包装HIV-またはFIVベースLentivector発現コンストラクト＆VSV-Gシュードウイルス粒子の伝達

この手順の全体的な目的は、レンチウイルスパッケージングについて学ぶことです。プロトコルは5日間にわたります。1日目に、293TNプロデューサー細胞を計算された密度で播種します。

2日目に、目的遺伝子を含む選択したレンチウイルスベクター構築物とウイルスパッケージングプラスミドミックスを細胞にトランスフェクションします。4日目に、PEGウイルス沈殿溶液を添加してウイルス上清を回収し、濃縮します。手順の最終ステップとして、PEGで濃縮したウイルスを回収し、ウイルスを分注し、濃縮ウイルスを細胞に感染させてウイルス力価を測定します。

最終的に、安定的に組み込まれた遺伝子の定量PCRを用いて、安定的に組み込まれたコンストラクトの数を算出します。プラズマトランスフェクションやレトロウイルス導入などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、FBIの最適化されたレンチウイルスパッケージングプロトコルによって、機能的に活性な高タイターウイルスが生成されることです。これにより、幹細胞や非分裂一次細胞のような導入困難な細胞を含む、ほぼすべての哺乳類細胞への効率的な導入が可能になります。一般的に、この方法を初めて行う人は、高タイターウイルスを正常に作製するために不可欠な、細かなプロトコルの詳細に不慣れであるため、苦労することがあります。

トランスフェクション中の顕微鏡による細胞密度の視覚的な確認は、ウイルスパッケージングの効率を決定し、それが最終的なウイルスタイターを左右するため、本手法の視覚的な実演は有用です。適用可能な場合には、蛍光レポーターの発現によってトランスフェクション効率を判断することができ、これが最終的なウイルスタイターに大きな影響を与えます。さらに、本手法を視覚的に実演することは、全工程における無菌状態を維持するためのベストプラクティスや、回収したウイルスに細胞残渣が混入するのを防ぐ方法など、プロトコルの細かではあるが重要な点に研究者が慣れるために役立ちます。

効率的なレンチウイルスパッケージングには、3つの構成要素が必要です。まず、レンチウイルス発現ベクターに、ウイルスのパッケージングと安定的な組み込みに必要な要素に加え、目的遺伝子の発現に必要な要素（ショートヘアピンRNA、マイクロRNA、またはレポーターカセットなど）が含まれている必要があります。

第二に、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、発現コンストラクトのRNAコピーを組換え擬似ウイルス粒子にパッケージングし、感染後に逆転写およびウイルス統合を行うために不可欠なタンパク質を提供しなければなりません。第三に、2 9 3 TNプロデューサー細胞に、発現ベクターとパッケージングベクターを一過性に共導入する必要があります。これらの細胞により、培養液から回収可能な高タイターの擬似ウイルス粒子が産生されます。

最終的に、標的細胞への導入成功は、主に特定の細胞タイプにおける細胞あたりのウイルス粒子数に依存します。言い換えれば、感染多重度（MOI）が重要となります。まず、293 TN細胞を15 centimeterの細胞培養プレートで18〜24時間培養し、60〜80%のコンフルエンシーを得ることから始めてください。

トランスフェクション時、ウイルス収量を増やすために、各プレートから約14 million cellsが得られます。翌日、2 9 3 TN細胞が60〜80%コンフルエントになった時点でトランスフェクションの準備が整い、複数のプレートを使用することが可能です。細胞プレート1枚につき、1.6 millilitersの無血清DMEMを15 milliliterファルコンチューブに加えます。

次に、22.5 µgのppac H 1またはPpac F1と4.5 µgのレンチベクトル構築物をDMEMに加え、ピペッティングで混合します。続いて、同じチューブに55 µLのpure affectionを加え、10秒間ボルテックスし、室温で15分間インキュベートします。15分後、各培養プレートに1本ずつチューブの内容物を加えます。

滴下した後、プレートを静かに回転させ、37°C、5% CO₂条件下で細胞を48時間インキュベートします。48時間後、レンチベクトル構築物がGFPなどの蛍光遺伝子を発現している場合は、顕微鏡下で細胞を確認します。トランスフェクションが成功していれば、50%から90%以上の細胞が緑色蛍光を発します。その後、細胞培養上清を50 mLコニカルチューブに回収します。この上清には感染性擬似ウイルス粒子が含まれています。

プレートから剥離した細胞があっても、ウイルスの産生に悪影響は及びません。デブリを除去するため、ウイルス上清を室温で1500 G、15分間遠心分離します。次に、ペレットを乱さないように注意しながら、上清を約500 µL残してウイルス上清を回収し、次に行うトランスフェクション72時間後のウイルス粒子の濃縮ステップへと進みます。

ウイルスの状態を回収した後、同じ手法を用いてウイルス上清の2回目の回収を任意で行うことができます。50 mLのポリプロピレン製遠心チューブに、上清4量に対して1量の氷冷PEGウイルス沈殿溶液を加えて濃縮します。溶液を転倒混和して混ぜ合わせます。

ボルテックスミキサーは決して使用せず、溶液を攪拌せずに4 °Cで最大96時間保存する。最低12時間の冷蔵後、混合物を4 °Cで1500 G、30分間遠心分離する。遠心分離後、PEGで沈殿させたレンチウイルス粒子が、チューブ底にベージュ色または白色のペレットとして現れる。

次に、ペレット状に沈殿したレンチウイルス粒子を乱さないよう、注意深く吸引して液体をすべて取り除きます。あるいは、上清の大部分を取り除き、残った上清でペレットを再懸濁させます。その後、懸濁液を滅菌済みの2 mL エッペンドルフチューブに移し、冷却マイクロ遠心機で2 分間遠心分離します。

14,000 RPMで遠心し、残りの上清をピペットで除いた後、レンチウイルス粒子のペレットを、元の液量の1/10から1/100の量の氷冷滅菌バッファーで再懸濁します。気泡が入らないように注意しながら、ペレットを慎重に溶液中へピペッティングし、常に低温を維持してください。ペレットが完全に再懸濁されていることを確認してください。

最後に、15から25 µLずつ分注して、滅菌済みの凍結保存用バイアルに入れ、氷上で操作した後、-70 °Cで保存します。パッケージングが成功すれば、24ウェル培養プレートでのウイルス導入用に、1 mLあたり1,000万から10億IFUが得られます。1ウェルあたり50,000個の細胞を播種し、指定の培養条件下で一晩培養します。タイター測定のための導入において、細胞のコンフルエンスは50から70%である必要があります。

HT 1080細胞は、導入が容易なコントロール細胞株として使用できます。翌日、細胞から培地を吸引します。次に、培養液と濃縮したトランスデューサー溶液を混合します。トランスデューサーの最終濃度が1xとなるように調整し、標的細胞の密度が適切な50〜70%コンフルエントである各ウェルに、導入液を0.5 mLずつ加えます。各ウェルに、1/100、1/10、および1/1の原液希釈の各濃度でウイルスを添加してください。

培地を交換せずに、ウイルスを標的細胞に最大72時間接触させることができます。72時間後には、プロウイルスがホストゲノムに安定的に組み込まれ、目的遺伝子が発現します。蛍光マーカーの発現がある場合は、異なるウイルス希釈度での形質導入効率を推定するために利用でき、感染単位数はQPCRによって定量可能です。

ウイルス力価が判明したら、他の標的細胞に対して目的の感染多重度（MOI）を達成するために必要なウイルスの体積を算出します。力価を測定しMOIを制御することで、実験間および異なるウイルス調製液間での一貫性を確保できます。これで、ウイルスをさらなる実験に使用する準備が整いました。

トランスフェクション当日のウイルスパッケージングを成功させるには、2 9 3 TN細胞の播種密度が極めて重要でした。これらの2 9 3 TN細胞のコンフルエンスは60から80%の間としていました。GFPを発現するレンチベクトルを用いてトランスフェクションを行い、24時間後に確認したところ、2 9 3 TN細胞の少なくとも90%が緑色蛍光を示していました。

形質導入から72時間後、HT 10 80ホスト細胞においてGFPの発現が継続して認められた。これは、レンチウイルス構築物がホストゲノムに安定的に組み込まれたことを示している。同じホスト細胞を10倍希釈して形質導入したところ、GFPの発現量は比例して低下した。これは、ウイルス力価とレンチウイルス介在性遺伝子発現の関係が正比例であるためである。

この手法を習得すれば、適切に実施した場合、1日あたり約1〜2時間の作業で5日間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、機能的に感染性のあるウイルス粒子を効率的かつ安全にパッケージングし、ウイルスを用いて細胞を正常に形質導入する方法について十分に理解できるはずです。レンチウイルスの取り扱いは危険を伴う可能性があるため、BSL 2の組織培養フード内で作業するなど、十分な予防策を講じることを忘れないでください。

本手順を実施する際は、常に白衣と手袋を着用してください。