Name: 識別のためのアレロタイプ化PCRサルモネラ血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス菌 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 学ぶ多重PCR法によるSalmonella enterica血清型の迅速識別。Enteritidis、Hadar、Heidelberg、Typhimuriumを対象としたアレロタイプ化PCRで、食の安全と疫学研究に貢献します。

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この作品は、米国農務省の助成1999-35212-8680、2005から01378まで、および2010-04288-01、USDAフォーミュラファンドとグルジアの獣医学農業研究助成の状態によってサポートされています。ジョージア大学で米博4900L、GENE 4960H、BCMB 4960L、およびBIOL 4960HとMaurer氏にいくつかの分子疫学の研究プロジェクトに学生が使用する：この文書に記載されているプロトコルは、指示の研究コースの一環として、学部生が使用するために開発された実験室。我々は、研究と学部教育を統合するための努力を支援するためのマウラーとリー研究室における研究、そして私たちの学科長、ジョングリッソンを実行している多くの学部学生に感謝したい。

<ol><li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 Forthcoming.</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg%2C+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. ofacre, Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. aurer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li>
<li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li>
<li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li>
<li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory%22">Molecular cloning: a laboratory</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).</li>
<li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

属（例：invA）に固有のサルモネラの標的遺伝子を検出するための最も市販のPCRテスト。ただし、すべてのサルモネラは動物の個体数の人間や有病率で病気を引き起こす能力に等しいです。 サルモネラ LPS O -抗原とflagellinH1とH2抗原の抗原性の違いの早期発見は、これらの抗原性の違いに基づいて、2,500以上の血清型にサルモネラの分化にリードしている。 サルモネラ属に同定された46の異なるO抗原と86の異なるフラジェリン（H）抗原があります。 サルモネラ一 （H1）または2つの異なる（H1＆H2）flagellinsを持っている可能性があります。今日認識さ2500 サルモネラの血清型の異なるOの組み合わせ、H1、およびH2抗原のアカウント。血清型は、個々のOとH抗原の同定から得られた抗原式に基づいて割り当てられます。式はOのように書かれている抗原：H1：H2、および&quot; - &quot;、O -抗原に対して陰性サルモネラ用H1またはH2フラジェリンと&quot;NT&quot;（非入力可能）の不在を指します。例えば、血清型ネズミチフス菌はS.に割り当てられます。 G、M：：-. Enteritidisが、数式D1と分離するために与えている間に1,2：I：entericaは抗原式Bで分離するサルモネラ集団におけるこの抗原変異は、したがって、容易にPCRによって悪用される可能性ヌクレオチドレベルでの相違点の外側に現れています。 我々は識別S.ためアレロタイプ化PCRを開発するために特定のOとHの対立遺伝子に関連付けられている遺伝的差異を同定したenterica血清型：サルモネラ、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス菌（3）。ハイデルベルク（B、ハダル（E、N、X C2：：Z10）、 - （D1：：G、M）サルモネラのためにH2抗原式：H1： サルモネラ血清型の正しい割り当ておよびレポートは、Oに関連付けられているすべての対立遺伝子のためにテストする必要があります：R：1,2）、及びネズミチフス菌（B：I：1,2）。 Oの対立遺伝子または抗原、H1 gの発見に関する知識がなくても、単独でm個の対立遺伝子は、必ずしもサルモネラは他のサルモネラの血清型としてEnteritidisのように分離識別するものではありません：Agona、カリフォルニア州、そしてモンテビデオ、またこの同じ対立遺伝子を持っている。アレロタイプ化PCRは、もともとサルモネラの血清型を説明した前面を検出するために設計されていますが、このテストではさらに19血清型（表3）を識別することができます。私たちのアレロタイプ化PCRは、もともとOとHの対立遺伝子を検出するように設計された。私たちはO -特異的抗血清を使用して、ではなく、isolated サルモネラの培養で作業するときOアレロタイプ化PCRを行うこと、スライド凝集試験によってO -抗原を識別するための練習では、それはより実用的かつ効果的なコストとなっています。しかし、我々は、ラボの画面（2）として、またはサルモネラが FTAカード（6）に提出された分離株と入力し、このPCRを使用している場合はOアレロタイプ化PCRを使用することをお勧めします、そしてサンプルの最初の画面でサルモネラ特異的PCR（4が含まれていますか）。 PCRまたは抗原/生化学検査でサルモネラと識別されたサンプルだけにアレロタイプ化PCRを制限する。 この資料に記載されているプロトコルは、アイダホテクノロジーRapidcycler、1つは反応容量を縮小することを可能にし、多くの加熱ブロックサーモよりも短い時間での反応条件を実行して熱風クラーで使用するために最適化されています。プライマー濃度を調整する;またはMgCl 2の濃度を調整し、加熱ブロックサイクラーで使用するためにこのプロトコルを適応するには、アニーリング温度を下げる/上げることによって経験的に反応条件の最適化が必要になる場合があります。例えば、我々は、PTC - 200サーマルサイクラーは以下のようにMJリサーチのためのプロトコルを適応しなければならなかった。表1で説明したのと同じ反応ボリュームでの作業、作業用ストックconcentrationof私のプライマーセットを2.5μMに希釈し、アニーリング温度は、アニーリングと伸長反応ステップ、変性は55℃から45℃、およびインキュベーション時間を低下させたI / G、Mアレロタイプ化PCRのために20秒に延長されました。適切な陽性および陰性コントロールを持つことは、公開プロトコルを含むあらゆるPCRの初期のスタートアップと最適化、に不可欠です。 、ハダル（C2：Z10：E、N、X）、ハイデルベルク（B：R - 、サルモネラ（D1：：G、M）我々は特にAnatum（：：E、H 1,6 E1）、知られているサルモネラの血清型を取得することをお勧め：1,2）、モンテビデオ（C1：G、M、S：1,2,7）とネズミチフス菌（B：I：1,2）、および実験室大腸菌 K12株（DH5α、LE393、JM109など）はそれぞれこの資料に記載されているアレロタイプ化PCR検査の陽性コントロールと陰性コントロールとして。これらのサルモネラの血清型のいくつかはテストされている対立遺伝子に応じて、正または負のコントロールとして機能します。 特定の予防措置とガイドラインは、これと他の診断PCRを行いながら、続いする必要があります。最初に、物理的な分離テンプレートの準備から、PCRは、セットアップ、およびゲル電気泳動では、汚染と偽陽性の誤った報告可能なPCRのキャリーオーバーを防止するのに重要です。これらのコントロールは、彼らが発生したときに問題を特定し、その結果（5）の解釈を助けるように加えて、適切なコントロールを含めることは、あらゆるルーチンPCRに必要です。最も重要なことは、一貫性は、特にアンプリコンの大きさのアンプリコン（PCR産物）の検出andestimationのための電気泳動条件に関しては、必要不可欠です。この点を説明するために、我々は故意に、図1Aに意図したよりも早く電気を一時停止。分子量標準（レーン1及び13）及び陽性対照（レーン2）が十分に正確なサイズを見積もるやサイズのわずかな違い（〜50塩基）が存在するDNA断片の分離を観察するために分離されていません。 DNA断片の十分な分離、特に分子量の基準は、陽性を報告すると、アンプリコンの大きさと時々あらゆるPCRの毎日ランニング（5で観察される非特異的アンプリコンから区別する&quot;真の陽性&quot;の正確な推定に依存するように不可欠である）。例えば、図1B、レーン7（サイズは〜700塩基対）の非特異的アンプリコンがあります。色素フロントがアガロースゲル中の半分の方法ポイントでのみだったとき、あまりにも早く電気泳動を中止していた、500 bpと700bpのDNA断片の間にはほとんど区別があるでしょう。従って、レーン7のサンプルが誤って両方のiとg、m個の対立遺伝子陽性と報告されているでしょう。 最後に、1つは、任意のテストに関連付けられている限界を認識する必要があります。 1,5; 1,6、1,7抗原複合体、E、N、X / E H1/H2アレロタイプ化PCRのいくつかは、H2 1,2に属する遺伝子の微妙な遺伝子の違いを識別するために差別的な力を持っていない、N、G、m個の対立遺伝子を含むZ15抗原複合体とH1 Gの抗原複合体、。つまたは2つのアミノ酸の変化は、これらの鞭毛抗原に存在する異なるエピトープを占めている。私たちはフラジェリン遺伝子配列（3）でこれらの時々、単一の塩基対の違いを悪用する可能性プライマーを設計することは困難であった。例えば、 サルモネラ血清型ダブリン（D1：G、P： - ）とベルタは（D1：F、G、T： - ）プライマーをmallelotyping、私たちのgでもPCR陽性である。 H2のアレロタイプ化プライマーは、ネズミチフス菌を区別することはできない（B：I：1,2）ラゴスから（B：I：1,5）、ハイデルベルク（B：1,2：R）ブラッドフォード（：R：B 1,5）から、グロストラップから（C2：Z10：E、N、Z15）ウィネバ（B：R：1,6）、またはサンレモ（B：R：1,7）、またはハダル（E、N、X C2：：Z10）。これらの血清型のいくつかが発生する可能性が：ラゴス、ブラッドフォード、ウィネバ、サンレモまたはGlustrupがリモートである、それは可能であり、どちらかのテスト&quot;の制限または別の確認検査に免責事項を提供する必要があります。 結論として、このPCRベースの血清型別では、急速にS.を識別します。 enterica血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルクとネズミチフス菌、及びO、H1、およびH2の対立遺伝子は、19追加の血清型に関連付けられている。このアッセイは、血清型のサルモネラに従来の微生物学的ア ​​プローチへの迅速、費用対効果の高い選択肢です。

<table border="1"><tbody><tr><th>材料名</th><th>タイプ</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>ルリアベルターニ</td><td></td><td>フィッシャー</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td> 1.5 mlの容量</td><td>フィッシャー</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>エタノール</td><td> 200プルーフ</td><td>フィッシャー</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>のdH 2 O </td><td>分子生物学グレード</td><td>シグマ</td><td></td><td> （または任意の同等の源、PCRのみ） </td></tr><tr><td> 10 × PCRバッファー： </td><td> 20mMのMgCl 2の </td><td>アイダホテクノロジー</td><td></td><td> （バッファがBSA、フィコールおよびタートラジンに付属） </td></tr><tr><td></td><td> 30mMのMgCl 2の </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40mMのMgCl 2の </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCRプライマー</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>のdNTP </td><td></td><td>ロッシュ</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td> Taq DNA ポリメラーゼ </td><td></td><td>デンヴィル</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>キャピラリーピペット</td><td> 10μlの体積</td><td>アイダホテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>急速なサイクラー</td><td></td><td>アイダホテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>低いEEO、分子生物学グレード</td><td> BioRad社</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td> 50 X TAEバッファーまたは5X TBEバッファー</td><td></td><td>フィッシャー</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td></td><td> BioRad社</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>水平、ゲル型と潜水ゲル電気泳動槽</td><td></td><td> BioRad社</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>電源</td><td></td><td> BioRad社</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>分子イメージャーゲルドックシステム</td><td></td><td> BioRad社</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr></tbody></table> 表4。材料

識別のためのアレロタイプ化pcrサルモネラ血清型enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス菌

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

この属に特有のサルモネラの標的遺伝子を同定するための現在の商業的なPCRのテスト。しかし、そこに二つの種六亜種、2,500以上の異なるサルモネラの血清型があり、すべてではないが、公衆衛生への重要性に等しい。例えば、S.を見つけるテーブルの卵の層のファーム上にenterica亜種 IIIaのアリゾナ州は、S.の分離に比べて重要ではありませんenterica亜種I血清型Enteritidisは、テーブルの卵の消費量にリンクされているサルモネラ症の主要原因。血清型は、抗原リポ多糖の違い（LPS）（O抗原）とフラジェリン（H1とH2抗原）に基づいて識別されます。これらの抗原性の違いは、この表現型に関連付けられている遺伝子と遺伝子の対立遺伝子の多様性の外観です。 我々は、4つの主要S.間の遺伝的差異のキーというアレロタイプ化、マルチプレックスPCRを開発しているenterica亜種私血清型は家禽で発見し、米国における重要なヒトの疾患に関連付けられている。 PCRのプライマーペアは、特定のサルモネラの血清型に固有の鍵となる遺伝子またはシーケンスを対象に、その遺伝子または対立遺伝子の特定のサイズのアンプリコンを生成するように設計。 サルモネラ血清型は、特定のLPSのためのPCR検査の結果の組み合わせに基づいて分離するために割り当てられていたとフラジェリン遺伝子の対立遺伝子。この資料に記載されている多重PCRはS.の検出のための固有のものですenterica亜種I血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス菌。 ここでは、分離サルモネラについては血清型を識別するマルチプレックスPCRを使用する方法を示します。

我々はサルモネラ血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、およびネズミチフス菌の迅速検出のためのマルチプレックスPCRを説明します。特定のサルモネラの血清型は、特定の血清型のO -抗原の生合成クラスターとフラジェリンに固有の遺伝子との配列とPCRマルチプレックスを標的とすることで識別できます。血清型は、ターゲットの対立遺伝子に対応する固有の、大きさのアンプリコン（PCR産物）の外観に基づいて、分離株のサルモネラにして割り当てられています。

識別のためのアレロタイプ化PCRサルモネラ血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス菌

サルモネラ属を特定するための現在の市販PCR検査は、本属に特有の遺伝子を標的としています。しかしながら、2つの種、6つの亜種、そして...以上の

本実験の全体的な目的は、サルモネラの特定の抗原アレルを特定することです。これは、これらのアレルに関連する特定の配列差を特定するためにターゲットPCRを行うことで達成されます。サンプルテンプレートを、アレル特異的プライマーを含むPCR反応ミックスに加え、OH1およびH2アレルタイピングを行います。サーモサイクラーを用いてPCRを実施します。次に、PCRサンプルをゲル電気泳動でサイズ別に分離し、各サンプルにアンプリコンが存在するかどうかの確認およびそのサイズの特定、またはアンプリコンの単離を行います。その後、アンプリコンのサイズをPCRで使用した各プライマーセットの期待されるサイズと照らし合わせ、特定のサルモネラ抗原の同定を示すPCR結果を得ます。PCRによるアレル判定後、OH 1およびH 2のマルチプレックスPCRアッセイの結果に基づいてセロバー指定が行われます。本動画で解説するプロトコルのSYPに対する主な利点は、迅速であり、判定がより容易で、コストを低く抑えられることです。この手法は、家禽農場や酪農場内または農場間におけるsalmonella VARsの分布や持続性の特定など、疫学分野におけるいくつかの重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の意義は、Salmonella serovar AriusまたはUrianに起因するサルモネラ症の迅速診断にまで及びます。このPCR法を用いてサルモネラを血清型レベルまで型別する方法を理解するには、本手法の視覚的な実演が不可欠です。本手順の実演は、ジョージア大学のLee Mauer研究室の研究員であるAdriana PedrosoとYin Changが行い、後続のPCR反応のための全細胞DNAテンプレートを調製します。まず、1 mLのLBブロスにサルモネラを接種します。単一コロニーから分離してください。培養液を200〜250 rpmの振盪条件下、37 °Cの温度でインキュベートします。翌日、1 mLの培養液を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、4,500 ×gで約2分間遠心分離して細胞をペレット化します。次に上清を吸引し、細菌ペレットを1 mLの100% Ethanolで再懸濁します。エタノール懸濁細胞を室温で10分間インキュベートし、その後、先ほどと同様に細胞を遠心分離します。ペレットを1 mLのPBSで再懸濁します。遠心分離後、上清を吸引し、ペレットを1 mLの滅菌蒸留水で再懸濁します。最後に、細胞懸濁液を希釈します。蒸留水で20倍に希釈し、PCR調製を行うまで最大1か月間、−20°Cで保存します。PCR反応液の分注は、物理的に分離された部屋で行い、できればUVライトを備えた専用のPCRワークステーションで実施する必要があります。まず、UVライト照射および10%次亜塩素酸ナトリウムによる拭き取りで、作業面を汚染除去します。次に、PCR作業専用のピペットと、バリアチップを使用して操作します。まず、プライマーを蒸留水で5 × 10⁻⁴ Mに希釈し、マスタープライマーストックを作成します。次に、このストックを蒸留水で20倍に希釈し、25 µMのワーキング濃度にします。PCR試薬と全細胞テンプレートをフリーザーから取り出し、氷上で解凍します。tac DNAポリメラーゼは、使用するまで冷凍庫で保管してください。書面によるプロトコルの表1に従って、PCR試薬を混合します。次に、PCR反応液を9 µLピペッティングします。滅菌済みの96ウェル丸底ポリスチレン製マイクロタイタープレートの各ウェルに混合します。第1列の最上段から開始し、列に沿って下方向へ進み、その後次の列の最上段へと移動しながら操作します。まず、陰性対照として第1ウェルに蒸留水を1 µL加えます。次に、第2ウェルのPCRミックスに陽性対照テンプレートを0.5 µL分注し、第3ウェルに e coli K 12 DH5α を1 µL加えます。3番目のサンプルテンプレートを1 µL、残りのウェルに加えます。H1-IおよびGyp PCRにおいて、Salmonella enterica CVaR TYMとEnteritidisを、それぞれIおよびGMアレルとしての陽性コントロールとして使用します。Salmonella CVaR HeidelbergおよびHaarは、rおよびz10アレルを検出するための2回目のH1アレルタイピングPCRにおける陽性コントロールとして使用します。次に、10 µL容量のガラスキャピラリーを、アイドテクノロジー用の指定されたホルダーに設置します。ラピッドサイクラーをホルダーに固定した後、ガラスキャピラリーをウェルの底に接触させ、各キャピラリーにPCR反応液を充填します。ホルダーを傾けて液体をチューブの底部まで移動させ、端部とPCR反応液の間に空間を設けます。ブタンバーナーでキャピラリーの両端を熱封止する前に、キャピラリーチューブとホルダーをIdaho Technology社製ラピッドサイクラーにセットし、各種all ELO型PCRについて、書面プロトコルの表1に記載されているサーモサイクラープログラムを使用します。サーモサイクラーのプログラムが完了したら、標準的な手順に従い、臭化エチジウムを含む15 × 10 cmの1.5%分子生物学グレードのアガロースゲルを用いて、ゲル電気泳動ステップに進みます。ゲルが凝固した後、0.25 mg/mLの溶液を200 µLあらかじめ混合した1倍TAE電気泳動バッファーを満たした浸漬型水平電気泳動槽にゲルを移します。40 µLの6倍濃度DNAローディングダイアを混合したDNA分子量マーカーを、最初、中間、および最後のウェルに4.8 µLずつロードします。次に、ホルダーからPCRサンプル反応液の入ったガラスキャピラリーを取り出し、ガラスカッターでキャピラリーの両端に切り込みを入れます。続いて、ガラスカッターで印をつけたキャピラリーの両側に両手の親指と人差し指を添えて、キャピラリーを折断します。キャピラリーディスペンサーをPCR反応液の反対側に配置し、液体がチューブの最下部に達するまで、プランジャーをゆっくりと時計回りに回します。キャピラリーを充填するウェルに挿入し、プランジャーをゆっくりと時計回りに回して、計量したサンプルをウェルに分注します。キャピラリーでウェルに穴を開けたり、液体がすべて出た後にプランジャーを回し続けてウェル内に気泡を導入したりしないよう注意してください。すべてのサンプルと標準物質の充填が完了したら、電源装置の定電圧を90 voltsに設定します。電気泳動の完了後、ゲルをUVトランスイルミネーターに移してDNA断片と分子量マーカーを可視化し、Gel Doc XRシステムで画像をキャプチャします。最後に、キャピラリーホルダーを10%漂白剤に15～30分間浸します。蒸留水で3回すすぎ、PCRセットアップルームに戻して自然乾燥させます。この最初のエチジウムブロミド染色ゲルは、Salmonella enteritidis var. Heidelberg Antifaに関連するO抗原アレルについてのマルチプレックスPCRの結果を示しています。レーン1および13には100 bp DNAラダーが含まれています。レーン2には、O抗原アレルB、C1、C2、D1、およびEのマルチプレックスPCRコントロールが含まれています。残りのレーン3から12には、サルモネラ分離株が含まれています。PCRコントロールのサイズと一致し、かつ左から右に使用したアレルプライマーセットで予測されるアンプリコンに基づいて、サルモネラ分離株にアレル指定が行われます。これらのアンプリコンサイズは、D1が620 base pairs、C2が400 base pairs、Eが280 base pairs、C1が340 base pairs、Bが560 base pairsです。この臭化イリジウム染色ゲルは、FLAゲルのalleles eyeおよびgmを同定するためのH1アレル・マルチプレックスPCRの結果を示しています。ゲルへの負荷は、先に示したものと同じ順序で行われました。ここでも、PCRコントロールとサイズが一致するアンプリコンの有無に基づき、左から右に使用した4つのH1アレルプライマーセットの予測通りに、各分離株にH1アレルが割り当てられています。アンプリコンのサイズは、GMが310 bp、Iが510 bpです。このエチジウムブロミド染色ゲルは、gellinアレルRおよびZ10を同定するためのH1アレルマルチプレックスPCRの結果を示しています。同様に、ゲルへのロードは前述と同じ方法で行われ、PCRコントロールとサイズが一致するアンプリコンの有無に基づき、使用した4つのH1アレルプライマーセットの予測通りに各分離株へH1アレルが割り当てられます。アンプリコンのサイズは、Rが170 bp、Z10が360 bpです。この手法は、適切に行えば4時間で完了できます。本手順を実施する際は、PCRキャリーオーバー汚染の可能性を最小限に抑えるため、テンプレート調製、PCRセットアップ、およびゲル電気泳動の作業場所を物理的に分けるようにしてください。

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細菌の適合性を決定するためのこの分子ベースのアプローチは、デジタルPCRを介して定量化されたユニークなゲノムDNAバーコードを使用して微生物の正確かつ正確な検出を容易にします。プロトコルは、サルモネラ株の競争力指数の計算について説明します。しかし、この技術は、遺伝的に可鍛性の生物の絶対的な定量を必要とするプロトコルに容易に適応可能である。...

サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数

ループ媒介等温増幅(LAMP)は、病原体検出分野に広く関心を集めている等温核酸増幅試験(iNAAT)です。ここでは、動物性食品中のサルモネラ菌をスクリーニングし、培養分離から推定サルモネラ菌を確認するための迅速で信頼性の高い、堅牢な方法として、マルチラボ検証されたサルモネラLAMPプロトコルを提示します。...

動物性食品中の サルモネラ菌 をスクリーニングし、培養分離から サルモネラ菌 を確認するためのループ媒介等温増幅

本稿では 、サルモネラ・チフィムリウム・ トリプトファン合成酵素の発現と精製のための一連の連続的な方法を提示し、このプロトコルは、1日でタンパク質複合体を精製するための急速なシステムをコンプする。対象となる方法は、部位特異的変異誘発、...

PCR変異生成、クローニング、発現、高速タンパク質精製プロトコルおよびトリプトファン合成酵素の野生型および変異型の結晶化

ベンチトップ機器を使用した全ゲノムシーケンス(WGS)戦略の実現可能性により、ラボ環境での公衆衛生に関連するすべての微生物のゲノム調査が簡素化されました。細菌WGSのワークフローの方法論的適応について説明し、分析のためのバイオインフォマティクスパイプラインも提示します。...

オレオクロミス属由来の病原性大腸菌株のキャラクタリゼーション 全ゲノムシーケンシングを使用する農場

学ぶ多重PCR法によるSalmonella enterica血清型の迅速識別。Enteritidis、Hadar、Heidelberg、Typhimuriumを対象としたアレロタイプ化PCRで、食の安全と疫学研究に貢献します。

識別のためのアレロタイプ化PCRサルモネラ血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス菌

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