Name: CD4 + Tリンパ球キャプチャHIVのための使い捨てマイクロ流体チップを用いた (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:03:52.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いたCD4陽性Tリンパ球の捕獲と定量法。PDMS製使い捨てチップでHIV診断に重要なヘルパーT細胞を高精度に分析し、資源制限下での免疫学研究に応用可能です。

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<ol><li>抗CD4 + biotinlayted表面とマイクロ流体チャネルを準備します。 </li><li>シリンジポンプとマイクロ流体チャネルに5ml /分でサンプルの血液10mlを注入する。 </li><li> PBSで20分間20ml /分で血を洗い流す。 </li><li> 15分間5ul/minで希釈FACS溶解溶液を（PBSで原液から10％に希釈）を注入。 </li><li> 15分間インキュベートする。 </li><li> 20分間5ml /分で一次CD3 +抗体溶液を（PBSで原液から10％に希釈）を注入。 </li><li> 2時間インキュベートします。 </li><li> 15分間を5 ml / minでPBSでチャンネルを洗い流す。 </li><li>同時に20分間、5ml /分で20％AF488 CD4 +抗体、0.2％DAPI原液、および10％の二次CD3 +抗体を注入する。 </li><li> 20分間インキュベートする。 </li><li> 15分間を5 ml / minでPBSでチャンネルを洗い流す。 </li><li>蛍光顕微鏡下で細胞を数える。 <ol><li>ホワイト（光） - 黒と白：セルとほこり</li><li> UV（DAPI） - 青：セルのみ</li><li>ブルー（CD4 +） -緑：T -リンパ球と単球</li><li>グリーン（CD3 +） -赤：T -リンパ球のみ</li></ol></li></ol>

<table><tbody><tr><td>PDMSマイクロチャネル</td><td></td><td></td><td></td><td>SU-8モールドにより作製</td></tr><tr><td>血液</td><td></td><td></td><td></td><td>健康なヒト被験者からの献血。Mass General Hospital（10倍高密度WBC）またはBrigham and Women&amp;rsquo;s Hospitalより提供。</td></tr><tr><td>PBS</td><td>緩衝液</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td>1x Dulbecco&amp;rsquo;s リン酸緩衝生理食塩水。</td></tr><tr><td>FACS溶血液</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>ストック溶液をPBSで10%に希釈。</td></tr><tr><td>抗CD4+ビオチン化抗体</td><td></td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>IM0704</td><td>抗CD4+ビオチン化抗体を用いて表面処理。0.2mgのストックと1mlの脱イオン水を混合後、ストック溶液をPBS/BSAで10%に希釈。</td></tr><tr><td>goat anti-hCD3delta</td><td>pAB</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1128</td><td>ストック溶液をPBSで10%に希釈</td></tr><tr><td>rabbit anti-goat IgG PE</td><td></td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-3755</td><td>抗CD3抗体用二次抗体。ストック溶液をPBSで10%に希釈</td></tr><tr><td>anti-human CD4+</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>557695</td><td>Alexa Fluor 488標識、ストック溶液をPBSで20%に希釈。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>4&amp;rsquo;,6-dianidino-2-phenylindole dihydrochloride溶液。ストック溶液をPBSで0.2%に希釈。</td></tr></tbody></table>

cd4 + tリンパ球キャプチャhivのための使い捨てマイクロ流体チップを用いた

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + Tリンパ球キャプチャHIVのための使い捨てマイクロ流体チップを用いた

こんにちは、リチャード・リンです。私はハーバード・MITヘルスサイエンス・テクノロジー部門のTI Mercy教授の研究グループで研究員を務めています。私が取り組んでいるプロジェクトは、リソースが限られた環境で使用することを目的とした、患者の血液中におけるCD4陽性およびCD3陽性Tリンパ球の定量および捕捉です。目の前にあるのは、PDMS（ポリジメチルシロキサン）で構成されたマイクロ流路デバイスです。このデバイスのチャネル自体の高さは 50 µm で、デバイス内の全容量は 10 µL です。これは非常に精密なデバイスであり、ヘルパーTリンパ球を捕捉するために使用します。基本的には、HIV患者の診断基準となるものです。マイクロ流体デバイスの表面にはすでにタンパク質が準備されており、シリンジ内にはCD4陽性抗体が入っています。現在はpH 7.4のPBS生物学的緩衝液のみが入っており、これをチャネルに流して余分なCD4陽性抗体を洗い流します。この段階では、単に余分な物質を洗い流そうとしているだけなので、流速を制御する必要はなく、流速がいくらであっても問題ありません。ここがデバイスの入口となり、こちらが左側（視聴者から見て右側）の出口となります。それでは、余分な抗体溶液を洗い流します。出口から液体が出てきているのがわかると思います。ごく微量ですが、注意深く見れば、チューブを通ってチャネルから液体が流出しているのが確認できます。余分な抗体溶液を洗い流しましたので、次に血液を注入する準備をします。まず、入口からチューブを外します。そして、ヒト全血を入れた新しいシリンジを用意します。したがって、これは患者のサンプルではなく、マイクロ流体デバイスに血液を注入する準備をしている間の、健康な被験者のサンプルです。まず、シリンジをシリンジポンプに取り付けます。次に電源を入れます。シリンジの流量が表示されており、ここでは 5 µL/min に設定しています。それでは、血液を注入するための準備を行います。注射器ポンプを垂直に設置します。周知の通り、血球は沈降するため、細胞がチャネルに流れ込むようにしたいからです。これにより、チューブのすぐ近くである底部に細胞が沈殿するようにします。これで、すべての準備が整いました。デバイスの容量は10 µLあたり10 µLです。また、チャネル壁に流したい液量も10 µLです。チャネルの色を確認することで、十分な量の血液が流れたかどうかを判断できます。全体が赤く満たされていれば、10 µLが注入されたことになり、シリンジバンパーを停止させるタイミングだと分かります。それでは、スタートボタンを押します。開始後、実際に血液がチャネルに入り込むまで時間がかかる場合がありますが、これは主に圧力によるものです。例えば、シリンジをセットした後、チューブ内の血液量を調整するために、適宜液体を吸引または注入することがあります。そのため、時間がかかる場合がありますが、一度チャネルへのポンピングが始まれば、流量は目的のly/minに設定されます。ここでは少し根気強く待つ必要があり、血液がチャネルに流れ始めるまで2〜3分ほどかかる場合があります。実際、現在血液がチャネルに入り始めているのが分かります。これで、デバイスがほぼ完全に満たされたことが確認できます。それでは、チューブをPBSに切り替えて、チャネル内の血液を洗い流します。そのため、チューブを取り外す際に行った操作を繰り返します。PBSの流量を制御し続ける必要があるため、引き続きシリンジポンプを使用します。ただし、もはや血液を流すわけではなく、PBS中に細胞は含まれていないため、シリンジポンプを垂直に保持しておく必要はありません。準備が整いましたので、これからデバイス内の血液をフラッシュします。こちらのシャープボタンをもう一度押します。ご覧のように、デバイス内がきれいになり始めています。端の方にまだわずかに血液が残っていますが、徐々に消えていきます。血液がすべて取り除かれたら、流速を5 µL/minから20 µL/minに上げます。この変更の理由は、血液中にはC4陽性抗原を持つ細胞タイプが実際に2種類存在するためです。そのうちの1つが、私たちが目的としているTヘルパーリンパ球です。もう一方は、単球と呼ばれる細胞です。デバイスが単球とTヘルパーリンパ球の両方ではなく、Tヘルパーリンパ球のみを特異的に捕捉するようにする必要があります。そのための手法として、単球はTヘルパー細胞よりもサイズが大きいことが分かっているため、流速を上げます。したがって、流速を上げることで、より大きな単球はCD4陽性ヘルパーT細胞よりも表面から離脱する強い圧力を受けることになります。現在は、おおよそ20分が経過したところです。今、私の手にあるのは溶液です。これは溶血ライシス溶液と呼ばれます。ここでの目的は赤血球を溶血させることです。チャネル内に赤血球が残っている箇所があれば、この溶液によって溶血されます。これはストック溶液を10倍に希釈したものです。次に、シリンジポンプを停止させ、チューブを取り外し、溶液をこのシリンジのものに交換します。それでは、装置を停止し、チューブを取り外します。これを取り外し、このシリンジに接続して、新しいものに交換します。準備が整いましたので、流速を5 µL/minに戻します。レートを20から5に変更し、FACS溶解液を20分間流します。それでは、スタートボタンを押します。現在、目の前にあるのは、10倍の倍率で撮影したデバイスの光学像です。ここに白い点が多く見えます。では、これらの細胞が目的の細胞であることをどのように確認すればよいでしょうか。ここでは、いくつかの異なる染色法を用いています。まず最初に使用するのはDPIと呼ばれる染色法で、これは核を染色します。したがって、白血球のように核を持つ細胞はすべて染色されますが、核を持たない赤血球は染色されません。画像全体を通して、青い点がたくさんあり、その一つひとつが染色されていることがわかります。細胞です。したがって、次のステップは、これらの細胞がC four陽性抗原と呼ばれるものを保持しているかを確認することです。当デバイスの目的はC four陽性細胞を捕捉することであるため、これは極めて重要です。次に、使用する蛍光抗体はもちろんC4特異的なものです。次のスライドに進みます。この写真で細胞がかなり暗く見えるのは、通常、使用する蛍光抗体がFar-red（遠赤色）であるためです。したがって希釈度は大幅に高くなっています。しかし、注意深く観察すると、この視野内にまだ点在するドットがあることが分かります。それらはかなり暗い色をしています。しかし、詳しく調べると、これらの細胞はCD4陽性であることがわかります。これは、まさに我々が求めている結果であるため、良好な状態と言えます。そして、前述した通り、次の試験では、CD4陽性細胞には2つの異なるタイプがあることを確認します。一つは目的とするTヘルパー細胞であり、もう一方は単球と呼ばれる細胞です。したがって、2種類の細胞を区別するために、別の蛍光抗体が再び必要になります。Tヘルパーリンパ球には、CD3陽性抗原と呼ばれるものが存在しますが、単球にはそれが存在しないことが分かっています。次に使用する抗体はCD3特異的なもので、こちらの写真で確認できます。ここでも、デバイス上にドットが散在しているのが分かります。細胞によって輝度の強さが異なるため、ドットの大きさが違って見えます。このケースでは多くの部分が偶然性に左右されますが、ほとんどの場合、これらの明るい赤色のドットはすべて細胞です。したがって、ここでも確認したいのは、細胞がCD4陽性かつCD3陽性であることです。この場合、多くの細胞がCD3陽性であることがわかりますので、良好な結果と言えます。これにより、キャプチャーの特異性が確保されます。大きな点は、ゴミである可能性もありますが、多くの場合、単に細胞がより多くのCD3を蓄積した、あるいはCD3が細胞に集積しただけということが起こります。この写真は、このマイクロ流体デバイスで収集したデータの1つであり、基本的には細胞キャプチャ・プローブです。前のスライドなどで、細胞が写っている写真がたくさんあったことがお分かりかと思います。では、これらは最終的にどのようなデータになるのでしょうか。それは細胞キャプチャプロファイルとなり、X軸に流入路からの距離、Y軸にキャプチャされた細胞数をプロットして示すことができます。デバイス全体を通して、初期の密度は非常に高く、その後徐々に低下していることが分かります。血流からC4陽性およびC3陽性細胞をキャプチャしているため、血液サンプル中のこれらの細胞濃度が減少していくということであり、これは予想される結果です。基本的に、私たちのデータは通常このように提示されます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

マイクロ流体デバイスを用いた細胞のキャプチャ

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