インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

このビデオでは、膵臓様前駆細胞をインスリン発現コロニーへと分化させるための三次元培養の手順を実演します。まず、neurogen 3 EGFPノックインマウス胚性幹細胞株由来の分化細胞を解離し、内分泌様前駆細胞を濃縮するためにEGFP発現に基づいてソートします。EGFP陽性にソートされた単一細胞を、matrigelと成長因子を含む半凝固培地に播種します。

これにより、個々の前駆細胞の移動が制限されますが、in vitro での生存、増殖および分化は可能になります。次に、特定のソート済み集団におけるコロニー形成前駆細胞の頻度を算出するため、特徴的な形態を持つ得られたコロニーの数を顕微鏡下で計数し、スコア化します。個々のコロニーをリアルタイム PCR および免疫蛍光顕微鏡で分析すると、ngn three 陽性細胞由来のコロニーではインスリンの発現が認められましたが、NGN three 陰性細胞由来のコロニーでは認められませんでした。

浮遊培養による膵球などの既存の手法と比較して本手法を用いる主な利点は、より大量の細胞を一度に同時に解析し、その固有の前駆細胞コロニー形成能を評価できる点にあります。この方法は、前駆細胞がどのマーカーを発現しているか、あるいはこれらの細胞の維持、自己複製、および分化にとってどの内在的または外在的因子が重要であるかなど、膵幹細胞および前駆細胞の生物学に関する疑問の解明に寄与します。本手法の意義は1型糖尿病の治療にまで及ぶ可能性があります。なぜなら、膵前駆細胞を特定し、β細胞様の細胞へと分化させることができれば、それらの細胞を末期1型糖尿病患者における損傷したβ細胞の置換に利用できるためです。

本手法は、出生後および成体膵臓、骨髄、肝臓、脾臓のコロニー形成前駆細胞の研究など、他の系にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、細胞を単一細胞懸濁液に解離させる操作や、分注準備におけるMatrigelおよびメチルセルロースの取り扱いに苦労すると思われます。私がこの手法を着想したのは、膵臓の前駆細胞とその分化した子孫細胞との間の系統関係を解析するためのクローン形成アッセイが存在しないことに気づいたときでした。

このようなコロニー形成アッセイは、これまで造血幹細胞および前駆細胞の研究において重要な役割を果たしてきました。私は、膵臓幹細胞の生物学を研究するためにも、このようなアッセイが必要であると考えています。半固形培地の成分は本質的に粘性が高く、調製および分注の手順を習得することが困難であるため、この手法を視覚的に提示することは極めて重要です。

本手順の実演は、修士課程のMichael Winkler氏、技術員のNancy氏、および研究室のポストドクターであるLang Jing博士が行います。後ほど実施するコロニーアッセイ用の調整培地を調製します。ニューロンES細胞をin vitroで膵臓様細胞へと分化させます。まず、光学顕微鏡で培養6日目の胚体を確認することから始めてください。

そのうち少なくとも30〜40%は、直径が150 µm以上である必要があります。より大きな胚体には、分化が進んでいることを示す暗いスポットが含まれているはずです。6ウェル付着プレートの各ウェルに80〜100個の胚体を移し、その後、プレートをゆっくりと揺らして胚体をウェルの中心に集め、細胞間接触を増加させます。

これらの接触により、胚体から膵島様細胞がより良好に分化します。プレートを37°C、5% 二酸化炭素の培養インキュベーター内に静かに戻します。 A 13。

培地を、内分泌細胞への分化を誘導するため、ニコチンアミドおよびヒト組換え活性化β-FGFを含む新鮮な付着培養培地に交換します。その後、培養物をインキュベーターに戻して培養を続けます。16日目に、培地を回収し、0.2 µmのポリエーテルスルホン膜でろ過して、細胞残渣を除去します。

以降、回収した培地を条件化培地と呼びます。条件化培地を15 mLの円錐形ポリプロピレンチューブに分注し、使用直前まで-80 °Cで保存します。Neurogenin 3は、発生過程において膵内分泌前駆細胞により発現する転写因子です。Neurogenin 3を発現する内分泌前駆細胞は、最終的に膵α、β、δ、ε、および膵ポリペプチドを発現する細胞へと分化します。NGN3を発現する細胞の同定を容易にするため、ノックインマウスES細胞株においてNNGN3遺伝子座の1アレルをEGFPレポーター遺伝子に置換しました。得られた細胞株をNGN3-EGFPと命名しました。分化したNGN3-EGFP陽性細胞およびNGN3-EGFP陰性細胞を得るため、

まず、16日目にトリプシンを用いて培養プレートから細胞を剥離し、単一細胞懸濁液を作成します。細胞塊をコラゲナーゼBおよびDNase Iとともにインキュベートし、40または70ミクロンのメッシュに通します。次にDPIを添加し、セルソーターを用いて、それぞれ細胞サイズと顆粒度を示す前方散乱光（forward scatter）と側方散乱光（side scatter）に基づいて細胞をソーティングします。

次に、非細胞性のデブリを除去するためにゲートを設定します。死細胞を識別するためにDPIを使用し、死細胞は陽性に染色されます。405〜413 nmで励起し、454/40フィルターで放出光を検出します。パルス幅によるゲーティング（電子的な前方散乱パルスの幅）によりダブレットを検出し、フローサイトメーター（FACS）に通す前にこれらを除去します。その後、EGFPチャネルFL1と自家蛍光のゲーティングを行います。

左パネルに示すTLなどの対照親細胞株の16日目の細胞を用いて、真の蛍光を照射することで、右パネルに見られるようにNGN3 EGFP陽性細胞集団を可視化できます。NGN3 EGFP陽性細胞のソートゲートは、ソート中のNGN3 EGFP陰性細胞の混入を制限するため、ここに示す矢印のように意図的に右側に移動させています。ゲートを設定後、NGN3 EGFP陽性細胞およびNGN3 EGFP陰性細胞をソートし、播種準備まで氷上で保存します。

実験の前夜に、Matrigelを4 °Cの氷上に置いておきます。実験当日は、以下の試薬または溶液を氷上に準備します：DMEM/F12、メチルセルロース、条件培地、FCS、ニコチンアミド、XTEND 4、VEGF-A、および組換えヒト活性化βB。使用の少なくとも30分前に、200 µLピペットチップの滅菌ボックスを-20 °Cに置いておきます。ソートした細胞を播種するための準備として、まず半凝固培地の成分を5 mLポリスチレンチューブに加えます。まず、16.5Gの針を使用して、3.3%メチルセルロース溶液を少量シリンジに吸い取ります。

その後、すぐに溶液を押し出して空気を追い出します。これにより、シリンジ内のデッドスペースが溶液で満たされ、半固形溶液の容量を正確に測定できるようになります。次に、気泡が形成されないように注意しながら、規定量のメチルセルロース溶液を吸引し、5 mLチューブに分注します。

条件化培地、FCS、ニコチンアミド、FGF-2、VEGF-A、およびDMEM/F12を添加します。次に、冷却したピペットチップを用いてマトリゲルを添加します。最後に、分取した目的の細胞を5 mLチューブに添加します。

細胞の早期刺激を避けるため、細胞は必ず最後に加えてください。次に、チューブのキャップをしっかりと閉め、手で激しく十分に振ってください。振盪によって気泡が発生するため、チューブを氷上に5分間、あるいは小さな気泡が消えるまで置いてください。

18.5ゲージの針を装着した1mLシリンジを用いて、半凝固培地細胞混合液を少量吸引し、直ちにシリンジ内の空気を排出します。次に、低接着24ウェルプレートの各ウェルの中央に、半凝固細胞混合液を500 µLずつゆっくりと分注します。各サンプルは4連で播種し、水平に配置した24ウェルプレートの内側4列のみを培養に使用します。

細胞を含む培養液の加湿を助けるため、残りのウェルに滅菌水を満たします。播種後すぐに、光学顕微鏡で細胞を確認します。

単一細胞がウェル全体にランダムかつ均一に分散していることを確認します。細胞を37°C、5% carbon dioxide airの条件下で8〜12日間培養します。8〜12日間の培養後、再び顕微鏡で細胞を観察します。

これは、培養液中でMatrigelが均一に分布している良好な例です。こちらは、Matrigelが不均一に分布し、アパッチ構造（Apache framework）が生じた例です。Matrigelが存在しない場所では、コロニーは増殖しません。

これは、半固形培地混合物にMatrigelを添加しなかったウェルの背景の例です。得られたコロニーを計数するために、プレートの下にグリッドを設置します。次に、10倍の対物レンズを用いてコロニーを観察し、計数します。培地が三次元構造であるため、コロニーは異なる焦点位置に現れます。

したがって、光学顕微鏡による観察中、コロニーごとにフォーカス調整が必要になる場合があります。ここでは、8〜12日後の半固形培地におけるインスリン発現コロニーの代表的な顕微鏡写真を示します。矢印で示されたコロニーはランダムに分布しており、直径約60〜100 µmの、光を反射しない小さく暗いクラスターとして観察されます。個別に手作業でピックアップしたコロニーをマイクロ流路を用いてRT-PCR解析した結果、前回の報告と一致して、インスリン2およびグルカゴンの発現が認められました。これらの結果は、単一のNGN3-EGFP陽性細胞が、原始的な第1波のような内分泌細胞に類似した、2つのアイレットホルモンを同時に含むコロニーへと分化する能力を持つことを示しています。de novoインスリン産生のマーカーであるeptideのタンパク質発現は、ホールマウント蛍光染色を用いて確認されました。

要約すると、本レポートに示した手順でインスリン発現コロニー形成能アッセイを実施すれば、コロニー形成能を持つ個々の前駆細胞数を容易に決定できる。本研究および前回の報告で示した通り、in vitroでラットES細胞から誘導された細胞をNGN EGFP陽性かつngn3 EGFP陰性細胞としてソートすることで、インスリン発現コロニー形成能細胞を濃縮できる。この手法に習熟すれば、ソート後の操作は1〜3時間で完了する。本手順を行う際は、細胞を完全に単一細胞懸濁液に解離させること、およびMatrigelの凝固を防ぐためにすべての培養成分を氷上で保持することを忘れないことが重要である。また、細胞への不適切な刺激を避けるため、細胞は最後にチューブに加える。本手順に続き、単一細胞がコロニー形成を開始させるのに十分かどうかといった追加の疑問に答えるため、単一細胞操作などの他の手法を実施することができる。

この手法は、膵臓の幹細胞および前駆細胞生物学の分野における研究者の道を開くものです。これにより、自己複製能およびベータ細胞様細胞への分化能を探索することが可能になります。このビデオを視聴することで、インスリン発現コロニー形成前駆細胞の定量的コロニーアッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。