マウスにおける頭蓋内異種移植研究のための簡単なガイドスクリュー方式
September 26th, 2011
神経膠腫の治療のための新たな治療パラダイムを評価するために、生理学的な関連モデルが不可欠です。我々は、定位のアプローチよりもより迅速かつ安全である頭蓋内移植モデルの確立のための埋め込み型ガイド用ネジの手順を利用する。
この手順の目標は、脳腫瘍の頭蓋内移植片を生成して、新しい治療薬の有効性を評価することです。これは、最初にボルトで固定し、ガイドネジを頭蓋骨の所定の位置に固定し、次にガイドネジを介して脳に細胞を注入することによって達成されます。次のステップは、脳内に定着した腫瘍細胞を標的とした治療チャレンジを開始することです。
その後、生存転帰を評価することにより、動物の治療反応を監視します。最終的に、治療薬は、対照群と比較して、治療群の腫瘍の成長と生存に影響を与える可能性があります。この手順は、細胞注入の数日前に行うことができます。
マウスの体重を量り、腹腔内注射によりケタミンとキシラジンの混合物でマウスを麻酔することから始めます。マウスがつま先のつま先に反応しない場合は、ヨウ素で頭皮を準備し、正中線の右側と口腔間線の前方に2〜3ミリメートルの切開を行います。この切開により、頭蓋骨の冠状縫合糸と矢状縫合糸が露出します。
bgma は、これら 2 つの縫合糸の接合部に配置されます。ガイドねじエントリを bgma の 0.2 0.5 mm 横方向、bgma の 1 mm 前方にマークします。この点は、CAUの8つの原子核の真上にあります。
次に、ハンドヘルドツイストドリルを使用して、デュラボルトに1ミリメートルの深さの穴を開けます。滅菌されたガイドネジを穴に差し込み、頭蓋骨の表面と同じ高さになるまで挿入します。ネジが頭蓋骨の表面に触れたらすぐに、ネジを進めるのをやめてください。
ネジが頭蓋骨をへこませると、頭蓋骨が骨折する可能性があります。ガイドネジは、長さ1.6mmの26ゲージの針を支えています。ガイドネジの開口部を閉じるには、ガイドネジまたはネジダミーをガイドに挿入します。
今すぐねじ込みます。鉗子で切った皮膚を一緒に保持し、獣医のボンドの滴で皮膚を接着して傷を閉じ、皮膚の切断端に沿って広げ、皮膚が付着するまで数秒間保持します。最後に、腹腔内注射による逆転鎮痛薬とカルプロフェン鎮痛薬を提供し、マウスが温暖化マットで回復するのを待ちます。
回復には最大 20 分かかる場合があります。この実験例では、U 87 mgの神経膠腫細胞を、D-M-E-M-F 12に5%ウシ胎児血清を添加した大型組織培養フラスコで培養しました。このセクションでは、注射当日にこれらの細胞を注射用に準備する方法について説明します。
最初にフラスコを温かいPBSで2回洗浄して細胞を採取します。次に、0.25%トリプシンと0.05%EDTAを含むPBSを10ミリリットル加え、細胞を摂氏37度で5分間、または細胞が外れるまでインキュベートします。次に、細胞を10ミリリットルの培地に集めます。
細胞をヘモサイトメーターに置き、細胞を追って顕微鏡で細胞をカウントします。10ミリリットルの培養液、培地、細胞が入った50ミリリットルの円錐管をカウントし、Gの300倍で4分間遠心分離します。スピン後、1ミリリットルあたり1000万細胞の濃度で培養培地中の細胞を再懸濁します この濃度では、細胞懸濁液の各5マイクロリットルには50, 000個の細胞が含まれ、これは各頭蓋内注射に使用されます。
氷上に注射するための細胞懸濁液を保管します。ここでは、5マイクロリットルの容量が蒸発しやすく、細胞が破壊されるため、1容量の細胞が懸濁液中に必要です。袖口付きのハミルトン注射器を準備することから始めます。
針の先端に小さなプラスチックリングを取り付けて、針の2ミリメートルだけがガイドスクリュー出口の下に伸びるようにします。これにより、接種ポイントが3.5ミリメートルの深さになり、以前に増強されたマウスに麻酔をかけ、ガイドの上に小さな切開を行います。スタイレットをねじ込んで取り外します。
次に、氷上に保存されたよく混合された細胞の5マイクロリットルをシリンジに充填します。注射器内の気泡は、注射部位から細胞の塞栓症や逆洗を引き起こす可能性があるため、シリンジ内に気泡が入らないように注意してください。シリンジを灌流ポンプに固定し、針をガイドに挿入します。
スクリューは、1時間あたり30マイクロリットルの速度で細胞注入を開始します。この自動装置を使用すると、一度に最大10匹の動物を一定の流量で注入できます。手動注入は、一定の安定したペースで実行すれば実現可能です。
注入が完了したら、シリンジを慎重に取り外し、以前と同様にガイドネジのスタイレットを交換します。獣医のボンドで傷を閉じ、鎮痛剤を提供し、マウスが回復するのを待ちます。回復には最大 20 分かかる場合があります。
U 87 mg細胞接種から4日後、マウスの体重を量り、対照群と治療群に無作為に分けました。対照群には 100 マイクロリットルの PBS 腹腔内注射を、治療群には MG 1 0 2 ip の 100 マイクロリットルあたり 100 マイクログラムを注射しました。注射は14日間にわたって隔日で繰り返され、合計6回の注射が行われました。
最終注射後、マウスを毎日監視し、1日おきに体重を量りました。動物のエンドポイントは、バランス、障害または麻痺、脱水症、10%以上の豊富な性格の体重減少、または死亡などの重大な神経学的機能障害の発症として定義されました。エンドポイント日数は、Kaplan-Meier生存曲線として記録されました。
死亡または通話はエンドポイント、イベントとしてマークされ、1 つとしてスコアリングされました。実験終了時に生き残った動物は非イベントとして記録され、ゼロコントロールとして採点されました。動物は、細胞の最初の接種から23日後に神経障害と体重減少の兆候を示し始めました。
これは、A MG 1 0 2治療群で有意に遅れました。35日目までに、9匹の対照動物のうち7匹が安楽死させられました。9匹の対照動物のうち78匹が安楽死させられたのに対し、8:00 AMのg 1 0 2治療動物のうち3匹だけが安楽死させられました。
脳の組織学的解析により、対照群の9匹の動物すべてが腫瘍を発症したことが確認されたのに対し、8:00 AMのg 1 0 2で治療したマウスはわずか3匹でした。
概要
この記事では、新しい治療薬を評価するためのグリオーマの頭蓋内キセノグラフトモデルを確立する手順について説明しています。この方法は、細胞注入用の埋め込み可能なガイドスクリューを使用し、従来の定位技術よりも安全で効率的な代替手段を提供します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- 治療学
背景
- グリオーマは効果的な治療戦略を必要とする攻撃的な脳腫瘍です。
- グリオーマ治療の研究のための現在のモデルは、複雑で時間のかかる手順を含むことがよくあります。
- 頭蓋内キセノグラフトモデルは、治療効果に関する洞察を提供できます。
- 迅速で安全な方法論は、グリオーマ研究を進めるために不可欠です。
研究の目的
- 新しいグリオーマ治療法をテストするための信頼できるモデルを確立すること。
- 体内でのグリオーマ細胞の治療反応を評価すること。
- 治療薬の腫瘍の成長と生存に及ぼす影響を比較すること。
使用された方法
- 細胞注入のための頭蓋へのガイドスクリューの埋め込み。
- U 87 mg グリオーマ細胞の頭蓋内注射。
- 生存率を通じた治療反応のモニタリング。
- 腫瘍発達を評価するための組織学的分析。
主な結果
- 対照群は著しい神経学的障害と体重減少を示しました。
- AMG 102による治療は対照群と比較して症状の発症を遅らせました。
- 組織学的分析により、対照群での腫瘍の存在が確認されました。
- 治療群では生存率が大幅に改善されました。
結論
- ガイドスクリュー法はグリオーマモデルを確立するのに効果的です。
- AMG 102はグリオーマの治療薬としての可能性を示しています。
- このモデルはグリオーマ治療のさらなる研究を促進できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The guide screw method enables rapid, reproducible establishment of intracranial xenograft models for evaluating novel glioma therapeutics. By supporting simultaneous infusion in up to 10 animals, it increases throughput while reducing procedural variability and animal handling stress. This approach strengthens preclinical confidence in target validation and therapeutic efficacy assessment for brain cancer drug discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic targets in physiologically relevant intracranial tumor models.
- Operational Value: Supports consistent xenograft establishment across cohorts, reducing biological noise in target validation studies.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking target modulation to survival outcomes in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized intracranial tumor models suitable for compound screening and dose-response evaluation.
- Operational Value: Compatible with perfusion pump automation, enabling standardized, high-reproducibility cell delivery across multiple animals.
- Assay Readiness: Provides a quantifiable engraftment platform for monitoring therapeutic response via survival and histological endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses human U87MG glioma cells to model patient-relevant tumor biology in immunocompromised hosts.
- Preclinical Validation: Enables longitudinal monitoring of therapeutic effects on tumor growth and survival, supporting go/no-go decisions.
- Risk-Adjusted Advancement: Histological confirmation of tumor reduction in treated groups provides mechanistic evidence for therapeutic efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The guide screw method integrates into the discovery workflow from early target validation through preclinical efficacy testing, enabling consistent model generation for downstream therapeutic assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling intracranial delivery of tumor cells to evaluate target-dependent tumor growth.
- Screening: Enables reproducible xenograft formation, a prerequisite for reliable compound screening in brain cancer models.
- Analytics: Generates survival and histological readouts that quantify therapeutic response and support comparative analysis across treatment groups.
- Translational Research: Uses human-derived glioma cells to maintain relevance to clinical pathophysiology, supporting biomarker-aligned efficacy evaluation.
- Enterprise Reuse: The method is adaptable across glioma models and therapeutic modalities, serving as a reusable platform for oncology discovery teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing variability in tumor engraftment.
- Operational Value: Increases procedural standardization and throughput via perfusion pump compatibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parallel animal processing and reducing reliance on specialized stereotactic equipment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through reproducible survival and histological endpoints that inform advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent stereotaxy, aseptic surgery, and postoperative care.
- Dependent on access to precision drills, guide screws, perfusion pumps, and Hamilton syringes.
- Necessitates standardization across teams for screw placement depth, infusion rates, and postoperative monitoring.
- Adaptation considerations include variations in tumor cell line inoculum volume and target brain coordinates across models.
- Practical limitations include the need for aseptic technique to prevent infection and ensure graft viability.
