GFP -アクチンを発現するライブ内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の研究

この手順の目的は、生きた血管内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の動的な変化を観察することです。まず、ヒト臍帯静脈内皮細胞にA GFP beta actinプラスミドを導入し、カバーガラス上でコンフルエントになるまで培養します。次に、加熱ステージとアルブミン生理食塩水注入装置を備えた生細胞イメージングチャンバーにカバーガラスを配置します。

最終ステップは、薬理剤による処理前後のタイムラプス画像キャプチャを通じて、選択した細胞領域のデータを取得することです。Image Jなどの画像解析ソフトウェアを用いたChimeグラフ解析により、突起の距離、時間、速度などの局所的なラメラポディア（葉状仮足）突起に関する知見や、時間の経過に伴うアクチンフィラメントの運動を得ることができます。免疫蛍光画像法などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、生細胞イメージングによって、内皮透過性を決定するメカニズムの研究にアクチンおよび細胞骨格の動的な性質を組み込めることです。

固定染色された細胞は特定の時点のスナップショットであり、炎症介在物質による処理前後のアクチンおよび細胞骨格のダイナミクスに関する情報は少ない。生物学的安全キャビネット内で、カバーガラスを70% ethanolで2分間滅菌し、その後風乾させる。各カバーガラスを10 cmの培養プレートに配置し、カバーガラスの端に触れないように、中心に300 µLの温めたゼラチン溶液を加える。5分後、液体を吸引して除去する。

次に、0.25% trypsin EDTAを用いて、コンフルエントに達したヒト臍帯静脈内皮細胞（VE）を回収します。細胞数をカウントし、遠心分離によりペレット化します。VE核エフェクターキットを用いたトランスフェクション反応に備え、上清培地を可能な限り吸引除去してください。

細胞ペレットをbasic nuclear effector solutionで再懸濁し、0.2〜2 µgのGFP beta actinベクタープラスミドを加えます。細胞懸濁液100 µLをnuclear effector qveに分注します。蓋をしたqveを数回軽く叩き、Qvetの底面とトランスフェクション試料の間に気泡がないことを確認します。

Q VETをnuclear effector twoデバイスにセットし、プログラムA 0 3 4を実行します。nuclear effectorキットの転送ピペットを用いて、温めた500 µLのEGM two MV培地をqveに加えます。その後、混合液をマイクロ遠心チューブに戻し、15分間インキュベートします。トランスフェクションしたVE懸濁液を静かに1回混ぜ、縁に触れないようにして、ゼラチンコーティングされたカバーガラス上に懸濁液を300 µL滴下します。

その後、1〜4時間インキュベートします。トランスフェクションした細胞を観察し、カバースリップへの接着を確認します。次に、10 millilitersのE GM two MV培地をプレートに加え、GFPが発現するまでインキュベートを続けます。

まず、アルブミン生理食塩水溶液（PSS）を重力フローシステムに加え、インラインヒーターに接続します。次に、流量調節器を調整し、流量を約 40 milliliters per hour に設定します。その後、綿棒を用いてストップコックを閉じ、フローを停止させます。

ダイヤモンドバスの底面外縁に真空グリースを塗布します。次に、インキュベーターからトランスフェクション済みの培養物を取り出します。ピンセットを使用して、カバーガラスをそっと持ち上げます。

次に、キムワイプを使用して、ボトムスライド上の余分なEGM two MV培地を吸い取り、細胞の面を上に向けます。カバースリップの上にダイヤモンドバスを配置してチャンバーを形成します。速やかに、そのチャンバーをステージヒーター内に設置してください。

チャンバーのクランプを締め、プレートから約1 mLのEGM two MV培地をチャンバーにピペッティングします。次に、真空ホースをチャンバー左側のホルダーに、インラインヒーターからのA PSSラインをチャンバー右側のチャンネルに接続します。その後、真空をオンにし、A PSSラインを開いて、トランスフェクトされた細胞にバス灌流を行います。

また、インラインヒーターを37 °Cでオンにします。次に、加熱ステージ用のサーミスタプローブをバスの端に配置し、ステージヒーターを37 °Cでオンにします。残っているEGM two MV培地や汚れを取り除くため、70% ethanolを浸したキムワイプでカバーガラスの裏面を慎重に拭き、続いて乾いたキムワイプで拭きます。その後、トランスフェクションしたHU細胞を30分間平衡化させます。

コースを固定します。研究対象となる培養細胞の選択領域に焦点を合わせます。細胞内のGFP Act inの信号強度に応じて、カメラの露光時間を0.5秒から2秒の間に設定してください。

また、実験の間隔と持続時間を設定します。次に、室内の照明を消し、設定を確認するために画像を1枚撮影します。必要に応じて画像を確認しながら、タイムラプスシリーズを撮影してください。

標準的なプロトコルでは、試験剤を添加する前に20～30分間のベースライン画像を撮影し、続いて0.5～4時間の追加画像取得を行います。最後に、付随するテキストに詳述されている通り、CHグラフ解析によってlamely podiaの突出距離、持続時間、および速度を評価します。標準的な実験において、GFP actinは、トランスフェクションされたVEの50%以上にランダムに発現します。

1分ごとに取得したこれらの画像では、細胞質全体に分布するGFP actinに加え、フィラメント構造や細胞縁に沿って突出する局所的なe meli podiaが捉えられています。細胞突出の距離持続性と速度は、タイムラプス画像セットから定量化します。chm graph解析を用いて、まず細胞縁に対してほぼ垂直に単一ピクセルの線を引きます。

この領域は、タイムラプスセットの各画像から抽出され、時間の経過に伴う領域のモンタージュ、またはここに示すカイムグラフ（chime graph）を生成するために使用されます。カイムグラフでは、左から右への視点において、突出部は細胞端の上方への動きとして表されます。これらの突出部のいずれかの端に線が重ね合わされると、その線に関連付けられたピクセルデータを収集して、突出部のダイナミクスを定量化できます。カイムグラフにおける突出部の総数を用いて、突出頻度を推定することが可能です。

この解析では、細胞周辺部で形成され、細胞中心に向かって移動し、最終的に分解されるストレスファイバーの動きを示しています。kymograph（カイモグラフ）上では、ストレスファイバーは細胞質領域に連続した線として現れ、多くの場合、細胞中心に向かって右下方向に移動します。元のkymographでファイバーの視認性が低い場合は、アンシャープマスクフィルターで画像を鮮鋭化させ、ストレスファイバー上に線を引くことで、計測機能を用いたピクセルデータの収集を容易にします。あるいは、特定したストレスファイバーの開始点から終了点まで線を引くことで、ファイバーが観察された期間の平均ピクセルデータを算出します。

本プレゼンテーションでは、Image Jなどのソフトウェアを用いたグラフ解析により、タイムラプス画像セットからデータを解析する方法を実演しました。このビデオを視聴することで、形質導入した血管内皮細胞のライブセルイメージングを用い、炎症性メディエーターに応答したアクチン細胞骨格のダイナミクスを研究する方法について、十分な理解が得られるはずです。