Name: CD4 + Tリンパ球キャプチャHIVのための使い捨てマイクロ流体チップを用いた (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:03:52.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いたCD4陽性Tリンパ球の捕獲と定量法。PDMS製使い捨てチップでHIV診断に重要なヘルパーT細胞を高精度に分析し、資源制限下での免疫学研究に応用可能です。

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<ol><li>抗CD4 + biotinlayted表面とマイクロ流体チャネルを準備します。 </li><li>シリンジポンプとマイクロ流体チャネルに5ml /分でサンプルの血液10mlを注入する。 </li><li> PBSで20分間20ml /分で血を洗い流す。 </li><li> 15分間5ul/minで希釈FACS溶解溶液を（PBSで原液から10％に希釈）を注入。 </li><li> 15分間インキュベートする。 </li><li> 20分間5ml /分で一次CD3 +抗体溶液を（PBSで原液から10％に希釈）を注入。 </li><li> 2時間インキュベートします。 </li><li> 15分間を5 ml / minでPBSでチャンネルを洗い流す。 </li><li>同時に20分間、5ml /分で20％AF488 CD4 +抗体、0.2％DAPI原液、および10％の二次CD3 +抗体を注入する。 </li><li> 20分間インキュベートする。 </li><li> 15分間を5 ml / minでPBSでチャンネルを洗い流す。 </li><li>蛍光顕微鏡下で細胞を数える。 <ol><li>ホワイト（光） - 黒と白：セルとほこり</li><li> UV（DAPI） - 青：セルのみ</li><li>ブルー（CD4 +） -緑：T -リンパ球と単球</li><li>グリーン（CD3 +） -赤：T -リンパ球のみ</li></ol></li></ol>

<table><tbody><tr><td>PDMSマイクロチャネル</td><td></td><td></td><td></td><td>SU-8モールドにより作製</td></tr><tr><td>血液</td><td></td><td></td><td></td><td>健康なヒト被験者からの献血。Mass General Hospital（10倍高密度WBC）またはBrigham and Women&amp;rsquo;s Hospitalより提供。</td></tr><tr><td>PBS</td><td>緩衝液</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td>1x Dulbecco&amp;rsquo;s リン酸緩衝生理食塩水。</td></tr><tr><td>FACS溶血液</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>ストック溶液をPBSで10%に希釈。</td></tr><tr><td>抗CD4+ビオチン化抗体</td><td></td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>IM0704</td><td>抗CD4+ビオチン化抗体を用いて表面処理。0.2mgのストックと1mlの脱イオン水を混合後、ストック溶液をPBS/BSAで10%に希釈。</td></tr><tr><td>goat anti-hCD3delta</td><td>pAB</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1128</td><td>ストック溶液をPBSで10%に希釈</td></tr><tr><td>rabbit anti-goat IgG PE</td><td></td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-3755</td><td>抗CD3抗体用二次抗体。ストック溶液をPBSで10%に希釈</td></tr><tr><td>anti-human CD4+</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>557695</td><td>Alexa Fluor 488標識、ストック溶液をPBSで20%に希釈。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>4&amp;rsquo;,6-dianidino-2-phenylindole dihydrochloride溶液。ストック溶液をPBSで0.2%に希釈。</td></tr></tbody></table>

cd4 + tリンパ球キャプチャhivのための使い捨てマイクロ流体チップを用いた

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + Tリンパ球キャプチャHIVのための使い捨てマイクロ流体チップを用いた

こんにちは、リチャード・リンです。私はハーバード・MITヘルスサイエンス・テクノロジー部門のTI Mercy教授の研究グループで研究員を務めています。私が取り組んでいるプロジェクトは、リソースが限られた環境で使用することを目的とした、患者の血液中におけるCD4陽性およびCD3陽性Tリンパ球の定量および捕捉です。目の前にあるのは、PDMS（ポリジメチルシロキサン）で構成されたマイクロ流路デバイスです。このデバイスのチャネル自体の高さは 50 µm で、デバイス内の全容量は 10 µL です。これは非常に精密なデバイスであり、ヘルパーTリンパ球を捕捉するために使用します。基本的には、HIV患者の診断基準となるものです。マイクロ流体デバイスの表面にはすでにタンパク質が準備されており、シリンジ内にはCD4陽性抗体が入っています。現在はpH 7.4のPBS生物学的緩衝液のみが入っており、これをチャネルに流して余分なCD4陽性抗体を洗い流します。この段階では、単に余分な物質を洗い流そうとしているだけなので、流速を制御する必要はなく、流速がいくらであっても問題ありません。ここがデバイスの入口となり、こちらが左側（視聴者から見て右側）の出口となります。それでは、余分な抗体溶液を洗い流します。出口から液体が出てきているのがわかると思います。ごく微量ですが、注意深く見れば、チューブを通ってチャネルから液体が流出しているのが確認できます。余分な抗体溶液を洗い流しましたので、次に血液を注入する準備をします。まず、入口からチューブを外します。そして、ヒト全血を入れた新しいシリンジを用意します。したがって、これは患者のサンプルではなく、マイクロ流体デバイスに血液を注入する準備をしている間の、健康な被験者のサンプルです。まず、シリンジをシリンジポンプに取り付けます。次に電源を入れます。シリンジの流量が表示されており、ここでは 5 µL/min に設定しています。それでは、血液を注入するための準備を行います。注射器ポンプを垂直に設置します。周知の通り、血球は沈降するため、細胞がチャネルに流れ込むようにしたいからです。これにより、チューブのすぐ近くである底部に細胞が沈殿するようにします。これで、すべての準備が整いました。デバイスの容量は10 µLあたり10 µLです。また、チャネル壁に流したい液量も10 µLです。チャネルの色を確認することで、十分な量の血液が流れたかどうかを判断できます。全体が赤く満たされていれば、10 µLが注入されたことになり、シリンジバンパーを停止させるタイミングだと分かります。それでは、スタートボタンを押します。開始後、実際に血液がチャネルに入り込むまで時間がかかる場合がありますが、これは主に圧力によるものです。例えば、シリンジをセットした後、チューブ内の血液量を調

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

マイクロ流体デバイスを用いた細胞のキャプチャ

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