FM染料を用いて培養小脳顆粒神経細胞のシナプス小胞プールの補充の定量分析
November 11th, 2011
中枢神経終末で補充し、特定のシナプス小胞の動員（SV）のプールを定量化するために、ライブ蛍光イメージング技術が記載されている。 SVリサイクルの2つのラウンドは、内部統制を提供する同じ神経終末に監視されます。
次の実験の全体的な目標は、ライブ蛍光イメージング技術を使用して、中枢神経終末の特定のシナプス小胞プールの補充と動員を定量化することです。これは、シナプス小胞のリサイクルを2ラウンド監視し、同じ神経終末にFM染料を使用して有効な内部制御を提供することによって達成されます。第2のステップとして、容易にリリース可能なプールとリザーブプールは、特定のアンロードプロトコルを使用して順次枯渇させ、相対的なプールサイズの定量化を可能にします。
次に、シナプス小胞、プールの補充、または動員のいずれかに対する選択したバリエーションの影響を研究するために、負荷または荷降ろしの条件を変更します。結果は、誘発された色素アンロードの定量化と分析に基づいて、異なるシナプス物理プールのFM dローディングが再現可能であることを示しています。この手法が、流暢な遺伝レポーターファミリーのような既存の方法よりも優れている点は、この手法が、エンドサイトーシスを受けたシナプス小胞によるプールの補充を特異的に追跡することです。
また、正確な定量化も可能です。このプロトコルは、内部制御を提供する同じ神経終末で2回実行されるため。この方法は、特定のエンドサイトーシスモードでの操作が、リサイクルプール全体とその中のシナプスCLEプール(容易に再利用可能なプールやリザーブプールなど)の両方の補充にどのように影響するかなど、シナプス、CLE、エンドサイトーシス、エキソサイトーシスの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。
基本的な実験装置は、倒立型落射蛍光顕微鏡、冷却CCDカメラ、蛍光光源、重力灌流装置、平行白金電極と電気刺激装置を備えたイメージングチャンバー、およびコンピューターで構成される必要があります。FM染料の漂白を避けるために、サンプルの蛍光照明を最小限に抑えた暗所または赤色光条件下で実験を行います。この手順は、生後7日間のスプラドリーラットの子犬を使用して、小脳顆粒ニューロンの一次培養物を準備することから始めます。
培養物を調製した後、ポリDリジンコーティングされた25ミリメートルのカバースリップの中央にニューロンをプレートし、1時間後に直径7ミリメートルを超えない液滴で、7日後にニューロンに2ミリリットルの培養培地を追加します。1枚のカバースリップを生理食塩水に室温で10分間入れ、新しい培地で安定化させます。その後、カバースリップをはがし、その下側と付着した細胞の周囲を小さなペーパータオルまたは吸収紙で乾かします。
続いて、シリコングリースを使用して、カバースリップをイメージングチャンバーの底に接着します。セルは 2 本の平行なワイヤの間に配置する必要があります。十分なシリコングリースを使用して、バスチャンバーの中央に侵入することなくチャンバーを完全に密閉します。
次に、浴槽に約260マイクロリットルの生理食塩水を静かに満たします。次に、入力チューブと出力チューブに同じ溶液を充填します。きれいなカバースリップをシリコングリースで上部に接着してチャンバーをシールします。
その後、入力チューブと出力チューブでチャンバーに閉じ込められた気泡を取り除きます。次に、イメージングチャンバーをステンレス製のプラットフォームに固定します。インプットチューブを通して生理食塩水を穏やかに大量に使用して、漏れがないか確認します。
次のステップは、組み立てたチャンバーを倒立顕微鏡のステージに取り付けることです。重力灌流システムの入口を生理食塩水でプライミングし、チャンバーを入口に接続します。次に、チャンバーの接続ワイヤを電気刺激装置に取り付けます。
1.5ミリリットルの希釈したfm色素でニューロンを灌流します。その後、付属の刺激装置を使用してニューロンを刺激し、色素の取り込みを呼び起こします刺激後、ニューロンを新鮮な生理食塩水で2分間灌流して、余分なFM染料を洗い流します。次に、ニューロンを生理食塩水に8分間入れます。
それまでの間、個々のFMD負荷神経終末が見える軸索ネットワークを見つけます。フルオレセイン波長を使用します。セルが密集している領域は避けてください。
その後、静止期間中にわずかなドリフトが発生した可能性があるため、画像取得の直前に画像にピントを合わせ直します。タイムラプス画像の取得は、4秒ごとに1フレームの割合で開始されます。5〜10枚のベースライン画像を取得した後、30ヘルツの刺激を2秒間供給することにより、容易にリリース可能なプールのエキソサイトーシスを呼び起こします。
さらに10枚の画像を取得した後、シナプス小胞を呼び起こし、40ヘルツの3回の刺激を10秒間使用して予備プールのエキソサイトーシスを行い、刺激の間に40秒の間隔を空けて、さらに5〜10枚の画像を取得します。次に、画像取得を一時停止します。ニューロンを少なくとも20分間回復させ、このS一相プロトコルをS二相で再度繰り返して、対照実験を行います。
データ分析の場合は、画像をスタックに変換します。image J 組み込み関数を使用して、スタックの明るさとコントラストを調整し、大きな水平ドリフトが発生した場合はダイナミック レンジを最大化します。実験中に、画像 J で stack reg プラグインと turbo reg プラグインを実行して、画像スタックを整列させます。
次に、ランタイムシリーズアナライザープラグイン。次に、少なくとも 90 の神経終末にわたる関心領域を定義します。ダイアンロードの前と後の画像を切り替えて、アクティブな神経終末を明らかにすると便利です。
理想的な関心領域のサイズは、一般的な神経終末よりもわずかに大きい領域です。次に、各関心領域の全蛍光強度を経時的に取得します。その後、Microsoft Excelにエクスポートします。
ここに示されているのは、小脳顆粒ニューロンに80ヘルツの10秒刺激を使用して10マイクロモルFM1 43を負荷した対照実験のフローチャートです。FM1 43を装填した神経終末の画像です。これは、活動的な神経終末を特定した後に分析のために選択された90の番号付き関心領域を示す同じ画像であり、これらは選択した時点の神経終末の画像です。
これらの画像は、さまざまなシナプス小胞プールが枯渇したときの蛍光の変化を示すために、疑似カラーで表示されます。最後に、ここでは、これらの90の神経終末の正規化された蛍光単位を示しました。S oneおよびS two phasesでは、各連続刺激の蛍光降下を測定し、S oneとS two phase間で比較することができます。
この対照実験では、S 1とS 2の両方が、容易にリリース可能なプールと予備プールのサイズを同じにしました。このビデオを見れば、生命蛍光イメージング技術を使用して、中枢神経終末の特定のシナプス小胞プールの補充と動員を定量化する方法を十分に理解できるはずです。この手順を試行する際は、S 2の実験条件を変更する前に、S oneコントロール実験を行うことで、細胞の生存率と応答性を確認することを忘れないでください。
概要
この記事では、中枢神経末端における特定のシナプス小胞（SV）プールの補充と動員を定量化するためのライブ蛍光イメージング技術について説明しています。この方法により、同じ神経末端でSVリサイクルの2ラウンドをモニタリングでき、正確な定量化のための内部コントロールを提供します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- イメージング技術
背景
- シナプス小胞のダイナミクスを理解することは、神経伝達に関する洞察を得るために重要です。
- ライブイメージング技術は、リアルタイムでシナプスプロセスを研究する能力を向上させます。
- 以前の方法では、特定の小胞プールを効果的に追跡する能力が不足していました。
- この研究は、内部コントロールを提供することで既存の技術を改良することを目的としています。
研究目的
- シナプス小胞プールの補充と動員を定量化する。
- 同じ神経末端でのシナプス小胞リサイクルの2ラウンドをモニタリングする。
- 異なる積載および解放条件が小胞ダイナミクスに与える影響を評価する。
使用した方法
- FM染色剤を使用したライブ蛍光イメージングでシナプス小胞を可視化。
- 特定のプロトコルを使用して容易に放出可能なプールと予備プールの連続的な枯渇。
- 刺激中の小胞ダイナミクスを捉えるためのタイムラプスイメージング。
- 蛍光強度を定量化するための画像処理ソフトウェアを使用したデータ分析。
主要な結果
- この技術により、シナプス小胞の積載と解放の再現可能な追跡が可能になります。
- 内部コントロールにより、得られた結果の妥当性が向上します。
- エンドサイトーシスモードの操作が小胞の補充に大きな影響を与えます。
- 定量的分析により、シナプス小胞プールのサイズに関する洞察が得られます。
結論
- この方法は、シナプス小胞のダイナミクスを研究するための信頼できるアプローチを提供します。
- シナプス生理学における重要な質問に答える可能性を提供します。
- この発見は、神経伝達とシナプス可塑性に関する将来の研究に情報を提供する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables precise quantification of synaptic vesicle pool dynamics, supporting mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease programs. By providing internal controls and differential pool analysis, it enhances predictive confidence in early discovery stages where vesicle trafficking mechanisms are therapeutic targets. The approach addresses variability across preparations, improving reproducibility for cross-functional collaboration in assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic vesicle trafficking pathways to validate targets involved in neurotransmitter release and recycling.
- Operational Value: Provides quantitative, reproducible measurements of readily releasable and reserve pool replenishment under varying stimulation conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates assay-ready readouts of vesicle mobilization kinetics that can be used to screen compounds affecting endocytosis or exocytosis.
- Operational Value: Uses FM dye labeling to produce quantal fluorescence signals proportional to vesicle release, enabling standardized, quantitative screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by quantifying how manipulations of endocytosis modes affect specific vesicle pools in cerebellar granule neurons.
- Operational Value: Enables within-preparation comparisons (S1 vs S2 phases) to control for biological variability, increasing assay reliability in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where understanding vesicle pool dynamics informs mechanism of action and compound effects on presynaptic function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how endocytosis pathways (e.g., clathrin-dependent vs activity-dependent bulk endocytosis) regulate vesicle pool mobilization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (fluorescence decay kinetics) that enable comparison of compound effects on vesicle recycling.
- Analytics: Provides time-resolved fluorescence intensity measurements from regions of interest, allowing calculation of pool-specific replenishment rates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using disease-relevant neuronal models to assess how genetic or pharmacological perturbations alter vesicle trafficking.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging workflow that can be adapted across neuronal models and stimulation paradigms for repeated use in discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by isolating the contributions of specific synaptic vesicle pools to neurotransmission dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility through internal controls (dual-phase measurements in same nerve terminals) and standardized FM dye protocols.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in presynaptic target validation, supporting better go/no-go decisions in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on vesicle pool replenishment, a key presynaptic mechanism.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live fluorescence imaging and neuronal culture preparation, particularly for primary cerebellar granule neurons.
- Depends on inverted epifluorescence microscopy, cooled CCD camera, electrical stimulation, and perfusion systems for precise solution exchange.
- Necessitates standardization of staining, washing, and stimulation timing across runs to ensure comparable vesicle loading and unloading.
- Must account for variability in nerve terminal density and health, addressed by selecting active terminals and using internal controls.
- Limited to optically accessible preparations; not suitable for high-throughput formats without automation of imaging and analysis.
