初期のニワトリ胚の形態形成の組織の変形を追跡

本手法の全体的な目的は、初期発生における形態形成的な変形を測定するために、胚組織の標識および培養を行うことです。鶏胚初期の培養を開始するには、まずフィルターペーパーキャリア法を用いて卵から胚を取り出します。実験的な用途に応じて、抽出した胚を、磁性鉄粒子で導入する蛍光親油性染料またはポリスチレンマイクロスフィアで標識します。次に、蛍光顕微鏡または光干渉断層撮影（OCT）イメージングを用いて、培養中の標識を追跡します。

得られた形態形成ひずみマップをイメージングすることで、2次元および3次元の両方において、組織の伸長、短縮、およびせん断が生じている領域を特定できます。こんにちは、私はBen Philisです。セントルイス・ワシントン大学生体医工学部のLarry Tabor博士の研究室に所属する大学院生です。この種の実験を開始する前に、モデルシステムにおける適切な組織培養技術、利用可能なイメージング手法、および実験から得たいデータの種類について検討することが重要です。

例えば、組織の変形を2次元または3次元で分析することに関心がありますか？本日は、ニワトリ初期胚における2つの相補的な標識技術を紹介することで、これらの疑問のいくつかに答えます。こんにちは、私はビクター・ヴァーナーです。セントルイスのワシントン大学にあるラリー・テイバー博士の研究室で働いています。

これら2つの手法では、ニワトリ胚の初期段階において、数百個の細胞を迅速かつ同時に標識します。これらの標識の動きを追跡することで、これらの細胞が最終的にどの組織に定着するかを特定できるだけでなく、初期胚を形成する組織レベルの変形を定量化することも可能になります。まず、Hamburger-Hamiltonの定義に従い、卵を目的のステージまで縦方向に設置して培養します。

150 millimeterのペトリ皿の縁で卵の底を割り、底から殻を引き離して中身を皿に移します。鈍端鑷子を用いて、卵黄から粘性の高い濃い白質を除去してください。次に、円形のフィルターペーパーの中央に穴を開けます。

ろ紙リングの1枚を、リングの中央の穴から胚が見えるように卵黄の上に置きます。マイクロシザーを用いて、ろ紙リングの外周に沿って切り取ります。次に、胚が付着したろ紙を微細ピンセットで卵黄から取り出し、胚をPBS溶液に浸して穏やかに洗浄します。付着した卵黄粒子を除去するため、ろ紙アセンブリを35 millimeterの培養皿に移します。

胚を腹側が上になるように配置し、2枚目のフィルターペーパーリングで固定します。それを金属リングで固定し、胚を培養液に浸します。胚が完全に浸かっていない場合、異常に高い表面張力の負荷によって、組織の形状およびその後の形態形成が大きく変化する可能性があります。

培養中、明視野顕微鏡を用いて、形態および胚ステージが適切であることを確認します。まず、少量の鉄粉を取り、飽和染料とアルコールを数滴加え、引き伸ばしたマイクロピペットの先端で風乾させます。凝集した鉄粒子を分散させ、マイクロ遠心チューブに移します。

イオン水で数回洗浄した後、採取した胚を背面側にした状態で、十分な量の培地を満たした35 mm培養皿に置きます。解剖顕微鏡下で、ガラスニードルを用いて卵膜を除去し、電皮細胞を露出させます。次に、ラベル化された鉄粒子をペーラーピペットで吸い上げます。

解剖顕微鏡を用いて、ピペットを胚の直上の位置まで浸します。ピペットを指先でゆっくりと前後に転がし、胚の上に粒子を散布します。37 °Cで10分間インキュベートした後、強力な磁石を用いて粒子を除去します。

必要に応じて、磁石を磁性を持つ精密ピンセットに取り付け、その磁化されたピンセットを使用して、残留している鉄粒子を慎重に取り除きます。続いて、胚の明視野像および蛍光像を取得してください。22ゲージの針を用いて。

PBSに分散させた直径10 µmの黒色マイクロスフィア溶液を10 ccシリンジに吸い込みます。次に、コンピュータのハードドライブを用いて、引き伸ばしたガラス針の先端を面取りし、ビーズ溶液を満たします。マイクロマニピュレーターを用いて、溶液が先端に到達するようにマイクロピペットを軽く叩きます。

ガラス針を胚と同じ視野内に配置します。ピペットチップからビーズが流出していることを確認してください。次に、ピペットチップを脳管の管腔内に挿入します。

組織の腹側底部を突き破らないように注意します。ビーズと液体が腔内に注入される際の、組織の一時的な膨張を確認してください。その後、速やかにガラス針を抜去します。

最後に、ブレインチューブの内腔に十分な密度のビーズが存在することを確認します。明視野顕微鏡を用い、明視野画像または光干渉断層計（OCT）データセットを取得する前に、ビーズを20〜30分間静置させます。最初の画像を取得した後、最大7枚の35 mm培養皿に入ったサンプルを150 mmペトリ皿に入れ、アセンブリ全体を小さなプラスチック袋に入れます。

加湿のため、バッグに脱イオン水を数滴加え、次に95%酸素と5%二酸化炭素の混合ガスでバッグを満たします。次回のイメージング時点まで、胚を37 °Cのインキュベーターに入れます。ラベル付けした胚を、1.2 mLの培養液を含むdelta Tディッシュに入れ、37 °Cに保持されたガラス蓋でディッシュを覆います。ミニポンプ可変流量装置から供給される95% O2 5% CO2混合ガスで胚にスーパーフューズ（超灌流）を行います。次に、所定の時間間隔で画像を自動取得するようにソフトウェアを設定します。

実験の過程において、ラベルは自動または手動で追跡することができ、マーカー座標に基づいて形態形成歪みマップを算出することが可能です。本手法では、頭部折り畳み形成時における電気皮膚細胞の挙動をラベル化し追跡するために、鉄粒子法が用いられました。初期のニワトリ胚において、蛍光ラベル化した細胞を胚全体に分布させました。

ex ovo培養中の異なる間隔で、胚の明視野像および蛍光像を撮影しました。これは、トラクトラベルの動きをモニタリングするためです。蓄積されたデータを用いることで、頭折り畳み形成過程における形態形成ひずみ分布の進展を算出することが可能になります。

同様に、ポリスチレンマイクロスフィア法を用いて、初期ニワトリ脳の中脳後脳境界における組織運動を追跡した。ビーズが脳の内腔のあらゆる面に付着する傾向があるため、この手法は明確な3次元的変形を扱うことが可能である点に注目されたい。6時間のビーズ運動の追跡後、マーカー座標からひずみを算出することで、縦方向および円周方向の組織変形を特性化した。

このビデオを視聴することで、組織培養とラベル付けを自ら実施するために必要な実験手順のいくつかを十分に理解できるはずです。ここで紹介するプロトコル手法は、天然組織への侵襲性が最小限であること、また低コストで入手しやすい材料を使用しているという点で特に有利です。これらの実験は、胚発生のメカニズムに関する研究に特に有用です。

標識細胞の追跡運動を用いて算出された変形場は、形態形成の物理モデルの検証と構築の両方に利用できるためです。