Name: ショウジョウバエの蛹の腹部の免疫組織化学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぶショウジョウバエ蛹の腹部上皮組織の免疫組織化学法。解剖と抗体染色により、上皮形態形成と組織再編成を可視化し、性二形形態の発生メカニズムを解明する。

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この作品は、全米科学財団からの助成金によって支えられている。

1。日1 始める前に： ハエの健全な人口は、標準的な培養のプロトコルを使用して維持する必要があります：卵レイと開発は第3齢幼虫がpupariationを開始放浪するまで一定温度での続行を許可するの3-4日後にボトルやバイアルから大人を削除します。幼虫/蛹の遷移がprepupae（0時間蛹殻形成- APFの後に考えられる）の形成によってマークされています。不動の蛹はその白の着色により、以前の蛹から、まだ彼らの細長い、丸みを帯びた形状と前部気門の突起によってpupariationを開始していない幼虫から区別される。 次のものが必要です。 <ul><li>蛹を収集するためのペイントブラシ</li><li>培養蛹のための湿気のあるチャンバー：ペトリ皿は、接液ペーパータオルで並んでと蛹の収集、遺伝子型または性別の種々の時点のマークが付けられたフィルターの紙で覆われ</li><li> 1Xリン酸は、サナギを洗浄するための緩衝食塩水（PBS） </li></ul>収集、培養およびステージング蛹<ol><li>接液絵筆を使用すると、静かに培養ボトル/バイアルから0hr APFのサナギを削除し、湿気のあるチャンバーの蓋に置いてください。 </li><li>絵筆と1X PBSを使用すると、そっと蛹のケースから破片を除去するためにサナギを洗う</li><li>必要に応じてソート性別によるサナギの場合。蛹の生殖巣原基は、男女をソートするために使用することができます。男性の生殖腺原基は容易に蛹クチクラを通して約2 / 3体5の長さがダウンして見られる半透明のディスクの横方向のペアです。女性の生殖腺原基は小さく、同じように簡単に識別されません。 </li><li>湿度の高い室で適切にラベルの位置にサナギを置き、一定温度に戻ります。適切な発達時点まで文化。 </li></ol> 2。 2日目：解剖、固定し、一次抗体のインキュベーション始める前に： 次のものが必要です。 <ul><li>解剖顕微鏡</li><li>手術用鉗子</li><li> 11番ブレードを外科用メス</li><li>二九もガラスのうつ病の皿（コーニングの製品＃7220〜85） <ul><li> 1X PBSで一皿の井戸を埋める：これは、切除した蛹を洗浄するための洗浄皿です。 </li><li>固定バッファで2皿の井戸を埋める</li></ul></li><li>抗体のインキュベーションのための湿気のある部屋。我々は、接液ペーパータオルを敷いたプラスチック製の密閉式サンドイッチボックスを使用してください。 </li><li>固定バッファ：1X PBS、4％パラホルムアルデヒド、0.2％デオキシコール酸（透過化用） </li><li>解剖プラットフォーム：片側に接着した両面テープの切れ端でクリア顕微鏡用スライド</li><li> 1X PBS </li><li> P100やP200ピペッター</li></ul>解剖<ol><li>鉗子を使用すると、静かに一度蛹つを削除し、テープの広い幅が直面している蛹の前端と解剖のプラットフォーム上に置きます。蛹は過度にぬれた場合は、最初にそれらはペーパータオルを使用して乾燥さ汚点。 </li><li>蛹が完全にテープに付着した前に、それらを配置するために絵筆を使用。 </li><li>空気乾燥にサナギを許可し、テープ（5-10分）に準拠して</li><li>外科用メスで二国間でそれぞれの蛹を解剖。これは最高の前から蛹の後端に、単一の急速なカットで達成されます。適切に行われれば、カットは前部と後部の両方気門のペアを二分されます。サンプルを洗浄し、洗浄液として一度に10以上の蛹を解剖するには、迅速に組織のタンパク質分解の損傷を防止するために必要です。 </li><li>絵筆を使って、テープからそれらを緩めるために、各解剖サナギに1X PBSを少量転送する。 </li></ol>クリーニング、固定および一次抗体のインキュベーション<ol start="6"><li>手術用鉗子のペアで前方に個々のさなぎの半分をつかんで、すぐに洗浄皿のウェルに、それを浸す。解剖のプラットフォームは、顕微鏡ステージ上で洗浄皿に置き換える必要があります。処理が完了し、サンプルがマウントするための準備が整うまでは蛹のケースは、サンプルのままにしておく必要があります。 </li><li>まだ蛹の半分をつかんで軽く腹部の内部組織を洗い流すためにピペッターを使用してください。洗浄中に過剰な圧力は、上皮細胞の喪失につながることができます。 </li><li>直ちに、室温で固定バッファにきれいな蛹の半分を譲渡し、同様に残りの蛹の半分を処理。練習すれば、20の解剖と洗濯蛹の半分は5分未満を取る必要があります。 </li><li>蛹が1（1）時間室温で固定バッファでインキュベートすることができます。 </li><li> 1X PBSで固定サナギ3倍、5分を洗い流す</li><li>サンプルはすぐに、免疫組織化学のために処理されるか、または3ヶ月間の細胞またはエピトープ反応性を失うことなく-20℃で100％エタノールに格納されることがあります。 </li><li>サンプルを保存するために、希釈からサンプルを平衡化PBSのシリーズ：前に100％エタノールに移し、各希釈で20分間室温でエタノール（3:1、1:1、1:3）。 </li><li>サンプルは、免疫組織化学のために処理する前に、逆一連のPBSで再平衡にする必要があります。 </li><li>一次抗体を添加する前の1（1）時間のために1 × PBS（2％ウシ血清アルブミンを補充）でサンプルをブロックする。 </li><li> 4℃で一晩1X PBSで適当な濃度に希釈した一次抗体°揺動することなくCでインキュベートする。 </li></ol> 3。 3日目：二次抗体のインキュベーション、取り付けとイメージング始める前に： 次のものが必要です。 <ul><li> 2つの手術鉗子</li><li>マウントメディア（グリセロール、Vectashield [ベクタ​​ー研究所]、またはSlowfadeゴールド[インビトロジェン]） </li><li>うつ病も顕微鏡スライド（0.8 mm）の</li><li>カバーグラス（24 × 40 mm）を</li></ul>二次抗体のインキュベーションおよび取付け： <ol><li> 1 × PBSで各サンプルを3倍の10分を洗う</li><li>二次抗体を添加する前の1（1）時間のために1 × PBS（2％ウシ血清アルブミンを補充）でサンプルをブロックする。 </li><li> 3（3）時間のためにロッキングすることなく、暗所で室温で1 × PBSで適当な濃度に希釈した二次抗体とインキュベートする。 </li><li> 1 × PBSで各サンプルを3倍の10分を洗う</li><li>該当する場合は、対比蛹（我々はDAPIで核を染色例[4'、6 - ジアミジノ-2 - フェニル] 10分間PBSで希釈）。 </li><li>マウントする前に適切なメディアでのサンプル（30分の最小値）を平衡化させます。 </li><li>サンプルのスライドを準備します。蛹の形態は、平滑な取付を防ぎます。サンプルは、イメージングのためのうつ病のスライド（ドロップスライド）のウェルにマウントされます。場所もうつ病の取り付けメディアの75 - 100ul。いくつかのサンプルは、単一のスライドにマウントすることができます。 </li><li>蛹の場合は、マウントする前にサンプルから除去する必要があります。前方に内部蛹の膜を把握しないようにしている個々の蛹のケースをつかみます。 </li><li>鉗子の2番目のペアで軽く頭で内部蛹の膜を把握し、蛹のケースから取り外します。 </li><li>すぐにもうつ病にサンプルを転送し、追加のサンプルの処理を続行する。 </li><li>うつ病でも外側面を上に向けてサンプルに均一プローブまたは鉗子の位置を使用する。時折気泡がプローブを削除することができます。 </li><li>ゆっくりと気泡を導入しないように注意しながら試料の上にカバースリップを下げる</li></ol> 4。代表的な結果： サンプルは、このプロトコルは、成人の腹部の総形態を保持用いて調製。画像のスタックは、腹部のトポロジを調査するために適用することができる二次元画像または3 - Dレンダリングを生成すると予想されることがあります。 <img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 。 ショウジョウバエ蛹翼のない蛋白質と縁をギザギザにした発現（EN - GAL4：UAS - GFP） におけるセグメンテーションの遺伝子産物は、：と抗GFPマウス抗- WG（アイオワハイブリドーマバンク4D4）と（APF）蛹殻の形成後26時間で可視化した。 10倍の倍率は、前方は左だと背が最高です。 NucleiiはDAPIで対比染色した。 約50枚（スライス間のΔZは 2.5μmである）のスタックが予測された。

<ol><li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li>
<li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li>
<li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+rearrangements%2C+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li>
<li>Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).</li>
<li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このビデオで紹介するテクニックは、発達時のポイントの様々なショウジョウバエ蛹を準備するために使用することができます。 32時間に24時間の期間APF中に処理サナギは、APF上皮からの細胞の損失に最もなりやすいです。拡張インキュベーションステップの間に界面活性剤の使用は、（そのようなトリトンX - 100とTween - 20）細胞の損失の可能性が高く、したがって、推奨されません。むしろ、デオキシコール酸は、最初の固定ステップの間に洗浄剤として使用されます。後続のすべての手順は、洗剤なしで1X PBSで実行されます。さらに、拡張されたインキュベーションステップの間に試料を揺動する細胞の損失を増加させ、回避する必要があります。 サンプルは共焦点顕微鏡技術を用いて画像化することができます。しかし、説明したように処理されたショウジョウバエ蛹はまた共焦点技術に匹敵する画質をもたらす構造化照明顕微鏡システムを用いて画像化することができます。

<ul><li>解剖顕微鏡</li><li>手術用鉗子</li><li> 11番ブレードを外科用メス</li><li>九ウェルガラスのうつ病の皿（コーニング製品＃7220〜85） </li><li>培養蛹のための湿気のあるチャンバー</li><li> 1Xのリン酸緩衝生理食塩水（PBS） </li><li> ＃11外科用メス</li><li>両面テープ</li><li>固定バッファ：1X PBS、4％パラホルムアルデヒド、0.2％デオキシコール酸（透過化用） </li><li> P100やP200ピペッター</li><li>うつ病も顕微鏡スライド（0.8 mm）の</li></ul>

ショウジョウバエの蛹の腹部の免疫組織化学

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

ショウジョウバエの蛹の腹部には、上皮形態形成と1-3性的二形性形態の開発の研究のための確立されたモデルシステムです。 （25℃）で約96時間にわたって蛹化、中に、成虫の細胞の増殖集団は、大人の腹部のセグメントを生成するために幼虫の表皮を交換してください。これらの成虫の細胞は、胚形成の間に生まれ、幼虫の各腹部セグメントにおける組織原細胞の巣の外側のペアとして存在する。組織原細胞の巣の4つのペアは、大人の背側クチクラ（前部と後部の背巣）、腹側クチクラ（腹側の巣）と、各セグメント（気門巣）4に関連付けられている気門を生じさせる。 puparation時には、これらの二倍体細胞は、（より大きい倍数体幼生表皮細胞- LECSからサイズによって区別できる）の増殖、遊走およびLECの交換のステレオタイプのプロセスを開始します。様々な分子と遺伝学的ツールは、成人の腹部の形態形成に関与する遺伝的経路の寄与を調査するために用いることができる。究極の大人の表現型は、通常、成人の腹部キューティクルの以下の解剖を分析している。しかし、基盤となる分子過程の研究は、固有の課題を提示蛹上皮の免疫組織化学的分析を、必要とする。時間的に動的な形態形成と二つの異なる上皮集団（幼虫と成虫）の相互作用は、解剖やその後の処理中に、過剰な細胞の損失を受けやすい脆弱な組織を生成する。我々は解剖、固定、マウントと共焦点または標準的な蛍光顕微鏡に適した一貫性のある高品質のサンプルを生成する免疫組織化学的研究のためのショウジョウバエ蛹のabdominem上皮のイメージングの方法を開発した。

の抗体染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹は成人腹部発生遺伝学の遺伝学的解析を強化することができます。我々は段階の解剖、固定し、抗体染色のために我々のプロトコルを提示<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹の腹部。

ショウジョウバエの蛹の腹部は、上皮形態形成および性的二形を示す...の開発を研究するための確立されたモデルシステムです。

この手順の全体的な目的は、免疫組織化学染色に向けて、ショウジョウバエ幼虫の腹部上皮を調製することです。これは、まず段階的なショウジョウバエ幼虫を両側から解剖し、増殖中の成虫原基、造骨細胞、および幼虫表皮細胞で構成される腹部上皮のみが蛹膜に付着した状態で残るように、内部器官を除去することで達成されます。その後、組織を固定し、外部瞳孔ケースから取り出した抗体とともにインキュベートし、免疫蛍光顕微鏡で可視化することで、腹部上皮の全体的な形態と目的タンパク質の発現を確認します。こんにちは、ジョン・ヨーダーです。私はアラバマ大学生物科学科で研究室を運営しています。こんにちは、We Wonです。Yodaラボの学生です。今日は、ショウジョウバエ幼虫の解剖方法と、ショウジョウバエ蛹の腹部の免疫組織化学染色の方法をご紹介します。この手法は、上皮の形態形成および組織再編成のプロセスを調査するために使用できます。本研究では、特に成体ショウジョウバエの腹部における性的二型形態の発達を調査するためにこの技術を用いています。成体が含まれていない25 °Cの個体維持 vial から、最近不動化した、クチクラの褐化がまだ始まっていない pupae を選び出します。これを 0 hours a PF と定義します。濡らした絵筆を用いて、これらの pupae を慎重に回収し、加湿チャンバーの蓋の上に置きます。必要に応じて、絵筆と PBS を使用して pupae のケースから破片を優しく洗い流してください。0時間目に、puyを雌雄で選別します。PF雄の刺原基は、瞳孔角膜を通して容易に確認できます。雌の刺原基は、体長の約3分の2あたりに位置し、より小さいため、特定が困難です。次に、パップを湿らせたフィルターペーパーの上に置き、加湿チャンバーに入れます。蓋を閉め、恒温環境に戻します。動物が目的の発生段階に達したら、解剖に進みます。puby処理後24〜32時間のAPF段階の個体は、その後の処理中に上皮細胞が脱落しやすいため注意してください。透明スライドの一辺に両面テープを貼り付けて、解剖の準備をします。次に、ピンセットで各瞳孔の前球の間をそっと掴み、背面を上に向けた状態でテープの上に配置します。この方法で並べるPPEは最大10個までとし、それ以上になると作業速度が低下する恐れがあります。5～10分でPPEは完全に凝固しますが、その前に絵筆を使用して、それぞれを均等な間隔で平行に配置してください。この段階での乾燥時間が長すぎると、品質が低下します。迅速に行います。次に、外科用メスを使用して、両側の各蛹Aを解剖します。蛹の前端から後端まで、一度に素早く切り込みを入れます。適切に行えば、切開によって前後の球状ペアの両方が二分され、左右対称の半分になります。これにより、蛹をテープから剥がしやすくなります。外科用ピンセットを用いて各解剖蛹にPBSを少量塗布します。この際、絵筆を使用してください。蛹の半分を前端で掴み、解剖顕微鏡ステージ上のPBSを満たした洗浄皿に浸します。蛹を掴んだまま、ピペッターを用いて腹腔内にPBSを注入し、内部組織を優しく洗い流します。圧力をかけすぎないようにしてください。さもないと、上皮から細胞が脱落してしまいます。洗浄した組織を直ちに室温の固定バッファー 400 µL に浸し、すべての蛹の半分を洗浄します。同様に、解剖と洗浄に慣れれば、20 個の蛹の半分を処理するのに5分未満で済むはずです。固定バッファー中で室温で1時間インキュベートした後、400 µLのPBSで1回5分間、計3回洗浄します。サンプルを保存する場合は、まず100% methanolで2回洗浄し、その後保存用の100% ethanolに移します。これらのサンプルは、細胞の脱落やエピトープ反応性の低下を招くことなく、100% ethanol中で-20 °Cで最大3か月間保存可能です。保存サンプルを処理するには、まずエタノール系列を用いてPBSで再水和させる必要があります。室温で1時間、揺動させずに2%BSAを含むPBSでサンプルをブロッキングし、免疫組織化学染色を進めます。サンプルを揺動させると、腹部上皮からの細胞脱落が大幅に増加します。次に、ブロッキング溶液を、PBSで適切な濃度に希釈した一次抗体と交換します。サンプルの蒸発を防ぐため、密閉した加湿チャンバーに入れ、4 °Cで揺らさずに一晩インキュベートし、翌日に回収します。その後、揺らさずにPBSで3回洗浄し、1回につき10分間洗います。次に、2% BSA含有PBSを用いて、サンプルを振盪せずに1時間ブロッキングします。ブロッキング液を、PBSで調製した室温の二次抗体に置換します。その後、サンプルを暗所で3時間、振盪せずにインキュベートします。必要に応じて、二次抗体処理の後、PBSで10分間ずつ3回洗浄します。次いで、対比染色を行います。例えば、PBSで希釈したDAPIで10分間インキュベートすることで核を染色できます。その後、封入剤を用いてサンプルを最低30分間静置します。サンプルをマウントするには、2組目のピンセットを使用して、内側の瞳孔膜に触れないように各瞳孔ケースの前方を把持します。次に、内側の瞳孔膜の頭部をそっと掴みます。その後、瞳孔ケースからサンプルをゆっくりと引き出します。uncaサンプルを、75から100 µLの封入剤を入れた凹面スライドグラスに移します。1枚のスライドに複数のサンプルを封入することが可能です。次に、プローブとピンセットを使用して、サンプルを凹面内に均等に配置します。側面が上を向くように回転させ、プローブで気泡を取り除きます。最後に、気泡が入らないように注意しながら、カバーガラスをサンプル上にゆっくりと載せて、この調製を完了します。構造照明顕微鏡法は、共焦点技術に匹敵する性能が得られます。これは、スライス間隔 2.5 microns の共焦点画像 50 枚を投影したものです。組織は PF 後 26 時間の状態であり、染色は wingless タンパク質と grail 駆動 GFP、および核の発現パターンを示しています。画面の左側が前方、上側が背側です。この動画では、本の手順によってサンプルの粗形態がどのように保持されるかを示します。これにより、画像スタックの3次元再構成が可能になります。数十個の瞳孔を処理し、30分以内に固定バッファーに入れることができます。さらに、本プロトコルを用いて調製したサンプルはin situハイブリダイゼーションに適しており、遺伝子発現研究において価値の高いプロトコルとなります。

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