Name: GFP -アクチンを発現するライブ内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶGFP-アクチンを用いたライブ内皮細胞のアクチン細胞骨格動態観察法。ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いたタイムラプスイメージングにより、薬剤刺激応答における細胞骨格の動的変化をリアルタイムで評価し、血管透過性メカニズムの解明に貢献します。

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GFP -β-アクチンプラスミドは、寛大に博士ウェインオアー、病理学のLSUHSC - S部門によって提供された、と博士はベッキーWorthylake、薬理学のLSUHSC - NO学科の研究室で増幅した。この作品は、国立衛生研究所（P20 RR - 018766）とアメリカ心臓協会（05835386N）からの補助金によって支えられている。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

生内皮細胞におけるGFP -アクチンのイメージングは​​、炎症性刺激に反応してアクチン細胞骨格のダイナミクスの詳細な分析が可能になります。また、このメソッドは、せん断応力11のように物理的な力に反応して細胞骨格のリモデリングを示すこれまでの知見に基づいて構築すると便利な場合があります。さらに、この方法は、マイグレーション、有糸分裂、細胞間接合部と接合部の成熟の形成、及びバリア機能の維持など、さまざまな内皮細胞の活動へのアクチン細胞骨格の動態の寄与の詳細な評価が可能になります。 示されたデータでは、内皮のアクチン細胞骨格の挙動は、トロンビンによる治療前後で観察することができます。すべての内皮細胞の縁に沿って地元の葉状仮足を形成し、非融合と合流両方の細胞の単層で時間をかけて回帰が観察された。トロンビンによる治療は一時的に葉状仮足の形を中断ationと離職。トロンビンはまた、トロンビンは内皮細胞12-14にアクチンストレスファイバーの形成と増加求心張力発生を引き起こすことが以前の報告と一致して、細胞がわずかに縮小していました。しかし、このような生細胞イメージング研究から、ストレスファイバーの起源は、今決定することができます。 HUVECにおいては、ストレスファイバーのほとんどは、細胞の周囲に発信し、細胞の8,9の移行に横アーク繊維に似ている。固定された細胞を使用する場合に比べてこの方法のもう一つの強みは、ストレスファイバーの数は、実験群の間で選択バイアスを排除し、トロンビンの治療の前と後の個々の細胞で定量化できることです。 このプロトコルでは、セルのエッジとアクチンストレスファイバーの動的な動きを評価する。内皮細胞でのアクチンの単量体のダイナミクスを理解するために、このような蛍光退色後回復（FRAP）や蛍光などのより高度な技術がマイクロスペックルコピー（FSM）は、16、15を適用することができます。微小血管内皮細胞は微小血管のバリア機能のより良いモデルを表すことができるので、さらに、効果的に微小血管内皮細胞にGFP -アクチンを発現するようにトランスフェクションプロトコールの最適化は論理的な将来の方向を表します。 要約すると、GFP -アクチンを発現している生内皮細胞のイメージングは​​、内皮細胞のアクチン細胞骨格は、刺激の様々なタイプに応答する方法を決定する強力なツールを表します。しっかりと密内皮単層を用いた研究は、このようなアクチンに富んだ葉状仮足および内皮バリア機能の横アークストレスファイバーなどの動的構造の役割を決定するのに役立ちます。さらに、GFP -アクチンまたは他の細胞内構造の可視化を可能にする他の融合タンパク質を発現する内皮細胞の生細胞イメージングでは、シグナリングと構造的なメカニズムを理解するために必要な詳細な時空間情報を提供することをDetermineバリアの完全性。

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1。リンガー5倍証券 </td></tr><tr><td> 化学 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 量は </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td> EMD </td><td> SX0420 - 3 </td><td> 35グラム</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> JTベーカー</td><td> 3040 </td><td> 1.75グラム</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td> C - 3881 </td><td> 1.47グラム</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>シグマ</td><td> M - 9397 </td><td> 1.44グラム</td></tr><tr><td>滅菌ろ過された水</td><td> N / </td><td> N / </td><td> 1 Lへ移動</td></tr><tr><td colspan="4"> 4℃オートクレーブボトルや店舗に滅菌フィルターは、° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2。 MOPSバッファー </td></tr><tr><td> 化学 </td><td>会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 量は </td></tr><tr><td> MOPS </td><td>シグマ</td><td> M3183 </td><td> 125.6グラム</td></tr><tr><td>滅菌ろ過された水</td><td> N / </td><td> N / </td><td> 1 Lへ移動</td></tr><tr><td colspan="4"> 4℃オートクレーブボトルや店舗に滅菌フィルターは、° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3。アルブミン生理食塩水（APSS） </td></tr><tr><td> 化学 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 量は </td></tr><tr><td>リンガー株式（5倍） </td><td> N / </td><td> N / </td><td> 200 mLの</td></tr><tr><td> MOPS緩衝液</td><td> N / </td><td> N / </td><td> 5 mLの</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S - 9638 </td><td> 0.168グラム</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム&lt;/ TD&gt; <td>シグマ</td><td> P5280 </td><td> 0.22グラム</td></tr><tr><td> EDTAのナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td> ED2SS </td><td> 0.0074グラム</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td> G7528 </td><td> 0.901グラム</td></tr><tr><td>アルブミン、ウシ</td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10グラム</td></tr><tr><td>滅菌ろ過された水</td><td> N / </td><td> N / </td><td> 1 Lへ移動</td></tr><tr><td colspan="4"> 37 7.4にpHを調整° C、4℃オートクレーブボトルや店舗にして滅菌フィルター℃に</td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4。 0.9％生理食塩水 </td></tr><tr><td> 化学 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 量は </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td> EMD </td><td> SX0420 - 3 </td><td> 9グラム</td></tr><tr><td>滅菌ろ過された水</td><td> N / </td><td> N / </td><td> 1 Lへ移動</td></tr><tr><td colspan="4"> 4℃オートクレーブボトルや店舗に滅菌フィルターは、° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5。 1.5パーセントゼラチン溶液 </td></tr><tr><td>ブタの皮からゼラチン</td><td>シグマ</td><td> G2500 </td><td> 15グラム</td></tr><tr><td> 0.9％生理食塩水</td><td> N / </td><td> N / </td><td> 1 Lへ移動</td></tr><tr><td colspan="4"> ° C十分にゼラチン溶解するために37にソリューションを温める。一方、4℃オートクレーブ滅菌ボトルとストアにまだ温かい、滅菌フィルター° C </td></tr></tbody></table>

gfp -アクチンを発現するライブ内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の研究

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

微小血管内皮細胞は、流体と溶質の選択的透過性障壁として重要な役割を果たしている。内皮細胞間の接着剤接合は、内皮の透過性を調節し、そして多くの研究では、接合部の整合性1-5を決定するために、アクチン細胞骨格の重要な貢献を示している。皮質アクチンのベルトは、安定した接合部1、2、4、5の維持に重要であると考えられている。対照的に、アクチンストレスファイバーは接合2-5を弱める内皮細胞内の求心緊張を生成すると考えられている。ずっとこの理論のは内皮細胞が血管内皮透過性を高めるために知られている炎症性メディエーターで処理し、細胞を固定し、顕微鏡観察のためにF -アクチンのラベル付けされた研究に基づいている。に固定された細胞の画像のみスナップショットを提供するため、しかし、これらの研究は、アクチン細胞骨格の役割を非常に限られた理解を提供するアクチンの構造5のダイナミクスに関する情報がないと時間。 生きた細胞のイメージングは​​、内皮障壁の完全性を決定するメカニズムの研究にアクチン細胞骨格の動的な性質に取り込むことができます。この方法の大きな利点は、内皮細胞でのアクチンの構造上の様々な炎症性刺激の影響は、固定標本を観察するときに発生する可能性のある潜在的なバイアスを除去する、治療前と後の生細胞の同じセットで評価することができるということです。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）をプラスミドGFP -β-アクチンをトランスフェクションし、ガラスのカバースリップ上でコンフルエンスまで増殖されています。コンフルエントHUVECにおけるGFP -アクチンの時間経過の画像は、内皮障壁の完全性の時間依存性の変化を誘導する炎症性メディエーターを添加する前と後にキャプチャされます。これらの研究は、内皮に貢献するアクチン細胞骨格の変化の流体シーケンスの視覚的な観察が可能lのバリアの破壊と修復。 我々の結果は一貫して内皮細胞の局所、アクチン豊富な葉状仮足の形成と売上高を示しています。アクチンストレスファイバーの形成と動きも観察することができます。炎症性刺激による治療の前と後のローカル葉状仮足の形成やターンオーバーの頻度の分析は、カイモグラフ解析によって文書化することができます。これらの研究は、内皮障壁の完全性の維持のための重要な以前に正体不明の分子機構を発見するために使用することができる内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の動的な性質に関する重要な情報を提供しています。

GFP -アクチンを発現している生内皮細胞の顕微鏡イメージングは​​、細胞骨格構造の動的変化の特性評価が可能になります。固定標本​​を使用する技法とは異なり、この方法は前と同じ細胞内のアクチン細胞骨格の時間的変化の詳細な評価、中、および様々な物理的、薬理学的、または炎症性刺激の後にしています。

GFP -アクチンを発現するライブ内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の研究

微小血管内皮は、液体や溶質の選択的透過性バリアとして重要な役割を担っている。内皮細胞間の接着接合は...

この手順の目的は、生存している血管内皮細胞のアクチン細胞骨格における動的な変化を観察することです。まず、ヒト臍帯静脈内皮細胞にA GFP beta actinプラスミドをトランスフェクションし、カバーガラス上でコンフルエントになるまで培養します。次に、加熱ステージとアルブミン生理食塩水を注入した生細胞イメージングチャンバーにカバーガラスを設置します。最終ステップは、薬理学的製剤による処理前後において、選択した細胞領域をタイムラプス画像キャプチャによりデータ収集することです。Image Jなどのイメージングソフトウェアを用いたカイムグラフ解析により、突起の距離、時間、速度などの局所的なラメラポディア突出や、時間の経過に伴うアクチンフィラメントの運動に関する知見を得ることができます。免疫蛍光イメージングなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、生細胞イメージングによって、血管内皮透過性を決定するメカニズムの研究に、アクチンおよび細胞骨格の動的な性質を取り入れられる点にあります。固定染色細胞は時間の断片的なスナップショットに過ぎず、炎症メディエーターによる処理前後の細胞活動および細胞骨格の動態に関する得られる情報は少ない。バイオセーフティキャビネット内にて、カバーガラスを70% ethanolで2分間滅菌し、その後風乾させる。各カバーガラスを10 cmの培養プレートに配置し、カバーガラスの端に触れないように、中心に300 µLの温めたゼラチン溶液を加える。5分後、液体を吸引除去する。次に、0.25%トリプシンEDTAを用いて、コンフルエントなヒト臍帯静脈内皮細胞（VE）の培養物を回収します。細胞数を数え、遠心分離により回収してください。VE核エフェクターキットを用いたトランスフェクション反応のため、上清培地を可能な限り吸引して取り除きます。細胞ペレットをBasic Nuclear Effector溶液で再懸濁し、0.2から2 µgのGFP beta actinベクトルプラスミドを添加します。細胞懸濁液100 µLをNuclear Effector Q-vesselに移します。蓋をしたQ-vesselを数回軽く叩き、Q-vesselの底面とトランスフェクションサンプルの間に気泡がないことを確認します。Q VETを核エフェクター2デバイスにセットし、プログラムA 0 3 4を実行します。核エフェクターキットのトランスファーピペットを用いて、加温した500 µLのEGM 2 MV培地をqveに添加します。その後、混合液をマイクロ遠心チューブに戻し、15分間インキュベートします。トランスフェクションしたVE懸濁液を静かに1回混ぜ、エッジに触れないように300 µLの懸濁液をゼラチンコートしたカバースリップ上に滴下します。その後、1～4時間インキュベートします。トランスフェクションした細胞を観察し、カバースリップへの接着を確認してください。次に、10 mLのE GM two MV培地をプレートに加え、GFPの発現が認められるまでさらにインキュベートを続けます。まず、アルブミン生理食塩水溶液（PSS）を重力流システムに加え、インラインヒーターに接続します。次に、流量調節器を調整し、流量を約40 milliliters per hourに設定します。その後、綿棒を用いてストップコックを閉じ、流れを停止させます。ダイヤモンドバスの底面にある外縁部に真空グリースを塗布します。次に、インキュベーターからトランスフェクション済みの培養物を取り出します。ピンセットを使用して、カバーガラスをゆっくりと持ち上げます。次に、キムワイプを使用して、細胞面を上に向けた状態で、底面のスライド上の余分なEGM two MV培地を吸い取ります。カバーガラスの上にダイヤモンドバスを配置してチャンバーを形成します。速やかにチャンバーをステージヒーターに設置してください。チャンバー上のクランプを締め、プレートから約1 mLのEGM two MV培地をチャンバーにピペットで分注します。次に、真空ホースをチャンバー左側のホルダーに、インラインヒーターからのA PSSラインをチャンバー右側のチャンネルに接続します。その後、真空をオンにし、A PSSラインを開いて、トランスフェクションした細胞にバス灌流を行います。また、インラインヒーターを37 °Cに設定してスイッチを入れます。次に、加熱ステージ用のサーミスタプローブをバスの端に配置し、ステージヒーターを37 °Cに設定してスイッチを入れます。残っているEGM-2 MV培地や塩の蓄積を除去するため、70% ethanolを浸したKimwipeでカバースリップの裏面を丁寧に拭き、続いて乾いたKimwipeで拭き取ります。その後、トランスフェクションしたHU細胞を30分間平衡化させます。コースをロックします。解析対象となる培養細胞の選択領域に焦点を合わせます。細胞内のGFP Actinの信号強度に応じて、カメラの露光時間を0.5秒から2秒の間に設定します。また、実験の間隔時間と持続時間を設定してください。次に、室内の照明を消し、設定を確認するために画像を1枚撮影します。必要に応じて画像を確認しながら、タイムラプス連続撮影を行ってください。標準的なプロトコールでは、テスト剤を添加する前に20～30分間のベースライン画像を撮影し、その後0.5～4時間の追加画像取得を行います。最後に、付随する本文で詳述するように、CHグラフ解析を用いてラメリポディアの突出距離、持続時間、および速度を評価します。標準的な実験において、GFPアクチンは、トランスフェクションされたVEの50%以上にランダムに発現します。1分ごとに取得したこれらの画像では、細胞質全体に加え、フィラメント状の構造や、細胞縁に沿って突出する局所的な偽足におけるGFPアクチンが捉えられています。細胞突出の移動距離、持続性、および速度は、タイムラプス画像セットから定量化されます。kym graph解析を用いて、まず、細胞の縁に対してほぼ垂直に1ピクセル幅の線を引きます。この領域は、タイムラプスセットの各画像から抽出され、時間経過に伴う領域のモンタージュ、またはここに示すようなkymograph（カイモグラフ）を生成するために使用されます。kymographにおいて、左から右への視点で見ると、突出部は細胞縁の上方への動きとして表されます。これらの突出部のいずれかの縁に線が重ね合わされたとき、その線に関連付けられたピクセルデータを収集することで、突出部のダイナミクスを定量化できます。kymographにおける突出部の総数は、突出頻度の推定に使用できます。この解析では、細胞周辺部に形成され、細胞中心に向かって移動し、最終的に分解されるストレスファイバーの動きを描写しています。kymograph（カイモグラフ）上では、ストレスファイバーは細胞質領域における連続した線として現れ、多くの場合、細胞中心に向かって右下方向へ移動します。元のkymographでファイバーの視認性が低い場合は、アンシャープマスクフィルタを用いて画像を鮮明にします。ストレスファイバー上に線を引くことで、計測機能を用いたピクセルデータの収集が容易になります。あるいは、特定されたストレスファイバーの開始点から終了点まで線を引くことで、ファイバーが観察された期間の平均ピクセルデータを算出します。このプレゼンテーションでは、Image Jなどのソフトウェアを用いたグラフ解析により、タイムラプス画像セットからデータを分析する方法を実演しました。このビデオを視聴することで、トランスフェクションした内皮細胞のライブセルイメージングを用い、炎症性メディエーターに応答したアクチン細胞骨格のダイナミクスを研究する方法について、十分に理解できるはずです。

study-actin-cytoskeleton-live-endothelial-cells-expressing-gfp

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する

学ぶGFP-アクチンを用いたライブ内皮細胞のアクチン細胞骨格動態観察法。ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いたタイムラプスイメージングにより、薬剤刺激応答における細胞骨格の動的変化をリアルタイムで評価し、血管透過性メカニズムの解明に貢献します。

GFP -アクチンを発現するライブ内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の研究

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