を引き離して中身を皿に移します。鈍端鑷子を用いて、卵黄から粘性の高い濃い白質を除去してください。次に、円形のフィルターペーパーの中央に穴を開けます。ろ紙リングの1枚を、リングの中央の穴から胚が見えるように卵黄の上に置きます。マイクロシザーを用いて、ろ紙リングの外周に沿って切り取ります。次に、胚が付着したろ紙を微細ピンセットで卵黄から取り出し、胚をPBS溶液に浸して穏やかに洗浄します。付着した卵黄粒子を除去するため、ろ紙アセンブリを35 millimeterの培養皿に移します。胚を腹側が上になるように配置し、2枚目のフィルターペーパーリングで固定します。それを金属リングで固定し、胚を培養液に浸します。胚が完全に浸かっていない場合、異常に高い表面張力の負荷によって、組織の形状およびその後の形態形成が大きく変化する可能性があります。培養中、明視野顕微鏡を用いて、形態および胚ステージが適切であることを確認します。まず、少量の鉄粉を取り、飽和染料とアルコールを数滴加え、引き伸ばしたマイクロピペットの先端で風乾させます。凝集した鉄粒子を分散させ、マイクロ遠心チューブに移します。イオン水で数回洗浄した後、採取した胚を背面側にした状態で、十分な量の培地を満たした35 mm培養皿に置きます。解剖顕微鏡下で、ガラスニードルを用いて卵膜を除去し、電皮細胞を露出させます。次に、ラベル化された鉄粒子をペーラーピペットで吸い上げます。解剖顕微鏡を用いて、ピペットを胚の直上の位置まで浸します。ピペットを指先でゆっくりと前後に転がし、胚の上に粒子を散布します。37 °Cで10分間インキュベートした後、強力な磁石を用いて粒子を除去します。必要に応じて、磁石を磁性を持つ精密ピンセットに取り付け、その磁化されたピンセットを使用して、残留している鉄粒子を慎重に取り除きます。続いて、胚の明視野像および蛍光像を取得してください。22ゲージの針を用いて。PBSに分散させた直径10 µmの黒色マイクロスフィア溶液を10 ccシリンジに吸い込みます。次に、コンピュータのハードドライブを用いて、引き伸ばしたガラス針の先端を面取りし、ビーズ溶液を満たします。マイクロマニピュレーターを用いて、溶液が先端に到達するようにマイクロピペットを軽く叩きます。ガラス針を胚と同じ視野内に配置します。ピペットチップからビーズが流出していることを確認してください。次に、ピペットチップを脳管の管腔内に挿入します。組織の腹側底部を突き破らないように注意します。ビーズと液体が腔内に注入される際の、組織の一時的な膨張を確認してください。その後、速やかにガラス針を抜去します。最後に、ブレインチューブの内腔に十分な密度のビーズが存在することを確認します。明視野顕微鏡を用い、明視野画像または光干渉断層計（OCT）データセットを取得する前に、ビーズを20〜30分間静置させます。最初の画像を取得した後、最大7枚の35 mm培養皿に入ったサンプルを150 mmペトリ皿に入れ、アセンブリ全体を小さなプラスチック袋に入れます。加湿のため、バッグに脱イオン水を数滴加え、次に95%酸素と5%二酸化炭素の混合ガスでバッグを満たします。次回のイメージング時点まで、胚を37 °Cのインキュベーターに入れます。ラベル付けした胚を、1.2 mLの培養液を含むdelta Tディッシュに入れ、37 °Cに保持されたガラス蓋でディッシュを覆います。ミニポンプ可変流量装置から供給される95% O2 5% CO2混合ガスで胚にスーパーフューズ（超灌流）を行います。次に、所定の時間間隔で画像を自動取得するようにソフトウェアを設定します。実験の過程において、ラベルは自動または手動で追跡することができ、マーカー座標に基づいて形態形成歪みマップを算出することが可能です。本手法では、頭部折り畳み形成時における電気皮膚細胞の挙動をラベル化し追跡するために、鉄粒子法が用いられました。初期のニワトリ胚において、蛍光ラベル化した細胞を胚全体に分布させました。ex ovo培養中の異なる間隔で、胚の明視野像および蛍光像を撮影しました。これは、トラクトラベルの動きをモニタリングするためです。蓄積されたデータを用いることで、頭折り畳み形成過程における形態形成ひずみ分布の進展を算出することが可能になります。同様に、ポリスチレンマイクロスフィア法を用いて、初期ニワトリ脳の中脳後脳境界における組織運動を追跡した。ビーズが脳の内腔のあらゆる面に付着する傾向があるため、この手法は明確な3次元的変形を扱うことが可能である点に注目されたい。6時間のビーズ運動の追跡後、マーカー座標からひずみを算出することで、縦方向および円周方向の組織変形を特性化した。このビデオを視聴することで、組織培養とラベル付けを自ら実施するために必要な実験手順のいくつかを十分に理解できるはずです。ここで紹介するプロトコル手法は、天然組織への侵襲性が最小限であること、また低コストで入手しやすい材料を使用しているという点で特に有利です。これらの実験は、胚発生のメカニズムに関する研究に特に有用です。標識細胞の追跡運動を用いて算出された変形場は、形態形成の物理モデルの検証と構築の両方に利用できるためです。

tracking-morphogenetic-tissue-deformations-in-the-early-chick-embryo

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Biology

生物学

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初期のニワトリ胚の形態形成の組織の変形を追跡

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