チップ上Lensless蛍光顕微鏡
2011年8月17日
lenslessオンチップの蛍光顕微鏡のプラットフォームは、復号アルゴリズムに基づいて圧縮サンプリングを使用して<4μmの分解能を持つなどの超広角視野上の画像蛍光灯のオブジェクトを、> 0.6〜8平方センチメートルことが実証されている。このようなコンパクトで広視野蛍光のオンチップイメージングモダリティは、高スループットサイトメトリー、希少細胞研究とマイクロアレイ解析のための貴重な可能性があります。
この手順の全体的な目標は、超広視野で蛍光物体をイメージングするためのレンズレスオンチップ蛍光顕微鏡プラットフォームを実証することです。これを実現するために、薄い吸収フィルターと光ファイバーフェースプレートをオプトエレクトリックセンサーアレイ(CCDCモス)の上にそっと置き、次にマイクロ流体チップをフェースプレートの上に配置します。次に、インデックスマッチングオイルを使用してマイクロチップでプリズムを組み立てます。
蛍光引用は菱形プリズムの側面を通じて達成され、ホログラフィック照明は同じプリズムの上部側面を通じて行われます。最終的には、デジタルアルゴリズムを介して生の画像をデコードすることにより、取得した蛍光画像から高解像度の顕微鏡画像を取得できます。必要に応じて、デコードされた蛍光物体は、カスタム開発されたインターフェースを使用して自動的にカウントできます。
オンチップレンズ。一般に、イメージングは、かさばるレンズベースの光学顕微鏡をよりシンプルでコンパクトな設計に置き換えることを目的としています。この新興技術プラットフォームは、新しい理論とデジタル再構築アルゴリズムの助けを借りて、かさばる高価な魅力的なコンポーネントの必要性を排除する可能性を秘
めています。オンチップイメージングプラットフォームのレンズリストは、デジタルセンサーアレイ、インコヒーレント照明源、プリズム、吸収フィルター、光ファイバーフェースプレート、光ファイバーテーパーなど、いくつかの光学部品で構成されています。このプラットフォームでは、ターゲット微小物体からの蛍光シグナルを検出するために、さまざまなタイプのセンサーアレイを使用することができます。このビデオの目的のために、電荷結合デバイスを使用し、単純な発光ダイオードなどのインコヒーレント光源を蛍光励起に使用します。
この図に示すように、2つの異なる励起フィルタリング方法を並行して使用して、必要な暗視野背景を作成します。まず、ガラスプリズムまたはガラス半球を使用して、目的のサンプルをホストするマイクロ流体チップの底面に全反射またはTIRを作成します。これと並行して、TIRプロセスに従わない毎週散乱する励起光を除去するために、安価な吸収フィルターが使用されます。
これら2つのメカニズムを使用して励起が成功裏に拒否されると、サンプルの蛍光発光のみが検出器平面で取得されます。このような大きな検出開口数にもかかわらず、センサーアレイの生の蛍光スポットはかなり広くなり、この蛍光信号の空間的広がりを設計し、より適切に制御します。光ファイバーフェースプレートは、通常のフェースプレートの代わりに、オブジェクトとセンサー平面の間に配置されます。
テーパー状の光ファイバーフェースプレートは、下部の面に比べて上部の光ファイバーケーブルの密度が大幅に大きく、拡大して高解像度のイメージングに使用できます。このプラットフォームで使用されるマイクロ流体チップは、スライドガラス上に配置されたポリジメチルスローン壁を使用して製造され、ランドレスオンチップイメージングプラットフォームの組み立てを開始するためのオンチップイメージングに必要なマイクロチャネルを作成します。まず、真空ペンを使用してオプトエレクトロニクスセンサーアレイのカバーガラスを取り外し、検出器のアクティブエリアの上部に薄い吸収フィルターをそっと置きます。
この吸収フィルターの上に光ファイバーフェースプレートを配置します。次に、作製したマイクロ流体チップを光ファイバーアレイの真上に置きます。次に、マイクロ流体チップの上にガラスプリズムを組み立て、界面の屈折率がガラスの屈折率と一致するように、屈折率マッチングオイルを使用します。
FCコネクタを使用して光源を光ファイバーケーブルに接続します。この手順で最も難しい側面の 1 つは、コンポーネントの位置合わせです。コンポーネント間の距離、照明の位置と角度を慎重に合わせます。
最後に、側面照明ファイバーをプリズムに近づけ、その角度を調整して、マイクロ流体チップに対応するガラス空気界面で全反射が発生するようにします。底面の基板、さまざまな細胞、または小動物モデルは、このオンチッププラットフォームを使用してイメージングできますが、このデモンストレーションの目的で白血球をイメージングします。蛍光染料で白血球を標識するには、まず約100マイクロリットルの全血を約1ミリリットルの赤血球上昇緩衝液と混合し、室温で約3分間インキュベートした後、嘘の血液溶液を遠心分離します。
マイクロピペットを使用して最上層を除去した後、ペレット層をリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁して細胞の核酸を蛍光色素で標識し、SYTO 16を蘇生懸濁液に加えた後、サンプルを室温で暗所で約30分間インキュベートします。30分後、標識したサンプルを遠心分離します。未結合の染料からの蛍光放出によるバックグラウンドノイズを減らすために、supinateを取り外してください。
リースは、PBSの約5ミリリットルで白血球ペレット層を曲げました。これで、サンプルをマイクロ流体チップにロードする準備ができ、レンズフリーのオンチップ蛍光イメージングが可能になります。白血球をイメージングする前に、蛍光マイクロビーズを使用してイメージングプラットフォームをキャリブレーションする必要があります。
脱イオン水と原ビード溶液を使用して希釈したマイクロビーズサンプルを調製します。鋭利な針シリンジを使用します。この初期サンプルをPDMS壁の側面からマイクロ流体チップに注入します。
オンチップ蛍光イメージングを実現するためのコンポーネントを組み立てた後、カスタム開発されたラボビューインターフェースを使用して、コンピューターを介して蛍光ビーズの生画像を取得します。視野全体に少なくとも20個の分離された蛍光ビーズ画像があることを確認してください。キャリブレーションデータを保存し、後でレンズレス蛍光顕微鏡プラットフォームの点像分布関数のキャリブレーションと抽出に使用されます。
蛍光ビーズサンプルが入ったマイクロ流体チップを取り外し、このチップからプリズムを取り外してください。以前に調製した白血球サンプルを、PDMS壁の側面から別の未使用のマイクロ流体チップに注入します。A:特に距離と励起電力に関して、同じ実験条件でコンポーネントをもう一度組み立てます。
蛍光マイクロビーズに使用したのと同じソフトウェアパラメータを使用して、カスタムメイドのラボビューを使用して白血球の生画像を取得します。キャリブレーションデータと生の白血球画像は、デジタル処理によってMATLABで高解像度の画像を作成するために使用されます。ここでは、4ミクロンと10ミクロンの緑色蛍光粒子を含む混合物の広視野レンズ蛍光オンチップイメージングの代表的な結果を、比較目的で示しています(10 x 顕微鏡)。
対物画像も提供されており、これは示されているレンズの少ない蛍光画像とよく一致します。次に、広視野レンズの結果、緑色10ミクロンと赤色10ミクロンの蛍光粒子を混合した蛍光の少ないイメージングを行った。レンズレス蛍光画像は、同じサンプルの10倍の顕微鏡対物画像に適切に一致します。
この図は、さまざまな 10 ミクロン ビーズ ペアのイメージングのためのデコード アルゴリズムに基づく Lucy Richardson デコンボリューションと圧縮サンプリングの性能比較を示しています。上の行は、レンズの少ない生の蛍光画像を示しており、挿入画像は、10 倍の対物レンズを使用して必要な同じ粒子の顕微鏡比較を示しています。中央の行は圧縮復号結果を示し、下の行はルーシー・リチャードソンのデコンボリューション結果を示しています DDCSとDLRは、それぞれ中心間距離と顕微鏡画像、CSデコードされたレンズ画像、LRデコンボリューションレンズレス画像を参照します。
次に、レンズのデジタル処理により、蛍光の少ない生画像が図示される。圧縮サンプリングベースのアルゴリズムは、密集した直径2ミクロンのビーズペアを解像することにより、4ミクロン未満の空間分解能を達成するために使用されます。挿入図は、40 x 顕微鏡の対物レンズの比較を示しており、これは解読された蛍光画像と非常によく一致しています。
ここで、Dは顕微鏡画像の中心から中心までの距離を指します。DCSは、CSデコードされたレンズの中心から中心までの距離を指しますが、蛍光画像は少なくなります。この図は、蛍光標識された白血球のレンズレスイメージングの結果を示しています。
レンズフリーの生画像は、CSベースのデコーダーを使用して迅速にデコードされ、10倍の対物レンズで取得された同じサンプルの従来の顕微鏡画像と非常によく一致します。必要に応じてイメージングに加えて、デコードされた蛍光物体は、オンチップサイトメトリーアプリケーション用にカスタム開発されたインターフェースを使用して自動的にカウントすることもできます。私たちは、標識細胞とマイクロビートのランドレス蛍光顕微鏡法を8cm四方の視野で実証したばかりです。
このような比較された船舶イメージングプラットフォームと、背後に急速圧縮デコーダーがあります。ハイスループットサイトメトリー、マイクロレア解析、およびリアルセル研究のアプリケーションには、かなりばらつきがあります。
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概要
この記事では、超広視野で蛍光物体をイメージングできるレンズレスオンチップ蛍光顕微鏡プラットフォームを実証しています。システムは圧縮サンプリングベースのデコードアルゴリズムを使用して4μm未満の解像度を達成し、高スループットのアプリケーションに適しています。
主要な研究要素
科学の分野
- 蛍光顕微鏡
- イメージング技術
- マイクロ流体工学
背景
- 従来の顕微鏡はしばしば大型のレンズを必要とします。
- レンズレスシステムはイメージングのためのコンパクトなソリューションを提供できます。
- 高スループットの細胞計測と希少細胞研究は広視野イメージングから恩恵を受けます。
- デジタルアルゴリズムは生データからイメージの解像度を向上させます。
研究の目的
- コンパクトなレンズレスイメージングシステムを開発すること。
- 広範囲で高解像度のイメージングを達成すること。
- 蛍光物体の自動カウントを容易にすること。
使用した方法
- センサーアレイ上に薄い吸収フィルターと光ファイバーフェースプレートを配置すること。
- サンプル処理のためのマイクロ流体チップの位置決め。
- 蛍光励起とホログラフィックイルミネーションのための菱形プリズムの使用。
- イメージデコードと分析のためのデジタルアルゴリズムの適用。
主な結果
- 0.6-8 cm²以上の面積にわたる蛍光物体のイメージングに成功。
- 4μm未満の解像度を達成。
- 高スループットアプリケーションの可能性を実証。
- カスタムインターフェーを介して蛍光物体の自動カウントを可能に。
結論
- レンズレスオンチップ顕微鏡プラットフォームは広視野イメージングに効果的です。
- 従来の顕微鏡法に代わるコンパクトな代替手段を提供します。
- この技術は細胞計測とマイクロアレイ分析を大幅に前進させる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Lensless on-chip fluorescent microscopy addresses the need for compact, high-throughput imaging in early discovery workflows by eliminating bulky optical components. The platform enables rapid screening of fluorescently labeled samples over ultra-wide fields of view, supporting scalable cytometric and microarray applications. Its integration with digital decoding algorithms enhances predictive confidence in target validation and phenotypic screening by delivering quantitative, reproducible imaging data.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-resolution imaging of fluorescently labeled cellular targets over large areas.
- Operational Value: Supports functional target validation by providing label-specific signal detection without optical complexity.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by generating reliable imaging data for mechanistic de-risking of cellular pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by enabling uniform excitation and collection of fluorescent signals across microfluidic channels.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through fixed optical geometry and digital point spread function calibration.
- Scalability: Facilitates high-throughput screening readiness via imaging of vertically stacked micro-channels, increasing sample throughput per run.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant imaging of primary cells such as white blood cells, enabling biomarker-aligned readouts.
- Preclinical Alignment: Bridges discovery to preclinical validation by providing quantitative imaging outputs compatible with histopathological benchmarks.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement decisions through automated counting and spatial distribution analysis of fluorescent objects.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly for assays requiring wide-field, label-specific detection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving subcellular fluorescent signals in primary cell populations.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible fluorescent signal capture and digital reconstruction across large fields of view.
- Analytics: Provides quantitative measurements such as object count, intensity, and spatial distribution via compressive sampling-based decoding.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows through imaging of clinically relevant cell types like white blood cells, enabling biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform across multiple projects due to its modular design and algorithm-driven adaptability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through high-resolution, label-specific imaging over wide fields of view.
- Operational Value: Standardization and scalability via fixed optical components and automated image decoding.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing biological ambiguity in phenotypic screening data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through high-content, reproducible imaging outputs for lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent labeling, microfluidic handling, and digital image processing.
- Dependent on optoelectronic sensor arrays, fiber optic face plates, and prism-based excitation systems.
- Necessitates cross-team standardization of calibration protocols using fluorescent microbeads for point spread function derivation.
- Adaptation considerations include microfluidic channel design and excitation power tuning across different cell types or bead sizes.
- Practical limitations include dependency on fluorescent signal strength and potential background from unbound dyes, mitigated by washing steps.
