識別のためのアレロタイプ化PCRサルモネラ血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス菌

次の実験の全体的な目標は、特定のサルモネラ抗原対立遺伝子を特定することです。これは、PCRを標的にして、これらの対立遺伝子に関連する特定の配列の違いを特定することで達成されます。サンプルテンプレートを、対立遺伝子特異的プライマーとOH 1およびH 2対立遺伝子タイピングを含むA PCR反応ミックスに添加します。

PCRはサーモサイクラーで実行されます。次に、PCRサンプルをゲル電気泳動を使用してサイズごとに分離し、各サンプルにアンプリコンが存在する場合はサイズを決定するか、またはそれを単離します。次に、アンプリコンのサイズは、特定のサルモネラ抗原の同定を示すPCR結果で使用された各プライマーセットの予想サイズと相関します。

次に、PCR SEROVAR指定による対立遺伝子は、OH 1およびH 2マルチプレックスPCRアッセイの結果に基づいて与えられます。このビデオで説明されているプロトコルのSYPに対する主な利点は、迅速で解釈が容易で、安価であることです。この方法は、家禽農場または酪農場間または酪農場間におけるサルモネラVARの分布と持続性の決定など、疫学の分野におけるいくつかの重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の意味するところは、サルモネラ菌、血清菌、アリウス菌、または尿酸菌に起因するサケ症の迅速な診断にまで及びます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、このPCRベースの方法を使用してサルモネラ菌を血清型レベルまで分類する方法を理解するために重要です。この手順を実証するのは、ジョージア大学のリー・マウアー研究所のアドリアナ・ペドロソとイン・チャンの研究科学者で、その後のPCR反応のための全細胞DNAテンプレートを準備します。

まず、1ミリリットルのLBブロスにサルモネラ菌を接種します。単一のコロニーから分離します。毎分200〜250回転、インキュベーション温度37°Cで振とうしながら培養物をインキュベートします。

翌日、1ミリリットルの培養物を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、4、500倍の重力で約2分間懸濁液を遠心分離し、次に細胞をペレット化し、次にサップ被曝液を吸引し、次いで100%エタノールの1ミリリットルで細菌ペレットを再懸濁し、エタノール懸濁細胞を室温で10分間インキュベートし、その後、以前と同様に細胞に遠心分離します。ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します 遠心分離後、仰臥位を吸引し、ペレットを1ミリリットルの滅菌蒸留水に再懸濁します。最後に、細胞懸濁液を希釈します。

20分の1を蒸留水で、PCRを行う準備ができるまで摂氏マイナス20度で最大1ヶ月間保存します PCR反応ミックスの調製と分注は、物理的に別の部屋で行う必要があり、できればUVライトを備えた専用のPCRワークステーションで行う必要があります。まず、UVライトと10%漂白剤で拭き取り、作業面を除染します。次に、PCR作業専用に指定され、バリアピペットチップが取り付けられたピペットを使用します。

最初に蒸留水でプライマーをマイナス4モルの10の5倍に希釈して、マスタープライマーストックを作成します。次に、ストックを蒸留水で20分の1に希釈して、25マイクロモルの作業濃度を達成します。PCR試薬と全細胞テンプレートを冷凍庫から取り出し、氷上で解凍します。

tac DNAポリメラーゼは、必要になるまで冷凍庫に入れておきます。PCR試薬は、書かれたプロトコルの表1に従って組み合わせます。次に、PCR反応の9マイクロリットルをピペットで拾います。

滅菌済みの96丸底ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルに混合します。最初のカラムの上部から始めて、カラムを下に移動し、次に次のカラムの上部に移動し、1マイクロリットルの蒸留水を最初のウェルに追加して、ネガティブコントロールとして機能します。次に、0.5マイクロリットルのポジティブコントロールテンプレートを第2のウェルのPCRミックスに分注し、1マイクロリットルの大腸菌K12 DH 5アルファを第3のウェルに分注します。

H one Iおよび石膏PCRサルモネラ腸腫、CVaR、TYMおよび腸炎のための残りの井戸に第3のサンプルテンプレートの1マイクロリットルをよく加えることは、それぞれ目およびGM対立遺伝子のための肯定的な対照として役立つ。サルモネラ菌CVaR、ハイデルベルグ、およびハールは、それぞれrおよびz10対立遺伝子を検出するための2番目のH1対立遺伝子タイピングPCRで使用される陽性コントロールです。次に、10マイクロリットルの容量のガラスキャピラリーをアイダホテクノロジーの指定ホルダーに配置します。

ラピッドサイクラーをホルダーに固定したら、各ガラスキャピラリーにPCR反応ミックスをロードします。ホルダーを傾けて液体がチューブを下に移動し、端部とPCRミックスの間にスペースを確保します。ブタントーチでガラス管をヒートシールして毛細血管の両端をシールする前に、毛細管とホルダーをアイダホテクノロジーラピッドサイクラーに入れ、PCRの異なるすべてのELOタイプについて書かれたプロトコルの表1に記載されているサーモサイクラープログラムを使用します。

サーモサイクラープログラムが完了したら、15 x 10 cmのゲル電気フェレーシスステップに進みます。1.5%分子生物学グレードの臭化ジウムを含むゲルが標準的な手順に従って発生しました。ゲルが固まったら、0.25ミリグラム/ミリリットルのTAE電気泳動緩衝液200マイクロリットルを1倍プレミックスした水中水平電気泳動チャンバーにゲルを移します。

DNA分子量マーカーは、40マイクロリットルの6倍のDNAローディング色素負荷、4.8マイクロリットルのプレミックスDNA分子量マーカーを最初の中間および最後のウェルに含んでいます。次に、PCRサンプル反応の入ったガラスキャピラリーをホルダーから取り出し、キャピラリーの両端をガラスカッターでエッチングします。次に、ガラスカッターでマークされたキャピラリーの両側に両手の親指と人差し指を置き、キャピラリーをスナップし、キャピラリーディスペンサーをPCR反応ミックスの反対側の端に置き、液体がチューブの一番下になるまでプランジャーを時計回りにゆっくりと回します。

キャピラリーをロードするウェルに入れ、プランジャーを時計回りにゆっくりと回して、フォロ加重サンプルをローズに分注します。キャピラリーでウェルに穴を開けたり、最後の液体がキャピラリーを離れた後もプランジャーを回し続けてウェルに気泡を入れたりしないように注意してください。すべてのサンプルとスタンダードがロードされたら、電源の定電圧を90ボルトに設定します。

電気泳動が完了したら、ゲルをUVトランスイルミネーターに移し、DNA断片を可視化し、ゲルドックXRシステム上で分子量標準画を撮影します。最後に、キャピラリーホルダーを10%漂白剤に15〜30分間置きます。蒸留水で3回すすぎ、PCRセットアップルームに戻って自然乾燥させます。

この最初の臭化アテリウム染色ゲルは、サルモネラ腸var、腸炎、ハッダHeidelberg.Antifaに関連するO対立遺伝子のマルチプレックスPCRの結果を示しています。レーン 1 と 13 には 100 ベース ペアが含まれています。DNAラダー。

レーン2は、O対立遺伝子B、C1、C2、D1、およびEのマルチプレックスPCRコントロールを含み、残りのレーン3〜12はサルモネラ分離株を含む。サルモネラ菌分離物には、PCRコントロールのサイズに一致するアンプリコンに基づいて、左から右に使用された対立遺伝子プリマセットの予測に基づいて対立遺伝子の指定が与えられます。これらのアンプリコンサイズは、D1 620塩基対、C、2、400塩基対、E1、280塩基対、C1 340塩基対、B560塩基対である。

この臭化イリジウム染色ゲルは、対立遺伝子の眼およびgmのFLAゲルを同定するためのH one対立遺伝子マルチプレックスPCRの結果を示しています。ゲルは、前に示したのと同じ順序でロードしました。ここでも、H one対立遺伝子は、PCRコントロールにサイズが一致するアンプリコンの存在に依存し、左から右に使用された4つのH one対立遺伝子プライマーセットについて予測されるように、各分離株に割り当てられます。

アンプリコンのサイズは、GM 310塩基対とI 510塩基対です。この脊髄臭化アテリウム染色ゲルは、ゲリン対立遺伝子rおよびz10を同定するためのH one対立遺伝子マルチプレックスPCRの結果を示しています。再度、ゲルを前に示したのと同じ方法でロードし、H1対立遺伝子をPCR制御にサイズが一致するアンプリコンの存在に依存して各分離物に割り当て、使用された4つのH 1対立遺伝子プライマーセットについて予測されたように、アンプリコンサイズはR 170塩基対およびZ10 360塩基対をマスターするとよい。

この手法は、適切に実行すれば4時間で実行できます。この手順を試行する際は、PCRキャリーオーバーコンタミネーションの可能性を最小限に抑えるために、テンプレート調製PCRセットアップとゲル電気泳動を物理的に分離することを忘れないでください。