Name: の稀なケースでIgAおよび組織トランスグルタミナーゼ2抗体による表皮トランスグルタミナーゼの認識アカゲザル炎 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学ぶ、グルテン過敏性アカゲザルの皮膚におけるIgAと表皮トランスグルタミナーゼの自己免疫反応を可視化する方法。免疫蛍光染色と共焦点顕微鏡を用いて、疱疹状皮膚炎の病態メカニズムを解明します。

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著者は彼らの技術支援のためにアマンダタルドで、博士はモスタファBouljihad、ステファニーフィーリー、キャロルコイン、博士エリンRibka、博士はピートディディエとドロシーキュブラーに感謝します。この作品は、NIHの助成金R01 - DK076653とKSに3R01 - DK076653 - 02S1とTNPRC RR000164の基本オペレーティング助成金によってサポートされていました。

1。皮膚生検標本のコレクション<ol><li>前に皮膚生検の手順に、tiletamine塩酸塩とzolazepam塩酸telazol混合物（フォートダッジアニマルヘルス、フォートドッジ、アイオワ州）の2.5 mg / kgの筋肉内で動物を麻酔。横臥位までは麻酔薬の投与から動物を監視し、それらのエンクロージャから取り外します。 </li><li> betadineスクラブとアルコールを交互に準備を無菌的にサイズ40のブレード（オスタープロフェッショナルプロダクツ、マックミンヴィル、テネシー州）でオスターゴールデンA5シングルスピード獣医クリッパーを利用し、興味の皮膚領域から髪を削除します。選択された生検のサイト上に滅菌有窓ドレープを固定します。 </li><li>わずかな圧力で時計回りに180度時計回りと反楽器を回転させながら生検パンチが皮下TIに真皮層を介してトランセクトまで、無菌テクニックを使用して、皮膚に対して4.0ミリメートルMiltexパンチ皮膚生検器具（Miltex、ヨーク、ペンシルバニア州）を配置ssue。生検標本を取り出して、鉗子と皮下組織から無償で皮膚のtransected部分を把握する。 </li><li>靭帯パターン3 / 8サークルカット針（Ethilon、エチコン、ジョンソン＆ジョンソンメディカルリミテッド、バークシャー、英国）に接続されている3から0ナイロン縫合糸で皮膚の欠陥を閉じます。すべての動物に術後鎮痛のための筋肉注射では0.01 mg / kgの塩酸ブプレノルフィン（ホスピーラ、レイクフォレスト、イリノイ州）を得た。 </li></ol> 2。サンプル処理<ol><li>慢性皮膚炎と健常対照から皮膚生検サンプルで作業はアカゲザル。二〜三（直径4 mm）の各動物からのサンプルを生検取得します。 </li><li> 24時間（Z -修正、Anatech（株）、バトルクリーク、ミシガン州）亜鉛ホルマリンで最初のサンプルを修正し、ASP300ライカの組織のプロセッサ（ライカマイクロシステムズ社に、30分間水で洗浄、70％エタノールで簡単に洗浄、および場所組織は70％、80％、95％および100％エタノール48の昇順グレードで脱水、バッファローグローブ、KS）キシレンの二つの変更（フィッシャー）に続いて、各（フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、PA）を、分</li><li>室温で長期保存のためにパラフィンのメディア（フィッシャー）に埋め込みます。場所前の切片に20分間-20℃。ロータリーミクロトーム（HM325、Micromインターナショナル、ルドルフ、ドイツ）を用いて6μmの切片を作製します。帯電したスライド（フィッシャー）と一晩60℃での乾燥空気の上に置いてセクション。ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）の標準方式（後述）で染色。 </li><li>室温で30分間、2％パラホルムアルデヒド（USBコーポレーション、クリーブランド、オハイオ州）で二番目のサンプルを修正し、（PBS、ギブコ- Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、30％ショ糖の代わりに（フィッシャー）のために4時間、およびOCT凍結培地（サクラファインテック、トーレンス、カリフォルニア州）に埋め込みます。前の切片に20分間、80℃で保管してください。クライオスタットを（HM560、サーモサイエンティフィック、カラマズー、ミシガン州）を使用して15μmの切片を作製します。 </li></ol> 3。 H＆E染色<ol><li>埋め込みを脱パラフィンキシレンの三つの変更（フィッシャー）を通じて、DEDのセクションおよび傾斜ethanolsを通して水分補給をする：100％、95％の二つの変更、80％、蒸留水のいずれかの変更が、2分ごとの3つの変更を。 </li><li> 1分間のためのヘマトキシリン​​（リチャード - アラン科学、カラマズー、ミシガン州）で染色し、水道水を流しての簡単な洗浄によって従ってください。 </li><li> 6分間エオシン（シグマ）と対比。 </li><li> 95％と無水エタノール、キシレンの三つの変更で2分ごとにしてクリアを2回交換し、3分ごとに通過ステンド組織を脱水する。 </li><li> H＆E染色切片上Cytoseal封入剤を使用してマウントのカバーガラス（リチャード - アラン科学）。 </li></ol> 4。病理組織学的評価 SPOTインサイトデジタルカメラ（デジタルインスツルメンツ社、ミシガン州、米国）との組み合わせで最大40倍の倍率とライカの顕微鏡 - 4を使用して光学顕微鏡下でH＆E染色生検皮膚切片を検査する。 5。免疫蛍光STAI寧<ol><li>免疫蛍光染色のためのOCT -埋め込まれた皮膚切片で動作。染色する前に、PBSで20分が0.1％でOCTを削除すると、組織を透過性にトリトンX - 100（Sigma社）0.2％、魚皮ゼラチン（FSG、Sigma）を含むために浸漬。 </li><li>スライドを洗浄した後、加湿スライドチャンバー内で、室温で、1時間PBS - FSGで希釈した10％正常ヤギ血清（NGS、シグマ）、でインキュベートする。 </li><li> IgAとtTG2抗体の沈着を可視化するために、1時間に10％NGS - PBS - FSGで希釈した抗アカゲザルIgAおよびtTG2一次抗体、を使用してスライドをインキュベートする。 </li><li> 10分間PBS - FSGが続く10分、のためにPBS - FSG -トリトンX - 100（Sigma）で洗ってください。 </li><li> 1:1000希釈でのAlexa Fluor ®蛍光色素488（緑）、568（赤）または633（青）（Molecular Probes社 - インビトロジェン社）でタグ付けされた二次、アイソタイプ特異的抗体でインキュベートする。核DNAを可視化するToPro - 3色素を使用してください。抗体の希釈液として10％NGS - PBS - FSGを使用してください。 </li><li>染色した組織切片をマウントするためにアンチクエンチング溶液（Sigma）を使用してください。 </li></ol> 6。共焦点像 488nmでアルゴン - クリプトンレーザー（緑）、568 nmのクリプトンレーザー（：3つのレーザー（利用可能な励起のための6行）を搭載したライカTCS SP2共焦点レーザー走査顕微鏡（ライカ、ヴェッツラー、ドイツ）でイメージングを実行する赤）とスペクトルの遠赤側からは見えませんからスパン633 nmの（青）、ヘリウム - ネオンレーザー。非標識組織アーキテクチャの評価のための記録の微分干渉コントラスト（DIC）のイメージ。 7。代表的な結果 tTG2およびIgA抗体の両方でETGの肯定的な認識の例を図に示します。 3A。人間の患者の状況とアカゲザルでもグルテン感受性CD -様よりDHのような皮膚炎の非常に低い有病率に起因すると一貫性、皮膚生検標本のほとんどは、翔に期待されていますワットtTG2抗体とがtTG2 +型IgA +二重陽性細胞（図4）の存在なしに陽性反応。これらのDH -無関係な微生物起源の皮膚炎の場合を含む場合は、、いくつかの単一陽性型IgA +上皮の下に散らばって細胞がtTG2およびIgA標識マーカー（図3B及び4）の間にないスペクトルの重なりを明らかにする。したがって、それは病理組織学的評価（図2）と、他の、より一般的な皮膚炎の原因となる薬剤も特定できない場合にのみ、焦点が続く臨床検査（図1）、で始まる、提案されたテスト手順の順序を維持することが重要です。 tTG2とIgAについて染色した皮膚生検の顕微鏡検査が保証されている。単独で臨床的および/または病理組織学的評価は、この条件の肯定的な診断には十分ではありません。このような場合で、二重陽性（tTG2 + IgAの+）細胞が真皮乳頭の領域の周囲に識別され、DHのような皮膚炎の診断を発行することができます。食事のグルテンのような場合には、撤退とグルテンフリー食事療法の投与は、皮膚炎の症状を緩和するために推奨されます。 <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1前EM96マカクの鼠径部（A）と後（B）5週間の食事グルテンの撤退。食事グルテンの再導入は、皮膚炎の再現（C）と一致した。 <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。HEは、前に収集EM96マカク皮膚生検の染色（A）と後（B）9週間のための食事グルテンの撤退。 ：上皮は角化細胞の厚い表層地殻変性好中球を浸透して（上皮細胞の7月15日層）厚く。好中球は上皮の内側にも表示され、リンパ球、形質細胞、及び真皮上層の付属器周囲組織球の中程度の数値と混合されています。 B：一部hyperkeratOSISがまだ存在する、上皮の厚さは、真皮上層の最小限のリンパ形質細胞の浸潤と（4-7層）正規化されています。 C：無リンパ形質細胞の浸潤とFR56ニホンザルからのノーマル腹部の皮膚は、、比較のために含まれています。倍率20倍。 <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。前に収集EM96マカク皮膚生検の共焦点顕微鏡像（A）と後（B）9週間のための食事グルテンの撤退。 ：IgAの染色（緑）、tTG2（赤）とToPro - 3核DNAマーカー（青）。 IgAとtTG2の共局在は皮膚papilaeの周辺に黄色で表示されます。 B：グルテンフリー食には、いくつかの上皮下のIgAがまだ存在している間tTG2（赤）、（緑）上皮内にはIgAを示していないとToPro - 3核DNAマーカー（青）の9週間後に採取した皮膚サンプル。 <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。 動物が慢性的（DH -無関係）皮膚炎の症状を示すしている間に収集GI24アカゲザルの皮膚生検の強い&gt;共焦点顕微鏡画像。 IgAの染色は赤で緑、tTG2にあり、ToPro - 3核DNAマーカーが青になります。赤と緑のマーカーの間には広範なスペクトルの重なりが検出されない間、tTG2 +細胞は、上皮下に上皮、いくつかの型IgA +細胞の内部に存在する。 <table border="1"><tbody><tr><td> 動物タグ </td><td> セックス [M / F] </td><td> 年齢 [年] </td><td> 臨床症状 </td><td> プラズマtTG2 抗体 </td><td> ダイエット [1,2] * </td></tr><tr><td> HJ71 </td><td> F </td><td> 1.3 </td><td>健康</td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HD13 </td><td> M </td><td> 1.4 </td><td>健康、時折の下痢</td><td> + </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FR56 </td><td> M </td><td> 5.4 </td><td>慢性特発性下痢</td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> EM96 </td><td> F </td><td> 5.0 </td><td>慢性皮膚炎</td><td> + / - （ボーダーライン） </td><td> 1と2 </td></tr><tr><td> GI24 </td><td> F </td><td> 4.6 </td><td>慢性皮膚炎</td><td> - </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>皮膚生検のコレクションのために使用される表1。TNPRCはアカゲザル *ダイエット1 - 定期的なサルチョウ（グルテン含有）、ダイエット2 - グルテンフリー食

<ol><li>Diosdado, B., Wijmenga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+the+adaptive%2C+innate+and+regulatory+immune+responses+in+the+intestinal+mucosa+of+celiac+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).</li>
<li>Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+nutritional+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr.+Clin.+Care%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management.</a> Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).</li>
<li>Sardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+transglutaminase+%28TGase+3%29+is+the+autoantigen+of+dermatitis+herpetiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis.</a> J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).</li>
<li>Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+against+epidermal+transglutaminase+are+a+sensitive+diagnostic+marker+in+patients+with+dermatitis+herpetiformis+on+a+normal+or+gluten-free+diet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Acad.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).</li>
<li>Bethune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+and+enzymatic+detoxification+of+gluten+in+gluten-sensitive+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques.</a> PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).</li>
<li>Mazumdar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+transepithelial+passage+of+the+immunogenic+33-residue+peptide+from+%CE%B1-2+gliadin+in+gluten-sensitive+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques.</a> PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).</li>
<li>Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+from+pathogenesis+to+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies.</a> Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).</li>
<li>Hunt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+identified+genetic+risk+variants+for+celiac+disease+related+to+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response.</a> Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).</li>
<li>Abadie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+genetic+and+immunological+insights+into+a+model+of+celiac+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

グルテン感受性の私達の新しく設立された非ヒト霊長類モデルは、最近の食事グルテン5,6によって引き起こされる腸の透過性の変化を研究するために使用されていました。プラズマtTG2抗体だけでなく、腸のtTG2 +型IgA +堆積物は、いくつかのグルテンに敏感なマカクザルで検出された。我々は最近、アカゲザルコロニーでは通常の（代謝/感染症）病因が確立できなかったニホンザルを、特発性皮膚炎のまれな事件を識別するので、本研究の目的は、評価することである場合tTG2 +型IgA +抗体の鉱床は、これらのまれなケースから皮膚サンプルで検出することができた皮膚炎の（表1）。 1:70と1:200 7の間のCDの範囲を示すものであるtTG2自己抗体の有病率。グルテン過敏性のマカクとの我々の研究では、キャプティブのtTG2抗体の有病率は、アカゲザル、ヒト集団から報告されたものに類似してニホンザルを示している。程度Oに影響を与えると思われる主な環境と遺伝的要因ヒトとニホンザルの両方にfをそのような有病率は、8,9を代役されています。 CD...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や機器の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号/製品コード </td><td> （注） </td></tr><tr><td>抗ヒトIgA - FITC * </td><td>シグマ、セントルイス、MO </td><td> F - 5259 </td><td> 1:100希釈率</td></tr><tr><td>抗ヒトtTG2 </td><td>サーモサイエンティフィック、カラマズー、ミシガン</td><td> MS - 300 - P1ABX </td><td> 1:100希釈率</td></tr><tr><td>抗マウスIgG1 ** </td><td>インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州</td><td> - 21124 </td><td> 1:1000希釈率</td></tr><tr><td> ToPro - 3 DNAプローブ*** </td><td>インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州</td><td> T - 3605 </td><td> 1:1000希釈率</td></tr><tr><td>ホルマリン亜鉛 （Z -修正） </td><td> Anatech（株）、バトルクリーク、ミシガン</td><td> 171 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> OCT凍結 中</td><td>サクラファインテック、トーレンス、カリフォルニア州</td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal取り付け 中</td><td>リチャード - アラン科学、カラマズー、ミシガン</td><td> 8312から4 </td><td></td></tr><tr><td>アンチクエンチング ソリューション</td><td>シグマ、セントルイス、MO </td><td> P 3130 </td><td></td></tr><tr><td> Ethilon （ナイロン縫合糸） </td><td>エチコン、ジョンソン＆ジョンソン、バークシャー州、イギリス</td><td> 663G </td><td></td></tr><tr><td> Miltexパンチ皮膚生検器具</td><td> Miltex、ヨーク、ペンシルバニア州</td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td>オスターゴールデンA5サイズ40ブレードとシングルスピードの獣医クリッパー</td><td>オスター製品、マックミンヴィル、テネシー州</td><td> 78005-050 </td><td></td></tr><tr><td>ライカのティッシュプロセッサ</td><td>ライカマイクロシステムズ株式会社。、バッファローグローブ、カンザス州</td><td> ASP300 </td><td></td></tr><tr><td>回転式ミクロトーム</td><td> Micromインターナショナル、 ルドルフ、ドイツ</td><td> HM325 </td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>サーモサイエンティフィック、 カラマズー、ミシガン</td><td> HM560 </td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ、ウェッツラー、 ドイツの</td><td> TCS SP2 </td><td></td></tr></tbody></table> *フルオレセインイソチオシアネート tTG2一次抗体の後に使用される**セカンダリ（のAlexa Fluor ® 568 -共役）抗体 **色素

の稀なケースでigaおよび組織トランスグルタミナーゼ2抗体による表皮トランスグルタミナーゼの認識アカゲザル炎

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

組織トランスグルタミナーゼ2（tTG2は）すでに部分的に消化された食物グルテンなどグリアジンのペプチドをdeamidates腸の消化酵素です。遺伝的素因のある個体では、tTG2は小腸壁1,2にtTG2抗体およびその直接堆積の生産によって特徴づけられる自己免疫応答をトリガします。このような抗体の存在は、セリアック病（CD）の主要な特徴の一つである。表皮トランスグルタミナーゼ（ETG）はまた、CD患者のごく少数の自己抗原として​​機能することができるトランスグルタミナーゼファミリーの別のメンバーです。これらは比較的まれなケースでは、ETGは臨床的に疱疹状皮膚炎（DH）として知られる自己免疫反応（皮膚の発疹）をトリガします。 CDとDH発症の正確なメカニズムはよく理解されていないが、それが知られているtTG2とCDとDH患者3,4の両方から血清抗体によって認識することができる株式の抗原エピトープをETG。 アカゲザル ）（表1、図1および図2）の皮膚病変からの生検サンプルの共焦点顕微鏡検査は患部組織を研究するために使用されていました。一匹（EM96）でIgAとtTG2抗体（図3）のスペクトルの重複が実証された。ダブルポジティブtTG2 +型IgA +細胞の存在は、真皮乳頭の周りに、深い表皮に集中していた。これは、DHの患者3に記載された病変と一致している。 EM96は、グルテンフリー食事療法、皮膚炎だけでなく、tTG2に置かれたときに+型IgA +預金は消失し（図1-3）はもはや検出されなかった。皮膚炎は、EM96での食事グルテンの再導入（図示せず）に基づいて、しかし、再び現れた。関係のない皮膚炎を持つ動物を含む他のニホンザルでは、tTG2 +型IgA +預金は検出されなかった。その皮膚のtTG2の存在と一緒にEM96の皮膚炎のグルテンフリー食事療法に依存した寛解+型IgA +細胞は、DH -など、自己免疫を示唆しているこの条件の開発のためのメカニズム。これは、任意の非ヒト霊長類におけるDHのような皮膚炎の最初の報告である。

疱疹状皮膚炎（DH）は、IgAおよび表皮トランスグルタミナーゼ（ETG）の間に自己免疫反応を特徴とする慢性炎症性疾患です。 DHは、グルテン過敏性および/または腹腔患者の非常に小さな部分で開発しています。この研究の結果は、DHもidiopatic皮膚炎の症状とアカゲザルのホストで開発できることを示している。

の稀なケースでIgAおよび組織トランスグルタミナーゼ2抗体による表皮トランスグルタミナーゼの認識アカゲザル炎

組織トランスグルタミナーゼ2（tTG2）は、すでに部分的に消化された食事性グルテン（例：グリアジンペプチド）を脱アミド化する腸管消化酵素である。...

このビデオ記事では、疱疹性皮膚炎を伴うグルテン感受性Reeses Maccasの皮膚における自己免疫反応を可視化する方法を実演します。まず、これらの特発性症例および年齢を一致させた健康対照群から、他に一般的に診断される皮膚炎の原因とは結びつかない皮膚炎を持つ個体を特定します。その後、患部から皮膚サンプルを採取し、組織構造、炎症、および表皮トランスグルタミナーゼの存在を評価します。採取した自己抗体サンプルを亜鉛固定し、2%パラアルデヒドヘマチンを用いてEOSINまたはH&amp;E染色を行います。その後、炎症の程度と組織病理学的に評価するための染色を行い、さらに表皮トランスグルタミナーゼ自己抗体が深層表皮に沈着しているかを評価するために免疫蛍光染色を行います。疱疹性皮膚炎は、IgAと表皮トランスグルタミナーゼとの間の自己免疫反応を特徴とする慢性炎症性疾患であり、グルテン感受性セリアック病患者のごく一部に発症します。本研究の結果は、グルテン感受性を持つアカゲザルのごく一部においてもDHが発症し得ることを示しています。我々の結果は、提示されたグルテン感受性の最新のResus Meacモデルの妥当性を裏付けるものです。結果は、この疾患の臨床症状が小腸のみに限定されないことを示しています。標準的なプロトコルでは、特発性皮膚炎を有する動物1匹と、年齢を合わせた健康な対照動物1匹を用います。適切な麻酔を施し、無菌操作を用いて部位の準備を行った後、4.0 mmのMiltexパンチ皮膚生検器具を動物の皮膚に当て、軽く圧力をかけます。生検パンチが真皮層を貫通して皮下組織に達するまで、器具を時計回りおよび反時計回りに180度回転させます。ピンセットを用いて、2回目の生検を同様に繰り返します。切断された皮膚の一部を把持し、皮下組織から剥離します。H&amp;E染色のために処理する1つ目のサンプルを亜鉛ホルマリンに入れます。次に、免疫蛍光顕微鏡で評価する2つ目のサンプルを、3/8円の切弧針と3-0ナイロン縫合糸を用いて2%パラホルムアルデヒドに固定します。皮膚の欠損部を十字縫合で閉鎖します。この工程を繰り返し、各動物から2〜3個の生検サンプルを採取します。IGAおよびTTG 2の存在と局在を調べるため、書面によるプロトコルに詳述されている通り、術後の鎮痛処置を行います。まず、2%パラホルムアルデヒドに浸漬したサンプルを室温で4時間インキュベートし、固定を行います。固定後、パラホルムアルデヒドを除去し、ロッカー上でPBSを用いて30分から60分間洗浄します。この操作を2回繰り返し、計3回の洗浄を行います。その後、PBSを除去し、30%スクロースに置換して、最低4時間から最大2週間まで保持します。次に、サンプルをOCT包埋剤に入れ、2-メチルブタンとドライアイスのバスに浸します。透明なOCTが不透明な白に変わるまで待ち、完全に凍結したことを確認します。その後、ブロックを-80 °Cで少なくとも20分間保存します。これにより組織が完全に凍結し、刃が組織を押しつぶすことなく切断できるようになります。組織はOCTを用いて-80°Cで長期保存できます。薄切後、スライドに貼付し、OCTを除去して組織を透過させます。0.2%魚皮ゼラチンおよび0.1%Triton X-100を含むPBSを入れたコペランドジャーにスライドを浸します。次に、ジャーをロッカースタッカーに載せて20分間回転させます。20分後、0.2% 魚皮ゼラチン含有PBSでスライドを10分間洗浄し、続いて0.2% 魚皮ゼラチン含有PBSで希釈した10%正常ヤギ血清とともに、加湿スライドチャンバー内にて室温で40分間インキュベートします。抗resus IGAおよびTTGの2種類の一次抗体をそれぞれ個別に用い、スライドを1時間インキュベートします。次に、スライドの端を持って、転送ピペットを用いてP-B-S-F-S-G Triton X 100を緩やかに噴霧します。その後、同じバッファーを入れたコープランドジャーに配置します。次に、ジャーをロッカースタンドに置き、10分間振盪します。この洗浄操作をもう一度繰り返します。次に、P-B-S-F-S-Gで10分間洗浄します。その後、アイソタイプ特異的なAlexa-labeled二次抗体とともに40分間インキュベートします。前と同様にスライドを洗浄します。次に、核DNA染色剤をProTide抗消光封入剤に1:2000の割合で希釈して添加します。この封入剤を各スライドに1滴ずつ直接滴下します。その後、組織の上にカバーガラスを被せ、ネイルポリッシュで封印します。スライドを暗所に置き、乾燥させます。IGAおよびTTGの2重染色を可視化するため、組織記録に使用した非標識組織の評価に用いた二次抗体に適合するレーザーを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡を用いてイメージングを行い、微分干渉（DIC）像を記録します。DICは、組織をグレースケールで分解する顕微鏡内のチャンネルです。これにより、細胞構造をより正確に特定し、HNE染色を行うことが可能になります。亜鉛固定した試料は、まずパラフィンで包埋し、スライドガラス上に薄切します。その後、スライドを60 °Cで一晩焼成し、自動染色機にセットしてHNEによる染色を行います。染色後、デジタルカメラを備えた光学顕微鏡を用いて、Forexおよび40倍の倍率で染色した生検切片を観察します。各倍率につき3〜4枚の画像を記録してください。ここでは、食事性グルテンの除去が皮膚炎に及ぼす影響を調べるため、ラウスマカクの皮膚病変から生検サンプルを採取し、本ビデオで説明した方法で染色しました。食事からグルテンを除去する前の、あるマカクの鼠径部を示しています。この個体にグルテンフリー食を与えたところ、皮膚炎は消失し、ここに見られるように検出されなくなりました。組織構造を評価するため、食事にグルテンを再導入したところ、皮膚炎が再発しました。グルテンの除去前にH&amp;E染色の実施を行った。上皮は7〜15層の上皮細胞で肥厚しており、変性好中球が浸潤した過角化細胞による厚い表層の痂皮が認められた。また、食事からのグルテン除去を9週間継続した後、上皮内に好中球が出現し、上層真皮の皮膚付属器周囲において、中等量のリンパ球、形質細胞、および組織球と混在していた。一部に過角化症と上皮の肥厚が依然として認められたが、比較すると真皮上層におけるリンパ形質細胞浸潤は最小限であった。ここでは、上皮の肥厚や真皮上層へのリンパ形質細胞浸潤が見られない正常な腹部皮膚を示す。食事からのグルテン除去前に採取された同一のマカク皮膚生検の共焦点顕微鏡画像において、緑色で示されるIGAと赤色で示されるttg twoの共局在が真皮乳頭周囲に黄色として現れており、表皮トランスグルタミナーゼに対する自己抗体の存在が示されている。グルテンフリー食を9週間継続した後、To Pro 3核DNAマーカーが青色で示されています。上皮内ではIgAが観察されなくなり、黄色で示される表皮トランスグルタミナーゼに対する自己抗体が存在しないことが示されました。緑色で示される一部の上皮下IgAは依然として認められました。また、無関係な特発性皮膚炎の個体を含む他の個体においても、To Pro 3核DNAマーカーが青色で示されています。自己抗体は検出されませんでした。IgA染色は緑色、ttg2は赤色、TOP2-β（核DNAマーカー）は青色で示されています。ttg2陽性細胞が上皮内部に存在しています。上皮の下に少数のIGA陽性細胞が認められます。赤色と緑色のマーカー間に広範なスペクトルの重複は見られず、表皮トランスグルタミナーゼに対する自己抗体が存在しないことが示されています。本研究では、共焦点顕微鏡を用いて、表皮トランスグルタミナーゼに対するIGA自己抗体の存在を可視化します。本手順を実施する際は、皮膚炎の症例の多くはグルテン感受性によるものではないことを念頭に置くことが重要です。したがって、血清中のanti gladinおよび抗組織トランスグルタミナーゼ抗体の検出を含む他の手法と、慎重な臨床評価を事前に行う必要があります。それにもかかわらず、疱疹性皮膚炎の有病率は、提示されたグルテン感受性腸症の有病率よりも低くなります。この疾患を持つ個体がさらに特定されることを前提として、得られた結果は今後の研究の基礎となる。

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