CD4 + Tリンパ球キャプチャHIVのための使い捨てマイクロ流体チップを用いた

こんにちは、私の名前はリチャード・リンで、ハーバードMIT健康科学技術学部のTIマーシー教授のグループの研究者です。私が取り組んでいるプロジェクトは、CDの4つの陽性Tリンパ球とC3陽性のTリンパ球を定量化し、捕捉することです。患者の血液は、リソースが限られている設定で使用されます。

私の目の前には、PDMSで構成されたマイクロフィルデバイス、つまりポリメチルスローンがあります。デバイス、チャネル自体、高さは50マイクロメートル、デバイス内の総体積は10マイクロリットルです。したがって、これは非常に精密なデバイスであり、ヘルパーTリンパ球を捕捉するために使用します。

基本的には、HIV患者の診断ベンチマークです。したがって、マイクロ流体デバイスの表面は、シリンジ内でタンパク質とCDの4つの陽性抗体ですでに調製されています。現在、pH 7.4のPBS生物学的緩衝液しかありませんが、これをチャネルに流して、余分なCD 4陽性抗体を洗い流します。

この段階では、余分なものを洗い流そうとしているだけで、レートが何であるかは実際には問題ではないため、レートを制御する必要はありません。これは、これがデバイスの入口がある場所であり、これが私たちの、私の左側とあなたの右側の出口になります。では、余分な抗体溶液を洗い流し、出口から液体が出ていることに気づくことができれば、これは非常に微量ですが、よく見ると、チューブを通じてチャネルから液体が出ていることがわかります。

さて、余分な抗体溶液を洗い流したので、今度は血液を注入する流れに備えることができます。そこで、チューブをインレットから抜きます。だから今、私たちは血液、人間の血液、全血のための新しい注射器を開きます。

つまり、患者のサンプルではなく、健康なサンプル、健康な被験者のサンプルであり、マイクロ流体デバイスに血液を注入する準備をします。そこで、シリンジをシリンジポンプに取り付けます。次に、電源を入れると、シリンジの流量が表示され、毎分5マイクロリットルに設定されています。

そして、私たちは基本的に血液に注射する準備をします。シリンジポンプを垂直に配置するのは、ご存知のように、血球が沈殿物を作り、細胞がチャネルに流れ込むようにしたいからです。ですから、細胞の沈殿物は、私たちのチューブのすぐ近くにある底に持っていきます。

これで、すべての準備が整いました。私のデバイスの容量は10マイクロリットルあたり10マイクロリットルです。また、チャネル壁に流し込む量も10マイクロリットルです。

ですから、チャネルの色を見るだけで十分な血液が流れ込んでいるかどうか、赤く塗りつぶされているかどうか、10マイクロリットルの血液が流れていることがわかり、シリンジバンパーを止めるべきだとわかります。だから、今、スタートボタンを押すと、時々始まります、時には血液が実際にチャネルに入るまでに時間がかかることもあります。そして、これはプレッシャーのようなものによるところが大きいです。

例えば、そこに注射器を装着すると、チューブ内の血液を調整するために、それに応じて液体を抜いたり注入したりすることがあります。ですから、何かしら時間がかかるかもしれませんが、一度水路に送り込まれ始めると、流量は毎分lyに設定されます。ですから、ここでは少し辛抱強く待つかもしれませんが、時には血液がチャネルに行き始めるまで2分、3分待たなければならないこともあります。

実は今、血液がチャネルに入り始めているのがわかります。したがって、デバイスはほぼ完全にいっぱいになったことがわかります。さて、では、チューブをPBSに戻し、チャネル内の血液を洗い流します。

そのために、チューブを取り外すためにすでに行ったことを繰り返します。PBSの流量を制御する必要があるため、シリンジポンプが必要です。ただし、血液が流れなくなったため、PBSには細胞がないため、シリンジポンプを垂直位置に置いておく必要はありません。

これで準備が整い、デバイスから血液を洗い流し、ここでシャープボタンをもう一度押します。ご覧のとおり、デバイスは一種のクリアになり始めています。縁にはまだ少し血がついていますが、ゆっくりと消えていきます。

ですから、すべての血液がなくなったら、毎分5マイクロリットルから毎分20マイクロリットルに速度を上げます。そして、この変化の理由は、血液中には実際にはC4陽性抗原を持つ2つの細胞タイプがあるためです。1つは、私たちが探していたもの、ヘルパーTリンパ球です。

もう1つは、単球と呼ばれるものです。私たちは、デバイスがヘルパーTリンパ球と単球の両方ではなく、ヘルパーTリンパ球のみを特異的に捕捉することを確認したいと考えています。そして、それを行う方法は、単球がヘルパーT細胞よりもサイズが大きいことがわかっているため、流量を増やすことです。

したがって、流量を増やすことにより、より大きな単球は、CDの4つの正のTヘルパー細胞よりも表面を離れるための圧力を多く受けます。だから今は大体20分くらいです。ですから、今、私の手元にあるのは、それが解決策です。

これは、FAX ライセンス ソリューションと呼ばれます。これの目的は、赤血球を溶かすことです。したがって、赤血球がチャネルに残っている場所はどこでも、この解決策はそれを横たわらせます。

これをストック溶液から10,10倍に希釈します。そこで、シリンジポンプを停止し、チューブを取り外し、基本的に溶液をこのシリンジの溶液と交換します。だから私は今、機械を止めて、チューブを取り外し、これを取り外し、この注射器で取り、新しいものと交換しています。

さて、すべての設定が完了したので、レートを毎分5マイクロリットルに戻します。したがって、レートを 20 からクリックし、それを 5 に減らし、FAX ライセンス ソリューションを 20 分間フローします。そして、次にスタートを押します。

ですから、今、私たちの目の前には、10倍の倍率で撮影されたデバイスの光学画像があります。ですから、ここでこれらすべての白い点を自分で見分けることができます。では、これらの細胞が探しているものであることを確認するにはどうすればよいでしょうか?

そこで、最初に使用する染色剤がdpiと呼ばれるもの、つまり核内のDPI染色液に染色されていることを確認するために、いくつかの異なる染色剤を使用します。ですから、基本的には核を持つ細胞、例えば白血球はすべて汚れていますが、核を持たない赤血球は染色されず、画像全体に広がっていることがわかります。それらはすべてこれらの青い点であり、すべての点が青です。

はセルです。次のステップは、細胞がC4陽性抗原と呼ばれるものを持っているかどうかを確認することです。私たちのデバイスの全体的な目的は、C 4つのポジティブセルを捕捉することであるため、これは非常に重要です。

次に、私たちが使用する蛍光抗体は、もちろんC4特異的です。そして、次のスライドに進みます。ですから、この写真では、細胞がはるかに暗くなっていますが、それは、私たちが通常使用する蛍光抗体は事実のためのものです。

したがって、希釈ははるかに高くなります。しかし、かなりよく見ると、このフィールドビューの周りにまだ点が散らばっていることがわかります。彼らはかなり薄暗いです。

しかし、よく調べてみると、これらの細胞はDCに正の細胞があることがわかります。そして、次のテストは、前に述べたように、Cの4陽性細胞には2つの異なるタイプがあるということです。1つはTヘルパー細胞が必要な細胞で、もう1つは単球と呼ばれるものです。

したがって、2つの細胞を区別するために別の蛍光抗体が再び必要になります。ですから、ヘルパーTリンパ球には、CDと呼ばれる3つの陽性抗原があることがわかっています。単球の場合はそうではありませんが。

次に使用する抗体は、この写真に示されているように、CD 3特異的抗体です。繰り返しになりますが、ドットがデバイスの周りに散らばっていることがわかります。ドットが大きく見えるのは、一部のセルが明るく輝くだけで、一部のセルがそうでないためです。つまり、この場合、多くのことが偶然に任せられますが、ほとんどの場合、これらの明るい赤い点のドットはすべてセルです。

ですから、繰り返しになりますが、私たちが望むのは、1つは、細胞がCD4陽性で、CD3陽性であることを確認してください。ですから、この場合、a、私たちの細胞の多くがd cdに3つの陽性であることがわかります、これは良いことです。それは私たちに私たちのキャプチャに特異性を与えます。

大きなdosは、ジャンクである可能性がありますが、多くの場合、セルがたまたまCD 3フラッシュ、CD 3を自分自身に集めることがあります。この写真では、これはこのマイクロ流体デバイスのために収集したデータの1つであり、基本的にはセルキャプチャプロです。前のものでは、スライドなど、セルが描かれた写真がたくさんあったことがわかります。

しかし、それらは実際には何に蓄積されるのでしょうか?ええと、それらはセルキャプチャプロファイルに蓄積され、その場合、X軸には入口からの距離、Y軸にはキャプチャセルディスクをプロットできます。そして、デバイス全体で、最初は密度が非常に高く、その後徐々に減少していくことがわかりますが、これは、血流からC4陽性細胞と3po陽性細胞、C3陽性細胞を捕捉し、血液サンプル中のこれらの細胞の濃度を低下させ

そして、これは基本的に私たちのデータが通常どのように表示されるかです。