FM染料を用いて培養小脳顆粒神経細胞のシナプス小胞プールの補充の定量分析

本実験の全体的な目的は、生細胞蛍光イメージング技術を用いて、中枢神経終末における特定のシナプス小胞プールの補充と動員を定量化することです。これは、同一の神経終末においてFM色素を用いて2回のシナプス小胞リサイクリングをモニタリングすることにより、有効な内部コントロールを確保することで達成されます。次のステップとして、特定のアンローディングプロトコルを用いて、即時放出可能プールとリザーブプールを順次枯渇させ、これにより相対的なプールサイズを定量化します。

次に、選択した変動がシナプス小胞、プール補充、または動員のいずれに及ぼす影響を調べるため、ローディングまたはアンローディングの条件を変更します。結果から、喚起された色素アンローディングの定量化および解析に基づき、異なるシナプス物理プールのFM色素ローディングは再現可能であることが示されます。fluentファミリーなどの遺伝的レポーターを用いた既存の手法に対する本手法の主な利点は、エンドサイトーシスを経たシナプス小胞による特異的なプールの補充を追跡できる点にあります。

また、これにより正確な定量化が可能になります。このプロトコールを同一の神経終末で2回実施するため、内部コントロールを得ることができます。この手法は、特定のエンドサイトーシス様式の操作が、全リサイクルプールおよびその中の速やかに出現可能なプール（readily reusable pool）やリザーブプール（reserve pool）といったシナプスCLEプールの補充にどのように影響するかなど、シナプス、CLE、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスの分野における重要な疑問の解決に寄与します。

基本的な実験セットアップは、倒立型エピ蛍光顕微鏡、冷却CCDカメラ、蛍光光源、重力灌流装置、平行白金電極を備えたイメージングチャンバー、電気刺激装置、およびコンピュータで構成してください。FM染料の退色を防ぐため、実験は暗所または赤色光条件下で、サンプルへの蛍光照射を最小限にして行ってください。まず、生後7日のSprague-Dawleyラット幼仔を用いて、小脳顆粒ニューロンの一次培養を調製することからこの手順を開始します。

培養液の準備が完了したら、ポリDリジンでコーティングした25 mmのカバーガラスの中央に、直径7 mmを超えない液滴状にニューロンを播種します。1時間後、ニューロンに2 mLの培養液を加えます。7日後、新しい培地への安定化を図るため、カバーガラス1枚を室温の生理食塩水に10分間浸します。その後、カバーガラスを取り出し、裏面および細胞が付着している周囲の領域を、小さく切ったペーパータオルまたは吸収紙で拭き取ります。

続いて、シリコングリスを使用して、カバーガラスをイメージングチャンバーの底面に接着します。細胞が2本の平行なワイヤーの間に位置するようにしてください。バスチャンバーの中央部分まで浸食させないようにしつつ、チャンバーを完全に密封するのに十分な量のシリコングリスを使用してください。

次に、バスチャンバーに生理食塩水を約 260 µL ゆっくりと満たします。続いて、入口および出口のチューブにも同様の溶液を満たします。清潔なカバーガラスをシリコングリスで上部に接着し、チャンバーを密封します。

その後、入口および出口のチューブを用いて、チャンバー内に溜まった気泡を除去します。次に、イメージングチャンバーをステンレス製プラットフォームに固定します。入口チューブから生理食塩水を緩やかに流し、漏れがないか確認してください。

次のステップは、組み立てたチャンバーを倒立顕微鏡のステージに設置することです。重力灌流システムの入口を生理食塩水でプライミングし、チャンバーを入口に接続します。その後、チャンバーの接続線を電気刺激装置に取り付けます。

1.5 millilitersの希釈したFM dyeを用いてニューロンを還流させます。その後、付属の刺激装置を用いてニューロンを刺激し、色素の取り込みを誘発させます。刺激後、新鮮な生理食塩水で2分間ニューロンを還流させ、過剰なFM dyeを洗い流します。その後、ニューロンを生理食塩水中で8分間保持します。

その間に、個々の FM D がロードされた神経終末が確認できる軸索ネットワークを探します。フルオレセイン波長を使用してください。細胞が密集している領域は避けます。

休息期間中にわずかなドリフトが発生している可能性があるため、画像取得の直前に再度ピントを合わせます。4秒に1フレームの速度でタイムラプス画像取得を開始します。5〜10枚のベースライン画像を取得した後、30 Hzの刺激を2秒間与えることで、速放性プール（readily releasable pool）のエクソサイトーシスを誘導します。

さらに10枚の画像を撮影した後、40 Hzの刺激を10秒間、40秒の間隔を空けて3回行い、リザーブプールのシナプス小胞の開口放出を誘導し、さらに5枚から10枚の画像を撮影します。その後、画像撮影を一時停止します。ニューロンを少なくとも20分間回復させ、対照実験としてこのS1相のプロトコルをS2相で再度繰り返します。

データ解析のために、画像をスタックに変換します。ImageJの組み込み関数を使用して、顕著な水平方向のドリフトが生じている場合は、ダイナミックレンジを最大化するようにスタックの明るさとコントラストを調整してください。実験中に、ImageJのstack regおよびturbo regプラグインを実行し、画像スタックをアライメントします。

次に、runtime series analyzerプラグインを使用します。続いて、少なくとも90個の神経終末にわたって関心領域（ROI）を定義します。染料の脱落前後の画像を切り替えて確認すると、活性化している神経終末を特定しやすくなります。

関心領域（ROI）の理想的なサイズは、典型的な神経終末よりもわずかに大きいサイズです。次に、各関心領域の総蛍光強度を時系列で取得します。その後、Microsoft Excelにエクスポートします。

ここでは、80 Hzで10秒間の刺激を用いて小脳顆粒ニューロンに10 µMのFM 1-43を負荷させた対照実験のフローチャートを示します。こちらはFM 1-43を負荷した神経末端の画像です。こちらは同じ画像に、活性化した神経末端を特定した後に解析用に選択した90箇所の番号付き関心領域（ROI）を示したものです。そして、これらが選択したタイムポイントにおける神経末端の画像です。

これらの画像は、異なるシナプス小胞プールが枯渇するにつれて蛍光強度がどのように変化するかを示すため、擬似カラーで表示されています。最後に、これら90個の神経終末における正規化された蛍光単位を示します。S1相およびS2相において、連続的な刺激ごとの蛍光強度の低下を測定し、S1相とS2相の間で比較することができます。

この対照実験では、S oneとS twoのいずれにおいても、即放性プールおよびリザーブプールのサイズは同じ結果となりました。このビデオを視聴することで、生細胞蛍光イメージング技術を用いて、中枢神経末端における特定のシナプス小胞プールの補充と動員を定量化する方法について十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、S twoの実験条件を変更する前に、S oneの対照実験を実施して細胞の生存率と反応性を確認することが重要です。