Name: 包装HIV-またはFIVベースLentivector発現コンストラクト＆VSV-Gシュードウイルス粒子の伝達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学ぶレンチウイルスベクターのパッケージング法。293TN細胞を用いた高効率なウイルス産生とPEG沈降による濃縮、定量PCRを用いた感染単価測定の詳細プロトコルを解説。難感染性細胞への遺伝子導入に最適です。

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我々は、これらのプロトコルの開発とテストでのサポートのためにSBIのスタッフと科学者に感謝します。

1。 293TNパッケージングプラスミドを持つ細胞と発現コンストラクトのトランスフェクション<ol><li>シード7.0から8.0×10 4 mM L-グルタミン、4.5g / Lグルコース、抗生物質なしでウシ胎児血清（10％）を添加したDMEM培地を含む培養培地20mlで15 cm 2の培養プレートあたり6 293TN細胞。細胞密度は、トランスフェクション時の密集度60から80パーセントに達するように2〜5％のCOと37℃で18〜24時間培養する。いくつかのケースでは、標的細胞の形質導入のための十分に高い抗体価を得るために細胞の種のいくつかのプレートに必要となる場合があります。 </li><li>細胞の各プレートについて、オートクレーブ2ミリリットルEppendorffチューブに1.6ミリリットルの無血清DMEMを追加します。上下にピペッティングしてDMEMとミックスに構築する45μlのごlentivectorのpPACKH1またはpPACKF1および4.5μgを追加します。 </li><li>同じチューブにPureFectionの55μlを添加します。 10秒間ボルテックスする。室温fでDMEM-プラスミドPureFection混合物をインキュベートまたは15分。 </li><li>組織培養プレートに均等にプレート全体に分散させる優しく滴と渦にDMEM-プラスミドPureFection混合物を追加します。インキュベーターに皿を返し、5％CO 2で37℃で成長します。 </li><li>トランスフェクション後にメディアを変更する必要はありません。あなたのlentivectorコンストラクトは、GFPのような蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現した場合、12〜24時間トランスフェクション後、顕微鏡下であなたの細胞を確認してください。あなたは、トランスフェクションが成功したことを示す、&gt; 90％GFP陽性細胞を見ることができるはずです。 </li><li> 50ミリリットル滅菌遠心管に細胞培養48時間後上清を72時間収集します。この細胞培養上清は現在、感染pseudoviral粒子を含んでいます。 （BSL-2の安全クラスを操作するための推奨ガイドラインに従ってください。）遠心1500×gで室温で15分間ペレット化し、細胞破片を。ペレットを乱さないように確保し、新しいチューブにウイルス上清を転送します。 </li><li>ウイルスのパッケージングのために使用されている293TN細胞がバイオハザード容器に廃棄されるべきであり、ウイルスのパッケージングのさらなるラウンドのために使用されるようにされていません。 </li></ol> 2。ウイルス上清の濃度<ol><li>レンチウイルス粒子含有上清のすべての4ボリュームに寒い（4°C）PEG-それはウイルスの降水ソリューションの1ボリュームを追加します。大量のレンチウイルス粒子の沈殿は、コーニングを250mlのポリプロピレン製遠心チューブで達成することができます。反転チューブを数回して、ソリューションを混在させることなく、混合物ボルテックスしないでください。 </li><li> （最大4日でも可）少なくとも12時間4℃で溶液を冷蔵してください。冷凍工程の間にチューブを振ったり回転させないでください。 </li><li> 4℃で30分間1500×gで上清/ PEG-IT混合物を遠心分離℃に遠心分離後、レンチウイルス粒子がチューブの底にベージュや白のペレットとして表示されます。 supernataを注ぐNT。 </li><li>ペレット中の沈殿したレンチウイルス粒子を乱さないように注意しながら、吸引することにより、流体の痕跡をすべて削除します。の痕跡が残存PEG-それはウイルスを希釈します（したがって、力価を減少させる）が、PEG-それは不活性で毒性はないので、標的細胞の整合性に影響を与えません。 </li><li>再懸濁し、（4℃）寒い使用して、元のボリュームの1/100でレンチウイルス粒子を組み合わせて、滅菌リン酸緩衝生理食塩水またはDMEM、25 mMのHEPES緩衝液を含む。 </li><li>使用直前まで滅菌低温バイアルおよび-70℃保存に分注し。 </li></ol> 3。標的細胞のウイルスタイターと伝達<ol><li>我々は、標的細胞·オブ·関心を伝達し、実験間の一貫性を保つために、標的細胞に対して感染症の適切な多重度（MOI）を算出する前に、レンチウイルス粒子をタイ​​ターをお勧めします。ウイルスタイターのために、私たちは簡単に感染陽性対照ラインとしてHT1080細胞を使用することをお勧めします。 PLタイターのプロトコルを使用すると、パッケージ化されたレンチウイルス粒子の小アリコートでHT1080細胞を形質関与していることに注意して容易になります。力価が知られると、標的細胞·オブ·関心は生産レンチウイルス粒子でも導入することができます。 ：お勧めタイタープロトコルはで見つけることができます<a href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> 7。 </li><li>細胞培養培地で24ウェルプレートにウェル当たりプレート5万標的細胞·オブ·関心。細胞は通常、インチその指定された培養条件で細胞は一晩増殖培養したメディアを使用しています。細胞は伝達の日にコンフルエント％70から50の間でなければなりません。 </li><li>伝達の日に、細胞から培地を吸引除去する。 1×の最終濃度（例えば、培養液500μlに2.5μlのTransDux）にTransDuxで培地を組み合わせたものです。その後TransDux-CEを転送各ウェルにLL培地の混合物。 </li><li>各ウェルに標的細胞に対するMOI最適に対応するウイルスの適切な量をピペットで。最適なMOIが不明な場合、我々は異なるMOIでの範囲（例えば、MOI 1、2および5の組織培養細胞を簡単に感染、およびMOI多くの困難には1、10および20のように試すことをお勧め）初代細胞を感染させる。レンチウイルス粒子の濃度が（としてのウイルスタイタープロトコルを介して決定される）が知られていない場合は、ウイルスの別のボリュームはそのようなウイルスの1、2、5μlのように、試すことができます。ウイルスは72時間までのターゲット細胞と接触したままにすることができます。 </li><li>ウイルスの構造が宿主細胞のゲノムに組み込まれた後に導入標的細胞·オブ·関心を持ってさらなる実験は、72時間導入した後に開始することができる。特定のニーズに応じて標的細胞·オブ·関心媒体と通路を変更します。 </li></ol> 4。代表的な結果 293TN細胞の出発密度が成功したウイルスのパッケージングのために重要です。 293TN細胞はトランスフェクション（ 図2）の日コンフルエント-80 60％の間でなければなりません。 293TN細胞が60％コンフルエント未満である場合は、それらのトランスフェクションを実行する前に、数時間のために成長することができます。 293TN細胞が&gt; 80％コンフルエントある場合は、トランスフェクションの前に再播種する必要があります。 lentivector表現するGFPを使用する場合は、293TN細胞の少なくとも90％が成功したトランスフェクション（ 図3）を示す、トランスフェクション後緑24時間蛍光を発するべきである。細胞の90％未満ではGFP陽性であるときは、このトランスフェクションが成功しなかったことを示し、ウイルス力価が低くなるため、次のステップに進みません。代わりに、新しいプレート293TN細胞と293TN細胞はトランスフェクション前に、適切な細胞密度であることを確認して、やり直してください。 293TN細胞は48〜72時間トランスフェクション後の組織培養プレートをやってのけることができます。これは負のレンチウイルス粒子の産生に影響を与えません。 HT1080細胞でタイターウイルス力価は、製造元の指示に従って、SBIのグローバル超高速タイターキットを使用して計算することができます。このシステムは、HT1080細胞にレンチウイルスベクターからWPRE配列のウイルスの統合を測定する定量PCRを利用し、正確にmlあたりの感染ユニット（図4）を測定するためのゲノム基準配列に基づいて、標準曲線を比較します。 標的細胞の伝達構成的に活性のGFPマーカーを発現するレンチウイルス粒子を使用している場合は伝達反応が動作している場合は、GFP陽性細胞は、形質導入の12から24時間以内に表示されるように開始する必要があります。レンチウイルスコンストラクトが安定トンに統合された後、GFPの発現は継続すべきである彼は細胞のゲノムをホストします。異なるMOIでで伝達する場合、低MOIでは、以下のGFPの蛍光を示し、高いMOIでは増加したGFPの蛍光を（ 図5）を示す場合には、GFPの蛍光は、約、MOIと一致する必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1ウイルスの生産プロトコルの概要。 lentivectorとPPACKパッケージングプラスミドを混合し、293TN細胞に同時トランスフェクトされています。 48 -72時間後、ウイル​​ス上清を回収し、ウイルス粒子は、PEG-それを沈殿させる。レンチウイルス粒子をタイター後、彼らは標的細胞·オブ·関心を伝達するために使用することができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3171/3171fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 293TN細胞の図2の位相コントラスト画像。セルdensityは60〜80％コンフルエントにトランスフェクションの日の間でなければなりません。 <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3 24時間Purefection、pPACKH1、とlentivector構築するエンコーディングGFPのトランスフェクション後のGFP陽性293TN細胞の蛍光画像。 <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。WPREの定量PCRの結果とMOIおよびパッケージのウイルス粒子の対応する力価を計算するためにSBIのグローバル超高速タイターキットを用いて得られた標準曲線。 <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> HT1080細胞の図5蛍光画像は、レンチウイルスの量が増加して導入した。画像は72時間後の形質からです。

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNA+Viruses.+A+Practical+Approach%22">RNA Viruses. A Practical Approach</a>. Cann, A. J. , Oxford Univ. Press. (2000).</li>
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</ol>

このビデオの記事への生産とフリーアクセスは、システムサイエンスが主催しています。

このウイルスのパッケージングと標的細胞のプロトコルの伝達は、SBIのウイルスのパッケージング試薬の使用に最適化されています。他の試薬の置換は、プロトコルの結果に影響を及ぼす可能性があります。このプロトコルは、レンチウイルス生産用に最適化されており、ウイルスやpseudoviruses他の種類の製造に適しないかもしれません。 成功したウイルスのパッケージングは​​、いくつかの重要なステップに依存しています。 293TN細胞は、細胞培養上清中にレンチウイルス粒子の分泌のために絶対に必要であるSV40ラージT抗原を発現する。 293TN細胞はトランスフェクション時のもので、その密度が十分に細胞にlentivectorとパッケージングプラスミドを転送するPureFection試薬ためには特に重要です。徹底的にプレートを渦巻く続いて滴下方法で組織培養プレートにPureFection混合物を追加すると、パッケージングプラスミドの分散のために重要であるとlentivectorは、細胞のすべてにわたって構築します。適切にベクトルを配布するための障害は、生産されて不十分なレンチウイルス粒子になることがあります。ウイルスのパッケージング反応が組織培養プレートの表面積に基づいて、高力価のウイルスの生産のためにスケールアップすることができます。一つは、パッケージ化する必要がありますコンストラクト当たり293TN細胞のプレート、いくつかの組織培養皿に選択することができます。ウイルス上清の濃度が高力価のウイルスを作成する上で特に便利です。細胞の複数のプレートからウイルス上清は 、in vivo実験で 、または形質導入することは困難である細胞の使用のために組み合わせて、濃縮することができる。 生産レンチウイルス粒子をタイ​​ターは、標的細胞の形質導入に使用する正確なMOIを計算するために重要である。与えられた伝達に使用されたMOIを知ることは情報伝達が成功しない場合にトラブルシューティングが可能になります。たとえば、MOI、つまりを使用してが低すぎるコンストラクト·オブ·関心を非常に少数の標的細胞になることがあります。 MOIが高すぎるそれを使用して、しかし、ストレスの兆候を示す標的細胞になることがあります。目標は、MOI細胞の健康を維持しながら、コンストラクト·オブ·関心の表現を最大限にそれを使用することです。我々はHT1080細胞内でレンチウイルスコンストラクトの統合されたコピーを測定する定量PCRベースのタイタープロトコルをお勧めしますが、他のタイターのアプローチはまた、p24をELISAまたはGFP-陽性細胞の割合の推定として、使用することができます。 標的細胞の正常な伝達には、いくつかの重要な要因に依存しています。 TransDuxは、高い伝達効率を可能にするユニークな感染試薬であるが、それは細胞に毒性はありません。 TransDuxは、多くの場合、標的細胞への毒性があるポリブレンの代わりに使用することができます。標的細胞の形質導入におけるTransDuxの包含は、ウイルス粒子上の電荷を中和するのに役立ち、細胞内にウイルスを許可するだ。 TransDuxは細胞に有毒ではないので、1は、このように確率を増加させる、レンチウイルス粒子は最大72時間の細胞（ウイルスのコンストラクトが宿主細胞のゲノムに組み込まれていた時刻）と接触したままできるようにすることができますウイルス粒子は細胞を入力します。いくつかの困難な形質導入細胞については、形質導入は、導入効率を高めるために連続した日に繰り返すことができます。たとえば、1日目の細胞に形質導入​​、細胞は2日目に休息することができますし、3日目に再び細胞を形質導入する。標的細胞の選択、さらに実験や特性評価を開始する前に、最後の伝達後72時間を待つことが重要である。 効率的なウイルスのパッケージングは​​、5 &#39;および3&#39;LTR領域との間でも、レンチウイルスコンストラクトのサイズに依存しています。レンチウイルスコンストラクトのこのセクションでは、ネイティブのHIVゲノムのサイズに相当する、約9キロバイト以下にする必要があります。 9キロバイト月ドを超えて生産pseudoviral粒子のしわ価。新技術は、このようなpiggyBacトランスポゾンベクターとしては、最大1回のトランスフェクションを介して100キロバイトへの導入遺伝子の信頼性の高い、安定した統合を可能にします。このアプローチは、それが標的細胞をトランスフェクトすることが可能となり、ウイルスのパッケージング工程9,10を必要としない付加的な利点を提供する場合にはレンチウイルスベクターのサイズ制限を超えて構造体に使用することができます。 このプロトコルを使用して製造pseudoviral粒子は、それらはほとんどの哺乳動物の細胞型を感染させることができるという点で感染性である。このプロトコルで使用される製品は、しかし、彼らは非複製と自己不活性化pseudovirusesを生成するという点で、第三世代のbiosafeです。したがって、一度標的細胞または動物に導入、標的細胞または動物が伝染性ではありません。バイオからお勧めできませんが、第三世代のbiosafeではありません他のlentivectorプラスミドの置換が可能です。視点。標的細胞のウイルス産生のプロトコルと、後続の伝達は、NIHのガイドライン11に従って、バイオセーフティレベル2の下で実施されるべきであり、ウイルス粒子を取り扱う際には研究者は常に白衣や手袋を着用しなければならない。使用293TNプロデューサー細胞は、ウイルス粒子のチューブと使い捨てピペットは、適切なバイオハザード容器に廃棄する必要があります。再利用可能なピペットとガラス製品は、漂白剤で除染と人員の暴露を減らすためにオートクレーブする必要があります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM高グルコース培地</td><td>ギブコ</td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> 293TN細胞</td><td> SBI </td><td> LV900A-1 </td><td></td></tr><tr><td> pPACKH1 </td><td> SBI </td><td> LV500A-1 </td><td> HIVベースlentivectorsのために</td></tr><tr><td> pPACKF1 </td><td> SBI </td><td> LV100A-1 </td><td> FIVベースlentivectorsのために</td></tr><tr><td>任意のレンチウイルスベクター</td><td> SBI </td><td>さまざまな</td><td> cDNAを、shRNAを、マイクロRNA、転写レポーター</td></tr><tr><td> PureFection </td><td> SBI </td><td> LV750A-1 LV750A-5 </td><td></td></tr><tr><td> PEG-IT </td><td> SBI </td><td> LV810A-1 LV825A-1 </td><td></td></tr><tr><td>グローバル超高速タイターキット</td><td> SBI </td><td> LV961A-1 </td><td>このプロトコルに説明するが、ウイルス粒子を力価には必要ありません</td></tr><tr><td> TransDux </td><td> SBI </td><td> LV850A-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

包装hiv-またはfivベースlentivector発現コンストラクト＆vsv-gシュードウイルス粒子の伝達

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

標準的なプラスミドベクターと同様に、エフェクターの一過性の発現を得るために低〜中程度の効率で細胞内にプラスミドの形でlentivectorsをトランスフェクトすることが可能です。 pseudoviral粒子にパッケージングレンチウイルス発現構築物は、しかし、さらに困難なトランスフェクションは、プライマリ、幹細胞などの細胞、および分化した細胞で、100％の伝達まで可能になります。また、レンチウイルスの配信は、典型的には、トランスフェクション試薬1、2の毒性に起因する細胞死などの化学的トランスフェクションに関連付けられた特定の細胞応答を生成しません。標的細胞に導入する場合は、レンチウイルスコンストラクトはゲノムDNAに統合され、小さなヘアピンRNA（shRNA）は、cDNA、RNAまたはレポーター遺伝子3、4の安定な発現を提供しています。安定的にエフェクター分子を発現する標的細胞は、発現ベクターなどピューロマイシンまたはGFPとして構築中に含まれる選択可能なマーカーを用いて単離することができます。後のPSウイルスの構造遺伝子が存在しないと、長い末端反復配列（LTRの）が伝達5、6に自己不活性化するように設計されているため、eudoviral粒子は標的細胞に感染し、彼らは標的細胞内で複製することはできません。 効率的なレンチウイルスパッケージング1、5、6、7のために必要な3つの主要コンポーネントがあります。 <ol><li>包装に必要な遺伝的要素の一部が含まれレンチウイルス発現ベクターは、ウイルス発現の安定した統合は、ゲノムDNA中に構築し、エフェクターまたはレポーターの発現。 </li><li>組換えpseudoviral粒子に発現構築物のRNAコピーの転写およびパッケージングのために不可欠なタンパク質を提供するレンチウイルスパッケージングプラスミド。このプロトコルは、ウイルスコートタンパク質のためにHIVやFIVゲノムと水疱性口内炎ウイルスのGタンパク質（VSV-G）からgag、polおよびREVのエンコードPPACKプラスミド（SBI）を使用します。 </li><li> 293TN生成<html>メンテナンスのためにセルを再選択するための有用な高タイターレンチウイルス生産とネオマイシン耐性遺伝子のために必要とされるSV40ラージT抗原を発現r細胞（HEK293細胞に由来する）。 </li></ol>ウイルス産生プロトコルの概要を図1に見ることができます。ウイルス産生は、レンチウイルス発現ベクターおよびパッケージングプラスミドと共トランスフェクト293TNプロデューサー細胞によって開始されます。ウイルス粒子が培地中に分泌されています。 48〜72時間後の細胞培養培地を収穫しています。細胞の破片は、細胞培養培地から削除され、ウイルス粒子は、濃度のPEG-それとを遠心分離によって沈殿させる。生産レンチウイルス粒子は、力価測定され、標的細胞を形質導入するために使用することができます。ウイルスタイターの詳細については、このプロトコルに含まれていませんが、で見つけることができます： ANK &quot;&gt; http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8。 このプロトコルは、示された特定の製品を使用して最適化されています。他の試薬は置換されていてもよいが、同じ結果が保証されません。

レンチウイルス発現ベクターは安定し、哺乳動物細胞と生物全体を分割し、非分裂で異なるエフェクター分子またはレポーターコンストラクトを発現させるための最も効果的な車である。ここでは、pseudoviral粒子にlentivector発現構築物をパッケージ化するとpseudoviral粒子を用いた標的細胞を形質導入するためにどのようにプロトコルを提供しています。

包装HIV-またはFIVベースLentivector発現コンストラクト＆VSV-Gシュードウイルス粒子の伝達

標準的なプラスミドベクターと同様に、プラスミド形態のレンチベクターを低〜中程度の効率で細胞にトランスフェクションし、一過性の...を得ることが可能です。

この手順の全体的な目的は、レンチウイルスパッケージングについて学ぶことです。プロトコルは5日間にわたります。1日目に、293TNプロデューサー細胞を計算された密度で播種します。2日目に、目的遺伝子を含む選択したレンチウイルスベクター構築物とウイルスパッケージングプラスミドミックスを細胞にトランスフェクションします。4日目に、PEGウイルス沈殿溶液を添加してウイルス上清を回収し、濃縮します。手順の最終ステップとして、PEGで濃縮したウイルスを回収し、ウイルスを分注し、濃縮ウイルスを細胞に感染させてウイルス力価を測定します。最終的に、安定的に組み込まれた遺伝子の定量PCRを用いて、安定的に組み込まれたコンストラクトの数を算出します。プラズマトランスフェクションやレトロウイルス導入などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、FBIの最適化されたレンチウイルスパッケージングプロトコルによって、機能的に活性な高タイターウイルスが生成されることです。これにより、幹細胞や非分裂一次細胞のような導入困難な細胞を含む、ほぼすべての哺乳類細胞への効率的な導入が可能になります。一般的に、この方法を初めて行う人は、高タイターウイルスを正常に作製するために不可欠な、細かなプロトコルの詳細に不慣れであるため、苦労することがあります。トランスフェクション中の顕微鏡による細胞密度の視覚的な確認は、ウイルスパッケージングの効率を決定し、それが最終的なウイルスタイターを左右するため、本手法の視覚的な実演は有用です。適用可能な場合には、蛍光レポーターの発現によってトランスフェクション効率を判断することができ、これが最終的なウイルスタイターに大きな影響を与えます。さらに、本手法を視覚的に実演することは、全工程における無菌状態を維持するためのベストプラクティスや、回収したウイルスに細胞残渣が混入するのを防ぐ方法など、プロトコルの細かではあるが重要な点に研究者が慣れるために役立ちます。効率的なレンチウイルスパッケージングには、3つの構成要素が必要です。まず、レンチウイルス発現ベクターに、ウイルスのパッケージングと安定的な組み込みに必要な要素に加え、目的遺伝子の発現に必要な要素（ショートヘアピンRNA、マイクロRNA、またはレポーターカセットなど）が含まれている必要があります。第二に、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、発現コンストラクトのRNAコピーを組換え擬似ウイルス粒子にパッケージングし、感染後に逆転写およびウイルス統合を行うために不可欠なタンパク質を提供しなければなりません。第三に、2 9 3 TNプロデューサー細胞に、発現ベクターとパッケージングベクターを一過性に共導入する必要があります。これらの細胞により、培養液から回収可能な高タイターの擬似ウイルス粒子が産生されます。最終的に、標的細胞への導入成功は、主に特定の細胞タイプにおける細胞あたりのウイルス粒子数に依存します。言い換えれば、感染多重度（MOI）が重要となります。まず、293 TN細胞を15 centimeterの細胞培養プレートで18〜24時間培養し、60〜80%のコンフルエンシーを得ることから始めてください。トランスフェクション時、ウイルス収量を増やすために、各プレートから約14 million cellsが得られます。翌日、2 9 3 TN細胞が60〜80%コンフルエントになった時点でトランスフェクションの準備が整い、複数のプレートを使用することが可能です。細胞プレート1枚につき、1.6 millilitersの無血清DMEMを15 milliliterファルコンチューブに加えます。次に、22.5 µgのppac H 1またはPpac F1と4.5 µgのレンチベクトル構築物をDMEMに加え、ピペッティングで混合します。続いて、同じチューブに55 µLのpure affectionを加え、10秒間ボルテックスし、室温で15分間インキュベートします。15分後、各培養プレートに1本ずつチューブの内容物を加えます。滴下した後、プレートを静かに回転させ、37°C、5% CO₂条件下で細胞を48時間インキュベートします。48時間後、レンチベクトル構築物がGFPなどの蛍光遺伝子を発現している場合は、顕微鏡下で細胞を確認します。トランスフェクションが成功していれば、50%から90%以上の細胞が緑色蛍光を発します。その後、細胞培養上清を50 mLコニカルチューブに回収します。この上清には感染性擬似ウイルス粒子が含まれています。プレートから剥離した細胞があっても、ウイルスの産生に悪影響は及びません。デブリを除去するため、ウイルス上清を室温で1500 G、15分間遠心分離します。次に、ペレットを乱さないように注意しながら、上清を約500 µL残してウイルス上清を回収し、次に行うトランスフェクション72時間後のウイルス粒子の濃縮ステップへと進みます。ウイルスの状態を回収した後、同じ手法を用いてウイルス上清の2回目の回収を任意で行うことができます。50 mLのポリプロピレン製遠心チューブに、上清4量に対して1量の氷冷PEGウイルス沈殿溶液を加えて濃縮します。溶液を転倒混和して混ぜ合わせます。ボルテックスミキサーは決して使用せず、溶液を攪拌せずに4 °Cで最大96時間保存する。最低12時間の冷蔵後、混合物を4 °Cで1500 G、30分間遠心分離する。遠心分離後、PEGで沈殿させたレンチウイルス粒子が、チューブ底にベージュ色または白色のペレットとして現れる。次に、ペレット状に沈殿したレンチウイルス粒子を乱さないよう、注意深く吸引して液体をすべて取り除きます。あるいは、上清の大部分を取り除き、残った上清でペレットを再懸濁させます。その後、懸濁液を滅菌済みの2 mL エッペンドルフチューブに移し、冷却マイクロ遠心機で2 分間遠心分離します。14,000 RPMで遠心し、残りの上清をピペットで除いた後、レンチウイルス粒子のペレットを、元の液量の1/10から1/100の量の氷冷滅菌バッファーで再懸濁します。気泡が入らないように注意しながら、ペレットを慎重に溶液中へピペッティングし、常に低温を維持してください。ペレットが完全に再懸濁されていることを確認してください。最後に、15から25 µLずつ分注して、滅菌済みの凍結保存用バイアルに入れ、氷上で操作した後、-70 °Cで保存します。パッケージングが成功すれば、24ウェル培養プレートでのウイルス導入用に、1 mLあたり1,000万から10億IFUが得られます。1ウェルあたり50,000個の細胞を播種し、指定の培養条件下で一晩培養します。タイター測定のための導入において、細胞のコンフルエンスは50から70%である必要があります。HT 1080細胞は、導入が容易なコントロール細胞株として使用できます。翌日、細胞から培地を吸引します。次に、培養液と濃縮したトランスデューサー溶液を混合します。トランスデューサーの最終濃度が1xとなるように調整し、標的細胞の密度が適切な50〜70%コンフルエントである各ウェルに、導入液を0.5 mLずつ加えます。各ウェルに、1/100、1/10、および1/1の原液希釈の各濃度でウイルスを添加してください。培地を交換せずに、ウイルスを標的細胞に最大72時間接触させることができます。72時間後には、プロウイルスがホストゲノムに安定的に組み込まれ、目的遺伝子が発現します。蛍光マーカーの発現がある場合は、異なるウイルス希釈度での形質導入効率を推定するために利用でき、感染単位数はQPCRによって定量可能です。ウイルス力価が判明したら、他の標的細胞に対して目的の感染多重度（MOI）を達成するために必要なウイルスの体積を算出します。力価を測定しMOIを制御することで、実験間および異なるウイルス調製液間での一貫性を確保できます。これで、ウイルスをさらなる実験に使用する準備が整いました。トランスフェクション当日のウイルスパッケージングを成功させるには、2 9 3 TN細胞の播種密度が極めて重要でした。これらの2 9 3 TN細胞のコンフルエンスは60から80%の間としていました。GFPを発現するレンチベクトルを用いてトランスフェクションを行い、24時間後に確認したところ、2 9 3 TN細胞の少なくとも90%が緑色蛍光を示していました。形質導入から72時間後、HT 10 80ホスト細胞においてGFPの発現が継続して認められた。これは、レンチウイルス構築物がホストゲノムに安定的に組み込まれたことを示している。同じホスト細胞を10倍希釈して形質導入したところ、GFPの発現量は比例して低下した。これは、ウイルス力価とレンチウイルス介在性遺伝子発現の関係が正比例であるためである。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、1日あたり約1〜2時間の作業で5日間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、機能的に感染性のあるウイルス粒子を効率的かつ安全にパッケージングし、ウイルスを用いて細胞を正常に形質導入する方法について十分に理解できるはずです。レンチウイルスの取り扱いは危険を伴う可能性があるため、BSL 2の組織培養フード内で作業するなど、十分な予防策を講じることを忘れないでください。本手順を実施する際は、常に白衣と手袋を着用してください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

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マウスにおける腹腔組織常在マクロ ファージの 効率的な遺伝子およびマイクロRNA調節のためのレンチウイルスベクター調製

学ぶレンチウイルスベクターのパッケージング法。293TN細胞を用いた高効率なウイルス産生とPEG沈降による濃縮、定量PCRを用いた感染単価測定の詳細プロトコルを解説。難感染性細胞への遺伝子導入に最適です。

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