包装HIV-またはFIVベースLentivector発現コンストラクト＆VSV-Gシュードウイルス粒子の伝達

この手順の全体的な目標は、レンチウイルスの包装について学ぶことです。5日間のプロトコル。初日、2 9 3、TN産生細胞を計算された密度で播種する。

2日目に、目的の遺伝子とウイルスパッケージングプラスミドミックスを含む任意のレンチベクターコンストラクトを細胞にトランスフェクションします。4日目に、ウイルス性塩体を採取し、PEGウイルス沈殿液を添加して濃縮します。手順の最後のステップは、PEG濃縮ウイルスを回収し、ウイルスを分注し、濃縮ウイルスを細胞に感染させてウイルス滴定を行うことです。

最終的に、安定に統合された遺伝子の定量的PCRを使用して、安定した統合されたコンストラクトの数を計算します。この技術が血漿トランスフェクションやレトロウイルス形質導入などの既存の方法よりも優れている点は、FBIの最適化されたレンチウイルスパッケージングプロトコルが高力価の機能活性ウイルスを産生し、幹細胞や非分裂初代細胞などのトランスフェクションが困難な細胞を含む、ほぼすべての哺乳動物細胞に効率的に送達できることです。一般的に、この方法に不慣れな人は、高力価ウイルスの産生を成功させるために不可欠な小さなプロトコルの詳細に精通していないため、苦労します。

トランスフェクション中に顕微鏡で可視化された細胞密度がウイルスパッケージングの効率を決定し、最終的なウイルス力価を決定するため、この方法の視覚的なデモンストレーションは有用です。該当する場合は、蛍光レポーターの発現がトランスフェクションの効率を決定し、最終的なウイルス力価に大きな影響を与えます。さらに、この手法の視覚的なデモンストレーションは、研究者がプロセス全体で無菌性を維持するためのベストプラクティスや、採取したウイルスに細胞の破片を含めないようにする方法など、プロトコルの微妙でありながら重要な部分に精通するのに役立ちます。

効率的なレンチウイルス包装は、3つの要素に依存しています。まず、レンチウイルス発現ベクターには、ウイルスのパッケージングと安定的な組み込みに必要な要素の一部と、目的遺伝子の発現に必要な要素が含まれている必要があります。ショートヘアピン、RNA、マイクロRNA、またはレポーターカセット。

次に、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、発現コンストラクトのRNAコピーを組換え疑似ウイルス粒子にパッケージングし、その後の逆転写および感染時のウイルス統合に不可欠なタンパク質を提供しなければなりません。第三に、2 9 3 TN産生細胞は、発現ベクターおよびパッケージングベクターとともに一過性に交換する必要があります。これらの細胞は、培養培地から回収される高力価の疑似ウイルス粒子を産生します。

最終的に、標的細胞の形質導入が成功するかどうかは、主に、特定の細胞タイプの細胞あたりのウイルス粒子の数に依存します。言い換えれば、感染の多様性は、2 9 3 TN細胞を成長させることから始まります。15センチメートルの細胞培養プレートで18〜24時間使用し、60〜80%coの流暢さを得ます。

トランスフェクション時には、各プレートから約1,400万個の細胞が生成され、ウイルスの収量が増加します。2 9 3 TN細胞が60〜80%コンフルエントになり、トランスフェクションの準備ができている翌日に、複数のプレートを使用できます。細胞の各プレートについて、1.6ミリリットルの無血清DMEMを15ミリリットルのファルコンチューブに加えます。

次に、22.5マイクログラムのppac H oneまたはPpac F1と4.5マイクログラムのlenti vector ConstructをDMEMに加え、ピペッティングで上下させて混合します。次に、55マイクロリットルの純粋な愛情を同じチューブに加え、10秒間ボルテックスした後、15分間室温でインキュベーションします。15分後、各培養プレートに1本のチューブを追加します。

次に、Dropwiseでプレートを穏やかに渦巻かせ、48時間後に細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素と48時間インキュベートします。レンチベクターコンストラクトがGFPのような蛍光遺伝子を発現している場合は、顕微鏡で細胞をチェックし、トランスフェクションが成功すると、50〜90%以上の緑色蛍光細胞が得られ、細胞培養上清を50ミリリットルの円錐管に集めます。上清には、感染性の疑似ウイルス粒子が含まれています。

プレートから引き抜かれた細胞は、ウイルスの産生に悪影響を及ぼしません。破片を遠心分離機に除去するには、ウイルス上清を室温で1500 Gで15分間保存します。次に、ペレットを乱すことなく、ウイルス上清を収集し、約500マイクロリットルの上清の緩衝液を残し、トランスフェクションの72時間後にウイルス粒子を濃縮する次のステップに進みます。

ウイルススーパーナットの任意の2回目の収集は、ウイルス性セートが収集された後に同じ技術を使用して行うことができます。50ミリリットルのポリプロピレン遠心分離チューブ内の上清4容量ごとに1容量の氷冷PEGウイルス沈殿液を添加して濃縮します。溶液を反転させて混合します。

ボルテックスを使用せず、攪拌せずに溶液を摂氏4度で最大96時間保存してください。最低12時間の冷蔵後、混合物を1500Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。遠心分離後、ペゴ沈殿したレンチウイルス粒子は、チューブの底にベージュまたは白いペレットとして現れます。

次に、ペレット内の沈殿したレンチウイルス粒子を乱さずに、慎重に吸引することにより、液体の痕跡をすべて取り除きます。あるいは、スプラナチンの大部分を取り除き、ペレットを残りの ?? 酸に再懸濁します。.次に、懸濁液を滅菌済みの2ミリリットルのeinor tubeに移し、チューブを冷間マイクロフュージで2分間遠心分離します。

14、000 RPMで残りの上清をピペットで取り除き、レンチウイルス粒子ペレットを氷、冷、滅菌緩衝液に再懸濁します。元の容量は、気泡を作らずにペレットを慎重に溶液にピペットで入れ、常に冷たく保ちます。ペレットが完全に再懸濁されていることを確認してください。

最後に、15〜25マイクロリットルのアリコートインクを作り、氷の上に無菌の極低温バイアルを作り、バイアルを摂氏マイナス70度で保管します。パッケージングが成功すると、24ウェル培養プレートプレートでウイルス形質導入のためにミリリットルあたり1,000万〜10億個のIFU、ウェルあたり50,000個の細胞が得られ、指定された培養条件で一晩成長します。細胞は、滴定目的の形質導入のために50〜70%コンフルエントである必要があります。

HT 10 80細胞は、細胞から培地を翌日吸引する制御細胞株として容易に形質導入することができます。次に、培地を濃縮アヒル溶液と組み合わせます。したがって、トランスダックの最終濃度は1 xであり、50〜70%Coの正しい密度でターゲット細胞を使用して各ウェルに形質導入された1/2ミリリットルを添加し、流暢さは、次の希釈、1〜100、1〜10、およびストレートな1対1希釈で各ウェルにウイルスを追加します。

ウイルスは、培地を交換することなく、最大72時間標的細胞と接触したままにすることができます。72時間後、プロウイルスは宿主ゲノムに安定して組み込まれ、目的の遺伝子を発現します。現在の蛍光マーカーの発現を使用して、さまざまなウイルス希釈での形質導入効率を推定できる場合、感染ユニットの数をQPCRで定量できます。

ウイルス力価がわかったら、他の標的細胞に対して望ましい感染の多様性を達成するために、適切なウイルス量を計算します。力価を測定し、MOIを制御することで、実験と異なるウイルス調製間の一貫性が確保されます。これで、ウイルスをさらなる実験に使用する準備が整いました。

2 9 3 TN細胞の開始密度は、トランスフェクション当日のウイルスパッケージングを成功させるために重要でした。これらの2 9 3 TN細胞は、60〜80%のコンフルエントでした。GFPを発現するレンチベクターによるトランスフェクションが成功してから24時間後、2 9 3 TN細胞の少なくとも90%が緑色蛍光を示したことがわかりました。

形質導入後72時間後、GFPはHT 10 80宿主細胞で発現し続けました。これは、10倍希釈で同じ宿主細胞を形質導入する宿主ゲノムに安定して組み込まれたレンチウイルスコンストラクトが、GFPの発現を比例して減少させたことを示しています。なぜなら、ウイルス力価とレンチウイルス媒介性遺伝子発現の関係は正比例するからです。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、5日間で1日あたり約1〜2時間行うことができます。このビデオを見れば、機能的に感染力のあるウイルス粒子を効率的かつ安全に包装し、ウイルスに形質導入した細胞を成功裏に包装する方法を十分に理解できるはずです。レンチウイルスの取り扱いは危険であり、BSLの2組織培養フードでの作業などの予防措置が必要であることを忘れないでください。

この手順を実行するときは、常に白衣と手袋を着用する必要があります。