Name: インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: 学ぶ、インスリン発現コロニーを形成する膵前駆細胞の定量アッセイ。マウス胚性幹細胞由来のEGFP陽性細胞を半固形培地で培養し、コロニー形成頻度を算出する方法です。

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著者らは、マウスNgn3 - EGFP胚性幹細胞株、夫人ルーシーブラウンと細胞選別の支援のための分析サイトメトリーコアのプレゼントのために博士クラウスケストナーに感謝したいと思います。この作品は、MWとLSに授与訓練助成金HTKに授与NIH助成金R21DK069997とR01DK081587によってと再生医療（CIRM）のためのカリフォルニア工科大学から一部で賄われていた

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</ol>

我々は、開示することは何もない。

個々の膵前駆細胞の定量的および機能的な評価を可能にするコロニーアッセイは、非常に膵臓の幹細胞や前駆細胞生物学の研究の進展を妨げている、これまでのところ限られている。コロニーアッセイの本質は、前駆細胞の機能と系統の電位が観察できるように、本質的な前駆細胞の能力ではなく、単にそれらの表現型を測定することです。また、特定の集団に前駆細胞の数を決定することができる定量的なツールです。造血幹細胞の分野で、コロニーアッセイが同定に重要な役割を果たしただけでなく、成長因子の要件、相互作用、およびこれらの細胞の系譜のコミットメントを支配するメカニズムを解読している。膵前駆細胞の生物学の分野6、膵臓の臓器7 、8またはバルク文化9月13日考案されているが、しかしながら、このようなアッセイは、生物学的クエスティに対処していない単一細胞レベルで作成されている。単一細胞分析することなく、複数の潜在的な膵臓の幹/前駆細胞の存在が明確に立証することはできません。14 ここでは、インスリンを発現するコロニー形成前駆細胞が三次元、マトリゲルを含む、半固体培養系を用いて測定することができます。見せる懸濁培養系15,16を単一の成人の膵臓の前駆細胞が増殖し、&quot;pancreatospheres&quot;に分化することを可能にするどの開発されているが、我々のコロニーアッセイでは、付加的な利点を提供します。最初に、私たちの半固体培養のメディアシステムは、最大24ウェルあたり500μLの培地25,000ソートされた細胞へのメッキ線形範囲で得られたコロニーの形成を維持しながら。2は対照的に、サスペンションのpancreatosphereアッセイは、単一の使用を必要とすることが可能セルソーターによる細胞の成膜方法は、単一細胞分析を可能にするため、文化、メディアとインキュベータスペースの大きなボリュームに必要です。したがって、我々のコロニーアッセイでは、異なる多数の細胞が前駆細胞の活動のために同時に比較する必要がある場合に実施するのは比較的簡単で費用対効果です。第二に、私たちの半固形培地では増殖と分化の両方が同じウェルで発生することができる細胞外マトリックス成分と成長因子の均一な分布を、可​​能です。対照的に、それは、懸濁培養中の細胞にこのような環境、特に行列を、提供することより困難である。我々は2つ​​の前駆細胞がランダムにお互いとフォームつのコロニーの近くに配置することができるように私たちの方法でそれは決定的に、各コロニーは単一の細胞から派生していることを証明することはできないことを認識しています。しかし、この問題は、単一細胞操作を用いた二次分析によって克服することができます。ソートされた単一細胞の直接手摘みでは決定的に各コロニーの単セルの原点を示すことができる。 要約では、プロのインスリン発現コロニー形成活性ここに記載さ半固形培地でgenitorsは、単一細胞レベルでの膵前駆細胞の力学的研究のためのユニークな機会を提供しています。例えば、前の報告書で我々は細胞外マトリックスを示唆し2、その培養液へのマトリゲル、細胞外マトリックス蛋白質の粗混合物を添加することはインスリン発現Ngn3 - EGFP +細胞からのコロニーの形成に必要な発見です。それらの前駆細胞の重要な。このコロニーアッセイを使用して、それは現在、さらに細かく分析し、そのような活動のための特定のマトリックスの要件を定義することが可能となります。マウス胚性幹細胞由来の前駆細胞を研究に加えて、我々は現在、in vitroのアッセイ系で 、これはまた、周産期および成体マウスの膵臓と肝臓から、同様に欠けている人間の死体膵組織由来の他の特徴的なコロニーの形成をサポートするかどうかを調査しています膵島の。

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料/試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ 数 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 1X DMEM / F - 12（1:1） </td><td> Mediatech </td><td> 15から090 - CV </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>組織文化 生物学的製剤</td><td> 201 </td><td>セクションを参照してください。 1.1 </td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td> GIBCO </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> 1XダルベッコPBS </td><td> Mediatech </td><td> 21から031 - CV </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清 アルブミン</td><td>シグマ</td><td> A8412 </td><td> 7.5パーセント</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>ベクトン ディッキンソン</td><td> 356231 </td><td>削減成長 ファクタ</td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td> Sinetsu 化学物質、 東京、日本</td><td></td><td> 1500センチポイズ （高VIscosity） </td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>シグマ</td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトの 組換え アクチビンβB </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 659 - AB - 025 </td><td></td></tr><tr><td>エキセンディン-4 </td><td>シグマ</td><td> E7144 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトの 組換え VEGF - </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 293 - VE - 010 </td><td></td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>共演スター</td><td> 3473 </td><td>超低 添付</td></tr><tr><td> 60ミリメートルシャーレ グリッドと</td><td>ヌンク</td><td> 169558 </td><td></td></tr></tbody></table>

インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

膵臓の幹細胞や前駆細胞生物学の分野は、単一細胞の分析を可能にするin vitro機能と定量的なアッセイでの不足によって妨げられている。彼らは明確に個々の前駆細胞の系統の可能性を実証する決定的な方法を提供するため、単一の前駆細胞の解析は非常に重要です。メソッドは、単一の細胞から浮遊培養で&quot;pancreatospheres&quot;を生成するために考案されているが、いくつかの制限があります。最初、それは文化のメディアと空間のターンコマンドで大量の細胞の数が多い、のために単一のセルの堆積を行うために時間がかかります。結果pancreatospheresの第二、記数はpancreatosphere -開始前駆細胞の頻度が低い場合は特に、労働集約的である。第三に、pancreatosphereアッセイは、再、よく同じ文化の中で膵臓の前駆細胞の増殖と分化の両方を可能にする効率的な方法ではありませんアッセイの有用性をstricting。 これらの制限を克服するために、膵臓の前駆細胞のための半固体培地によるコロニーアッセイが開発され、本報告書で提示されます。このメソッドは、それらが増殖ならびに分化を受けるように前駆細胞が三次元空間に滞在できるように、メチルセルロースがメディアに粘度を提供するために使用されている造血コロニーアッセイ、から、既存の概念を活用します。不均一な集団からインスリンを発現するコロニー形成前駆細胞を豊かにするため、我々は急行neurogenin（NGN）3、膵内分泌前駆細胞のマーカーその細胞を利用した。マウス胚性幹（ES）強化緑色蛍光タンパク質レポーターでタグ付けさNgn3発現細胞をソートされ、ウェル当たり、多くの25000のような細胞が低添付ファイル24穴培養皿に播種した。細胞が由来次の主要コンポーネントと半固体培地の各ウェルに含まれる500μL：METhylcellulose、マトリゲル、ニコチンアミド、エキセンディン-4、アクチビンβB、および馴化培地は、マウスES細胞由来の膵臓様細胞から採取。文化8〜12日後に、独特の形態を持つインスリンを発現するコロニーが形成され、さらに各コロニーの系統構成を決定するために定量的RT - PCRとimmunoflourescent染色を用いて膵臓遺伝子発現を分析することができます。 要約すると、我々のコロニーアッセイは、不均一な細胞集団内で機能的な前駆細胞の容易な検出および定量することができます。さらに、半固体のメディアフォーマットは、in vitroで増殖し、区別するために前駆細胞を有効に、細胞に細胞外マトリックス成 ​​分と成長因子の一様なプレゼンテーションが可能になります。このコロニーアッセイは、単一細胞レベルでの膵前駆細胞の力学的研究のためのユニークな機会を提供しています。

膵臓のような前駆細胞がインスリンを発現するコロニーへの分化を可能にする三次元のクローン原性アッセイが記載されている。単一の前駆細胞が増殖と分化するこの方法は、メチルセルロース、マトリゲルと成長因子を含有する半固体培地を利用しています<em&gt; in vitroで</em&gt;、人口で機能的な前駆細胞数の定量化を可能にする。

膵臓幹細胞および前駆細胞生物学の分野は、……を可能にするin vitroでの機能的かつ定量的なアッセイの不足によって妨げられてきました。

このビデオでは、膵臓様前駆細胞をインスリン発現コロニーへと分化させるための三次元培養の手順を実演します。まず、neurogen 3 EGFPノックインマウス胚性幹細胞株由来の分化細胞を解離し、内分泌様前駆細胞を濃縮するためにEGFP発現に基づいてソートします。EGFP陽性にソートされた単一細胞を、matrigelと成長因子を含む半凝固培地に播種します。これにより、個々の前駆細胞の移動が制限されますが、in vitro での生存、増殖および分化は可能になります。次に、特定のソート済み集団におけるコロニー形成前駆細胞の頻度を算出するため、特徴的な形態を持つ得られたコロニーの数を顕微鏡下で計数し、スコア化します。個々のコロニーをリアルタイム PCR および免疫蛍光顕微鏡で分析すると、ngn three 陽性細胞由来のコロニーではインスリンの発現が認められましたが、NGN three 陰性細胞由来のコロニーでは認められませんでした。浮遊培養による膵球などの既存の手法と比較して本手法を用いる主な利点は、より大量の細胞を一度に同時に解析し、その固有の前駆細胞コロニー形成能を評価できる点にあります。この方法は、前駆細胞がどのマーカーを発現しているか、あるいはこれらの細胞の維持、自己複製、および分化にとってどの内在的または外在的因子が重要であるかなど、膵幹細胞および前駆細胞の生物学に関する疑問の解明に寄与します。本手法の意義は1型糖尿病の治療にまで及ぶ可能性があります。なぜなら、膵前駆細胞を特定し、β細胞様の細胞へと分化させることができれば、それらの細胞を末期1型糖尿病患者における損傷したβ細胞の置換に利用できるためです。本手法は、出生後および成体膵臓、骨髄、肝臓、脾臓のコロニー形成前駆細胞の研究など、他の系にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、細胞を単一細胞懸濁液に解離させる操作や、分注準備におけるMatrigelおよびメチルセルロースの取り扱いに苦労すると思われます。私がこの手法を着想したのは、膵臓の前駆細胞とその分化した子孫細胞との間の系統関係を解析するためのクローン形成アッセイが存在しないことに気づいたときでした。このようなコロニー形成アッセイは、これまで造血幹細胞および前駆細胞の研究において重要な役割を果たしてきました。私は、膵臓幹細胞の生物学を研究するためにも、このようなアッセイが必要であると考えています。半固形培地の成分は本質的に粘性が高く、調製および分注の手順を習得することが困難であるため、この手法を視覚的に提示することは極めて重要です。本手順の実演は、修士課程のMichael Winkler氏、技術員のNancy氏、および研究室のポストドクターであるLang Jing博士が行います。後ほど実施するコロニーアッセイ用の調整培地を調製します。ニューロンES細胞をin vitroで膵臓様細胞へと分化させます。まず、光学顕微鏡で培養6日目の胚体を確認することから始めてください。そのうち少なくとも30〜40%は、直径が150 µm以上である必要があります。より大きな胚体には、分化が進んでいることを示す暗いスポットが含まれているはずです。6ウェル付着プレートの各ウェルに80〜100個の胚体を移し、その後、プレートをゆっくりと揺らして胚体をウェルの中心に集め、細胞間接触を増加させます。これらの接触により、胚体から膵島様細胞がより良好に分化します。プレートを37°C、5% 二酸化炭素の培養インキュベーター内に静かに戻します。 A 13。培地を、内分泌細胞への分化を誘導するため、ニコチンアミドおよびヒト組換え活性化β-FGFを含む新鮮な付着培養培地に交換します。その後、培養物をインキュベーターに戻して培養を続けます。16日目に、培地を回収し、0.2 µmのポリエーテルスルホン膜でろ過して、細胞残渣を除去します。以降、回収した培地を条件化培地と呼びます。条件化培地を15 mLの円錐形ポリプロピレンチューブに分注し、使用直前まで-80 °Cで保存します。Neurogenin 3は、発生過程において膵内分泌前駆細胞により発現する転写因子です。Neurogenin 3を発現する内分泌前駆細胞は、最終的に膵α、β、δ、ε、および膵ポリペプチドを発現する細胞へと分化します。NGN3を発現する細胞の同定を容易にするため、ノックインマウスES細胞株においてNNGN3遺伝子座の1アレルをEGFPレポーター遺伝子に置換しました。得られた細胞株をNGN3-EGFPと命名しました。分化したNGN3-EGFP陽性細胞およびNGN3-EGFP陰性細胞を得るため、まず、16日目にトリプシンを用いて培養プレートから細胞を剥離し、単一細胞懸濁液を作成します。細胞塊をコラゲナーゼBおよびDNase Iとともにインキュベートし、40または70ミクロンのメッシュに通します。次にDPIを添加し、セルソーターを用いて、それぞれ細胞サイズと顆粒度を示す前方散乱光（forward scatter）と側方散乱光（side scatter）に基づいて細胞をソーティングします。次に、非細胞性のデブリを除去するためにゲートを設定します。死細胞を識別するためにDPIを使用し、死細胞は陽性に染色されます。405〜413 nmで励起し、454/40フィルターで放出光を検出します。パルス幅によるゲーティング（電子的な前方散乱パルスの幅）によりダブレットを検出し、フローサイトメーター（FACS）に通す前にこれらを除去します。その後、EGFPチャネルFL1と自家蛍光のゲーティングを行います。左パネルに示すTLなどの対照親細胞株の16日目の細胞を用いて、真の蛍光を照射することで、右パネルに見られるようにNGN3 EGFP陽性細胞集団を可視化できます。NGN3 EGFP陽性細胞のソートゲートは、ソート中のNGN3 EGFP陰性細胞の混入を制限するため、ここに示す矢印のように意図的に右側に移動させています。ゲートを設定後、NGN3 EGFP陽性細胞およびNGN3 EGFP陰性細胞をソートし、播種準備まで氷上で保存します。実験の前夜に、Matrigelを4 °Cの氷上に置いておきます。実験当日は、以下の試薬または溶液を氷上に準備します：DMEM/F12、メチルセルロース、条件培地、FCS、ニコチンアミド、XTEND 4、VEGF-A、および組換えヒト活性化βB。使用の少なくとも30分前に、200 µLピペットチップの滅菌ボックスを-20 °Cに置いておきます。ソートした細胞を播種するための準備として、まず半凝固培地の成分を5 mLポリスチレンチューブに加えます。まず、16.5Gの針を使用して、3.3%メチルセルロース溶液を少量シリンジに吸い取ります。その後、すぐに溶液を押し出して空気を追い出します。これにより、シリンジ内のデッドスペースが溶液で満たされ、半固形溶液の容量を正確に測定できるようになります。次に、気泡が形成されないように注意しながら、規定量のメチルセルロース溶液を吸引し、5 mLチューブに分注します。条件化培地、FCS、ニコチンアミド、FGF-2、VEGF-A、およびDMEM/F12を添加します。次に、冷却したピペットチップを用いてマトリゲルを添加します。最後に、分取した目的の細胞を5 mLチューブに添加します。細胞の早期刺激を避けるため、細胞は必ず最後に加えてください。次に、チューブのキャップをしっかりと閉め、手で激しく十分に振ってください。振盪によって気泡が発生するため、チューブを氷上に5分間、あるいは小さな気泡が消えるまで置いてください。18.5ゲージの針を装着した1mLシリンジを用いて、半凝固培地細胞混合液を少量吸引し、直ちにシリンジ内の空気を排出します。次に、低接着24ウェルプレートの各ウェルの中央に、半凝固細胞混合液を500 µLずつゆっくりと分注します。各サンプルは4連で播種し、水平に配置した24ウェルプレートの内側4列のみを培養に使用します。細胞を含む培養液の加湿を助けるため、残りのウェルに滅菌水を満たします。播種後すぐに、光学顕微鏡で細胞を確認します。単一細胞がウェル全体にランダムかつ均一に分散していることを確認します。細胞を37°C、5% carbon dioxide airの条件下で8〜12日間培養します。8〜12日間の培養後、再び顕微鏡で細胞を観察します。これは、培養液中でMatrigelが均一に分布している良好な例です。こちらは、Matrigelが不均一に分布し、アパッチ構造（Apache framework）が生じた例です。Matrigelが存在しない場所では、コロニーは増殖しません。これは、半固形培地混合物にMatrigelを添加しなかったウェルの背景の例です。得られたコロニーを計数するために、プレートの下にグリッドを設置します。次に、10倍の対物レンズを用いてコロニーを観察し、計数します。培地が三次元構造であるため、コロニーは異なる焦点位置に現れます。したがって、光学顕微鏡による観察中、コロニーごとにフォーカス調整が必要になる場合があります。ここでは、8〜12日後の半固形培地におけるインスリン発現コロニーの代表的な顕微鏡写真を示します。矢印で示されたコロニーはランダムに分布しており、直径約60〜100 µmの、光を反射しない小さく暗いクラスターとして観察されます。個別に手作業でピックアップしたコロニーをマイクロ流路を用いてRT-PCR解析した結果、前回の報告と一致して、インスリン2およびグルカゴンの発現が認められました。これらの結果は、単一のNGN3-EGFP陽性細胞が、原始的な第1波のような内分泌細胞に類似した、2つのアイレットホルモンを同時に含むコロニーへと分化する能力を持つことを示しています。de novoインスリン産生のマーカーであるeptideのタンパク質発現は、ホールマウント蛍光染色を用いて確認されました。要約すると、本レポートに示した手順でインスリン発現コロニー形成能アッセイを実施すれば、コロニー形成能を持つ個々の前駆細胞数を容易に決定できる。本研究および前回の報告で示した通り、in vitroでラットES細胞から誘導された細胞をNGN EGFP陽性かつngn3 EGFP陰性細胞としてソートすることで、インスリン発現コロニー形成能細胞を濃縮できる。この手法に習熟すれば、ソート後の操作は1〜3時間で完了する。本手順を行う際は、細胞を完全に単一細胞懸濁液に解離させること、およびMatrigelの凝固を防ぐためにすべての培養成分を氷上で保持することを忘れないことが重要である。また、細胞への不適切な刺激を避けるため、細胞は最後にチューブに加える。本手順に続き、単一細胞がコロニー形成を開始させるのに十分かどうかといった追加の疑問に答えるため、単一細胞操作などの他の手法を実施することができる。この手法は、膵臓の幹細胞および前駆細胞生物学の分野における研究者の道を開くものです。これにより、自己複製能およびベータ細胞様細胞への分化能を探索することが可能になります。このビデオを視聴することで、インスリン発現コロニー形成前駆細胞の定量的コロニーアッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。

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Research

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Biology

生物学

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ここでは、提案する均質な時分割フレット (HTRF)...

均質な時間分解蛍光共鳴エネルギー転送を用いた測定インスリン分泌の検出

ここで提示される、色素希釈を用いた抗原タンパク質またはペプチドに応答して増殖CD4+T細胞を測定するためのプロトコルである。このアッセイは、特に希少な抗原特異的T細胞に対して感受性があり、抗原特異的細胞のクローニングを容易にするために改変することができる。...

カルボキシフルオレスチンスクシニミジルエステルを用いたヒト抗原特異的CD4+T細胞の増殖の定量化

このプロトコルは、β細胞からのインスリン分泌のプロキシとしてインスリン連結ガウシアルシフェラーゼを使用して中程度のスループットで迅速な低コストルシフェラーゼアッセイを行う方法について説明する。アッセイは、ほとんどの発光プレートリーダーおよびマルチチャンネルピペットで行うことができる。...

共分泌ルシフェラーゼサロゲートを用いた相対インスリン分泌の測定

幹細胞の膵島細胞への分化は、従来の糖尿病治療や疾患モデリングに代わるソリューションを提供します。市販の分化キットと以前に検証された方法を組み合わせて、インスリン分泌性幹細胞由来の膵島を皿で産生するのに役立つ詳細な幹細胞培養プロトコルについて説明します。...

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

この記事はセルのようなβ細胞の指示された微分そして機能分析のためのプロトコルを示す。インスリン産生膵細胞を作製する前のヒト多能性幹細胞の最適な培養条件と継代について記述します。6段階の分化は、決定的な内胚葉の形成から、グルコースに反応してインスリンを分泌する機能的なβ細胞様細胞へと進行します。...

ヒト多能性幹細胞から機能的な膵臓インシュリン分泌細胞を生成するための最適化されたプロトコル

私たちは、マウス脈絡叢のインスリン受容体アイソフォームIR-AおよびIR-BをマッピングするためのDuplex in situ...

RNA In Situ ハイブリダイゼーションアッセイによるマウス脳内のインスリン受容体AおよびBの精密な可視化

本研究は、マウス膵臓から機能的な一次膵島および腺皮細胞を効率的に抽出する簡略化された方法を開発し、急性膵炎誘発性糖尿病の病因における細胞間コミュニケーションの研究に貴重なツールを提供しました。...

マウスから一次膵島および一次膵臓細胞を同時に分離するための簡単かつ迅速な方法

学ぶ、インスリン発現コロニーを形成する膵前駆細胞の定量アッセイ。マウス胚性幹細胞由来のEGFP陽性細胞を半固形培地で培養し、コロニー形成頻度を算出する方法です。

インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

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