人間の毛包から神経堤幹細胞の単離および培養

この手順の全体的な目標は、ヒトの頭皮組織から初代神経堤幹細胞(N CSC)を単離して培養することです。これは、最初に人間の頭皮の皮膚を1センチメートル幅のストリップに咥え、ディスベイを含む培地でインキュベートすることによって達成されます。次に、皮膚を新鮮な培地に整え、毛包を塞ぎます。

手順の2番目のステップは、トリプシンで毛包を治療し、単一細胞懸濁液が得られることです。手順の最終ステップは、フローサイトメトリーを使用してCD 2 71 HNKの1つのダブルポジティブncscを選別し、培養プレートにプレートすることです。最終的には、位相差顕微鏡法は、神経球の形成と成長を研究するために使用されますが、顕微鏡下で皮膚と健康粒子を解剖するのが非常に難しいため、健康の垂直ステップを抽出して分離することを学ぶのが難しいため、この方法のデモンストレーションが重要です。

幹細胞の培養に備えるために、6ウェルプレートの各ウェルの底にポリデリシンを塗布し、プレートをフード内で乾燥させます。井戸が乾いたら、滅菌水ですすぎ、吸引してから、井戸を再び乾かします。プレートに0.17ミリグラム/ミリグラムのフィブロネクチン溶液をコーティングします。

その後、フィブロネクチンがNCSC培地のプレートで乾燥する前に、次の培地と試薬を準備して準備します。 97%D-M-E-M-F 12 2%B 27 supplement 1%and two supplement B-F-G-F-E-G-F IGF one and diss. フェイスリフト手順または胎児の頭皮組織から新鮮な成人のヒト頭皮皮膚を収集し、ペニシリンストレプトマイシンを含むPBSで洗浄します。

皮膚を50ミリリットルのチューブに移し、DMEMで1ミリグラム/ミリリットルのDISスペースで摂氏37度で2〜4時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、滅菌したペトリ皿に皮膚を移し、皮膚表面近くの毛幹をつかみ、しっかりとスムーズに引っ張ることで、皮膚から毛を取り除きます。毛包は、抗原オルゲンの形態を示すか、分離された卵胞断片をEDTAで0.05%tripsで室温で15〜20分間インキュベートし、時折振とうします。

次に、10%FBSを含む4ミリリットルのDMEMを加えて反応を停止します。次に、卵胞上皮を40ミクロンのフィルターに通して、さまざまなサイズと形状の細胞を含む単一細胞懸濁液を取得します。その後、サスペンションをGの200倍で5分間回転させます。

慎重にS上清を廃棄し、2%FBSとPBSの1ミリリットルにペレットを再懸濁します 事実を使用してN CSCを分離するには、まず、PC標識CDに対する抗体で細胞を標識します CD2 71 FE C標識hnk oneまたはCD 2 71 PE標識アルファ4インテグリン 暗黒遠心分離機で200倍Gで室温で5分間インキュベートし、上清を吸引します。2%FBSとミリリットルあたり2マイクログラムを含むPBSに細胞を再懸濁します。ヨウ化プロピジウムは死細胞をゲートアウトします。

フローサイトメトリーによる細胞選別を行い、CD 2、71 H、およびK one double positiveまたはCD 2 71 alpha four integrinダブルポジティブ細胞の培養液を回収します。NCSC培地の超低接着プレート内の細胞は、1日1回培地を交換します。顕微鏡で毎日細胞培養を確認してください。

NCSCは、ドナーの年齢に応じて、数日後に浮遊する小さな凝集体を形成し始め、培養物中で2〜5週間で整形成された球体を形成し始めます。成長は、膨らみ領域で数日で現れ、毛包全体がNCSC培地で培養されると、数週間でその場で整形成された球体が現れます。NCSC培養を拡大するには、細胞をPBSで1回洗浄し、温めた状態でEDTAを摂氏37度まで2回トリップします。

次に、雹の卵胞幹細胞が剥離するために、それを細胞に7〜15分間加えます。トリッシンを停止するには、10%FBSでDMEMを10%添加し、静かにピペッティングして細胞を分散させます。その後、Gの200倍で5分間スピンダウンします。

NCSC培地および培養およびフィブロネクチン被覆プレートに細胞を37°Cで再懸濁します。NCSCの文化。ヒトNCSCを未分化状態に維持するには、培地で十分です。

フィーダー細胞を必要としないため、ケラチノサイトは増殖せず、培地中で徐々に死滅します。いくつかの小さな丸い細胞は増殖し、懸濁液中で小さな凝集体を形成します。3〜5日後、これらの浮遊凝集体はゆっくりとサイズが大きくなり、毛髪球と呼ばれる3次元球状の構造を生成します。

コードプレートを培養すると、N CSCは表面に付着し、懸濁液中の球状形成細胞(球状形成幹細胞と付着性幹細胞の両方)よりも速く成長します。NCSCマーカーは、毛包全体が培養球体である場合に、膨らみ領域に対応する領域に形成されます。ビデオを見た後、隔離と培養の方法についてよく理解しているはずです。

ヘルマ頭皮組織からの初代神経幹細胞。