Name: マウスの主栄養膜細胞と絨毛浸潤アッセイの分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぶマウス胎盤栄養膜細胞の分離法とマトリゲル浸潤アッセイ。酵素処理とPercoll密度勾配遠心により高純度細胞を取得し、細胞浸潤能を評価する手法を解説。

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著者らは、このビデオを制作し、ミズーリ大学学術支援センターでクリエイティブサービスチームに感謝したいと思います。この作品は、国立衛生研究所の母子保健と人間開発のユニスケネディシュライバー国立研究所、助成番号HD055231によってサポートされていました

1。マウス胎盤の解剖<ol><li> マウスの交配のペアを設定します。 </li><li>次の日のそれぞれで、膣栓の有無をチェックする。プラグインが検出された日は0.5日後に性交（DPC）7とみなされます。 </li><li>胎盤は、d 10.5成熟胎盤の発達と胎盤可能初めのクリーン郭清を、妊娠の所望の段階で収集することができる。ここでは、14.5 DPCを実証している。指定されたボリュームで、10.5 DPCに40から60胎盤、および14.5 DPCに10から20胎盤がはっきり見える栄養膜細胞層が得られます。 </li><li>妊娠マウスを安楽死させると、子宮を取り出し、子宮頸部で、かつ子宮間膜に沿って切断する。 </li><li>各受胎産物（ 図1A）との間で切断鋭いはさみを使用して。 </li><li>鉗子の2ペアを使用して、カットエッジで子宮壁をつかみ、引き離し、（ 図1B）子宮筋層を除去 。ワンペア鋸歯、（湾曲またはストレート）適度に細かい鉗子プラス1対の非常に細かい鉗子（＃5、例えば）を推奨します。 </li><li>胎盤向かい、胎盤を露出して、鉗子またはハサミで脱落を開きます。 1鉗子ペアで子宮組織を把持すると、分離するために胎盤（ 図1C）の下に別の鉗子をスライドさせます。胎盤から、必要に応じて独立した胎児と胎膜場合。また、胎盤組織を失うことなく、切開によってすべて脱落膜組織を削除することはできませんが、追加の脱落膜組織は、（青白い）そっとピンセットで剥離することにより、胎盤の表面から除去することができる。我々は、さらに精製するためのパーコール勾配に依存するようになります。 </li><li>すべての解剖が完了するまで、50 mlコニカルチューブに25 mlの氷冷解離バッファ内の各解剖胎盤を置きます。後の段階で、粗く解離バッファに転送する前にハサミやカミソリの刃で胎盤組織をミンチ。 </li></ol>栄養膜細胞のTLE "&gt; 2。アイソ<ol><li> 45〜60分間37℃の水浴中で緩くキャップコニカルチューブおよび場所。約10分毎にピペッティングすることにより積極的に解離液を混ぜる。合計消化時間は密接に監視されるべきであると可能性が高いいくつかの試行錯誤が最適な細胞の回復を達成するために必要になります。組織は、10mlのピペットを通過することができるべきであるが、組織の目に見える部分が残ったままになります。過剰消化が悪く、細胞の生存やめっき効率になります。少数の細胞の塊が存在するときに最適な細胞の生存および平板効率はむしろ完全な解離が達成されたときよりも、発生します。逆に、underdigestionはパーコール分離後純度減少につながる。適切な消化のポイントに達した場合には、コラゲナーゼ活性を停止するためにチューブを氷上に置きます。 </li><li>消化されていない物質を除去するために細胞ストレーナーを通してソリューションを渡すと、5分間@ 500×gで遠心する。 </li><li>洗浄するには、削除10mlの洗浄溶液の上清と細胞を懸濁。 5分間@ 500×gで遠心します。 </li><li>遠心分離の間に、9.6ミリリットルパーコール、13.4ミリリットルの洗浄液と高速遠心分離に適した50mlチューブで1.1ミリリットル10倍培地199を混合することにより、パーコール溶液を調製します。 </li><li> 2 mLの洗浄液に上澄みを再懸濁し、細胞ペレットを取り外します。 </li><li> 4℃で30分間溶液と遠心@3万XGをパーコールにセルを追加℃に</li><li>勾配を乱すことなく、遠心分離器からチューブを取り外します。明るい光源の前に勾配、場所の管を可視化する。トロホブラストバンド（ 図2）を見つけて、下の赤血球バンドを動かさないように注意しながら、ピペットで吸引します。栄養バンドの音量は5-8 mlとなります。 </li><li> 50mlコニカルチューブに栄養膜細胞を転送します。 45ミリリットルの全体積に対するソリューションを洗う追加。 </li><li> 5分間@ 500×gで遠心します。上清を除去し、培養メディに再懸濁し、（NCTC-135）ええと。細胞を37℃、5％CO 2で薄層マトリゲルまたは組織培養プラスチック上で培養することができます。 10.5日で、各胎盤は80〜90％が肯定しているケラチンの約50,000生きた細胞を、もたらします。 </li></ol> 3。栄養膜浸潤アッセイ<ol><li> 37℃、5％30から90分間、CO 2で各マトリゲル室とインキュベートに1-2 mlの培地（NCTC-135）を追加します。 </li><li>培地を除去し、上部チャンバーに2ミリリットル中に1.5ミリリットル×10 5新たに単離した細胞を追加します。低いメンブレン表面を覆うのに、下部チャンバーに1 mlの培地を追加します。 </li><li> 18〜24時間用のインサートで培養細胞。 </li><li>スポンジ綿棒を使ってインサートからの細胞とマトリゲルをこすり取る。 </li><li> 2mlのPBSでチャンバの上部と下部をすすぐ。 </li><li> PBS中で1ミリリットルを4％パラホルムアルデヒドで5分間固定してください。 </li><li> 400μlのDAPI（300nm以下）と下部チャンバーを充填することによって染色し、30分間インキュベートします。 </li><li> PBS中で簡潔に3回洗浄する。 </li><li><li>スライドさせて取り付け培地（PBS中50％グリセロール）10μlのドロップを追加します。ピンセットを使って、ドロップ上の膜に横たわっていた。媒体の別の10μlのドロップを追加してから、慎重にカバースリップ。 </li><li>写真とカウント細胞。使用されている顕微鏡の適切東洋メンブレン（ダウンセルサイドアップまたはセル·サイド）に確認してください。画像Jソフトウェア（国立衛生研究所）、Adobe Photoshopまたは手動のカウンターができるように、この目的のために使用することができる手動計数機能を備えています。 </li></ol> 4。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1マウスの胎盤の解剖。 （a）は、子宮はmesometrial表面に沿って、子宮頸部（下）で、卵管（黄色）に沿って切断することにより除去される。個々の受胎は、次に示すように、ハサミで切断することによって分離することができる。 （b）の子宮壁はカット子宮の表面に2鉗子を置き、胎児近く離れて胎盤から、抗mesometrial側面に沿って引き裂くことによって除去される。 （c）の胎盤は、その後、鉗子で把持し、胎盤と子宮の組織​​との間に別のものをスライドさせて分離されています。臍帯および他の胚体外膜は、その後胎盤から分離することができる。 <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：栄養膜細胞のパーコール分離。左の漫画に示すように、遠心分離した後、三大バンドが見えるようになりますと、右の写真。上部のバンドは、細胞破片および繊維芽細胞が含まれており、最も明らかになるであろう。赤血球を含む下部付近タイト（赤）バンドはちょうどびまん性栄養膜バンドの下に表示されます。ちょうど写真の矢印の左側に示すように2のように、細胞凝集塊は、おそらく、栄養膜帯で見られるでしょう。 ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3侵襲栄養膜細胞（白矢印）は、膜の底面に現れる、マトリゲル層と膜孔を通過することになる。毛穴（黒矢印）も表示されます。全体の膜表面または代表試料領域のセルの数をカウントすることができる。蛍光DAPIで核染色のグレースケール画像は、細胞の可視化を向上させるために反転されました。 <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4：栄養膜細胞が同定され、単離された集団の純度はサイトケラチン7（センター、マゼンタ）の免疫染色により、評価することができる。細胞はDAPI（上、青）で対比されています。マージされた画像、下部。

<ol><li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li>
<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
<li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+characterization%2C+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li>
<li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta%3A+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li>
<li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li>
<li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もない。

このビデオでは、マウスの胎盤から栄養膜細胞の単離を示しています。次に、栄養膜侵入のためのin vitroアッセイを示しています。この手順を用いて、主にではなく、完全に、栄養膜細胞の純粋な集団を得ることができる。さらに純度が要求されている場合は、一次ヒト栄養膜細胞のために記載されているように、磁性ビーズ分離またはフローサイトメトリーは、実行することができる。コラゲナーゼ解離工程の適切な長さは、それぞれの実験で決定されなければならない、と経験で学習されます。アンダー消化が減少純度ならびに削減数値につながる可能性があり、一方過剰消化が厳しく、細胞の回復を減らすことができます。我々は商業的に調製マトリゲル浸潤チャンバーの使用を示しているが、彼らはまた、所望の厚さでコーティングされていないトランスウェルチャンバーにマトリゲルを添加することにより調製することができる。

マウスの主栄養膜細胞と絨毛浸潤アッセイの分離

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

胎盤は、胎児への栄養、ガスや成長因子の輸送だけでなく、廃棄物の除去を担当しています。したがって、胎盤発育における欠陥は胎児と母親のための重要な結果を持っており、胚性致死の主な原因です。胎盤の胎児部分の主要な細胞型は栄養です。初代マウス胎盤栄養膜細胞は、正常および異常な胎盤の発達を研究するための有用なツールであり、細胞株とは異なり、単離され、妊娠の特定の段階で栄養を研究するために使用することができる。また、トランスジェニックマウスからの栄養膜細胞の初代培養を胎盤細胞中の特定の遺伝子の役割を研究するために用いることができる。ここで紹介するプロトコルはThordarson らの説明に基づいています。パーコール勾配が単離したマウスの胎盤から比較的純粋な栄養膜細胞集団を得るために使用されている1。それは、より広く使用するために類似しています人間の栄養膜細胞単離2-3 dの方法。純度は、サイトケラチン7 4の単離された細胞の免疫細胞化学的染色によって評価することができる。ここでは、単離された細胞は、その後、 体外 5-6 に栄養膜侵襲性を評価するために、マトリゲル浸潤アッセイを用いて分析する。浸潤細胞をカウントするための免疫細胞化学及び染色によって分析される。

このプロトコルでは、パーコール勾配を用いた栄養膜細胞の分離に続いて妊娠d10.5、上のマウスから胎盤の解剖について説明します。次に、マトリゲル浸潤アッセイで単離された細胞の使用例を示します。

胎盤は、栄養素、ガス、成長因子の胎児への輸送、および老廃物の排除を担っています。
したがって、欠損は...

この手順の全体的な目的は、細胞培養のためにマウスから原代胎盤栄養膜細胞を単離することです。また、これらの細胞の活用例として、マトリゲル浸潤アッセイについても実演します。妊娠マウスから子宮を摘出し、胎盤を解剖します。胎盤組織を酵素的に消化して個々の細胞または小細胞塊を得た後、プロトコルに従った密度勾配により細胞を分離します。栄養膜細胞を含むバンドを吸引し、得られた細胞集団を洗浄して播種します。次に、浸潤アッセイについて説明します。細胞は、薄いメンブレンを覆うMatrigel層の上に播種されます。浸潤細胞はMatrigel層を消化し、メンブレンの8µmの孔を通過します。その後、細胞を固定してメンブレンを取り除きます。こうして浸潤した細胞を染色し、計数することができます。こんにちは。ミズーリ大学（ミズーリ州コロンビア）産婦人科および女性健康学部のSchultz研究室のKathleen Penningtonです。本日は、妊娠マウスから初代栄養膜細胞を単離するために私たちが用いている手順をご紹介します。その後、これらの細胞をテストするために使用する浸潤アッセイについて実演します。本手順を用いて、胎盤トロホブラスト細胞の発達および細胞外マトリックスへの浸潤能に影響を与える要因を研究します。それでは始めていきましょう。まず、以下の各日にマウスの交配ペアをセットアップします。交尾栓の有無を確認します。栓が検出された日を0.5日目と定義します。妊娠の任意の段階で胎盤を採取することができます。ここでは、妊娠14.5日の胎盤をベンチトップで解剖する方法を実演します。ただし、より早い段階では、組織を視認するために顕微鏡が必要になる場合があります。子宮の位置を確認し、子宮管接合部で切断してください。子宮頸部およびもう一方の輸卵管接合部を切断し、脂肪と血管を取り除き続けます。子宮を摘出するには、鋭い鋏を用いて子宮を清潔なペトリ皿に移します。各概念体（conceptus）を分離し、分離後、それぞれの概念体を別の清潔な皿に移します。胎児は胎盤から見て抗子宮筋層側に位置しています。胎盤は子宮の中膜側に沿って位置しています。鉗子1組を使用して、切断面付近の子宮を把持します。2組のピンセットを慎重に互いに反対方向へ引き、子宮壁の抗子宮筋層側（anti myometrial side）に沿って裂きます。通常、これにより胎膜も破裂します。これにより、上部に胎児がはっきりと見え、その下に赤色の胎盤と白色の子宮組織が位置する状態になります。その下で、精密ピンセットを使用して、胎児臍帯および羊膜組織を胎盤から分離します。一組のピンセットで子宮組織を保持し、もう一組のピンセットを胎盤と下層の子宮組織の間に通します。このとき、胎盤から余分な脱落膜組織を取り除くことができます。ただし、一部の脱落膜細胞が残る可能性があります。解剖がすべて完了するまで、解剖した各胎盤を氷冷した解離バッファーに入れておきます。解剖が完了したら、胎盤と解離溶液が入ったコニカルチューブの蓋を緩めに閉め、37 °Cのウォーターバスに45〜60分間置きます。10分後、ピぺッティングで激しく上下に混ぜ合わせ、消化の進行状況を慎重に観察します。コラゲナーゼによる解離ステップの適切な時間は、個々の実験ごとに決定する必要があり、経験とともに習得されます。過剰な消化は細胞回収率を著しく低下させ、一方で消化不足は純度の低下および細胞数の減少を招く可能性があります。未消化の組織がわずかに残った時点で反応を停止させます。溶液をセルストレーナーに通して未消化物を除去し、500 ×gで5分間遠心分離して胎盤細胞をペレット化します。次に、細胞を洗浄します。解離溶液を除去します。上清を取り除き、細胞を10 mLの洗浄溶液で再懸濁し、500 ×gで5分間遠心分離します。その間に、高速遠心分離に適したチューブの中で、9.6 mLのper call溶液と13.4 mLの洗浄溶液を混合し、per call溶液を調製します。10倍濃度培地を1.1 mL加え、per call溶液を作成し、等張にします。チューブを転倒混和させます。遠心分離と洗浄後、上清を除去し、細胞ペレットを再懸濁させます。2 mLの洗浄溶液に細胞を加え、プロトコル溶液と混合してグラジエントを作成します。4°Cで30分間、20,000 ×gで遠心分離し、グラジエントを乱さないように注意してチューブを遠心機から取り出します。チューブを光源の前にかざすと、密度勾配をより容易に視認できます。チューブの上部付近には、主に細胞残渣を含む白いバンドが見え、チューブの下部付近には赤血球のバンドが見えるはずです。その直上にこれが栄養膜帯です。培地を栄養膜帯の直上まで吸引して廃棄します。次に、ピペットを使用して栄養膜帯を35 mLの洗浄液が入った清潔な遠心チューブに移し、500 ×gで5分間遠心分離します。栄養膜細胞をペレット化するには、栄養膜細胞培養液でペレットを再懸濁します。ここでは、6ウェルプレート内のインベイジョンチャンバーで細胞を培養します。Matrigelチャンバーは製造元の指示に従ってあらかじめ洗浄されており、各インサートの下のウェルに0.5から1 mlの培養液をピペットで分注します。次に、1.5 × 10⁵個の細胞を一定量の培地に懸濁させ、チャンバーに加えます。37 °C、5% CO₂条件下でインキュベートします。18〜24時間後、インキュベーターからインベーションチャンバーを取り出します。培地を除去し、チャンバー内をPBSで3回、1回につき5分間、穏やかに、かつ十分に洗浄します。インサートの上面から細胞と主要なゲルを掻き取ります。綿棒を使用し、ウェルに4%パラホルムアルデヒド溶液を満たして5分間インキュベートし、メンブレンの下面に浸潤した細胞を固定します。PBSで3回洗浄します。ウェルにDAPIなどの核染色剤を満たし、浸潤した細胞を染色します。20分間インキュベートします。再度、PBSで3回洗浄します。メスを用いて、ガラススライドに封入剤を1滴滴下し、ピンセットでインベーションチャンバーからメンブレンを慎重に取り出します。細胞が上を向くようにして、メンブレンをスライドに転写します。気泡が入らないように注意しながら、メンブレンを液滴の上に載せます。封入剤をさらに1滴加え、カバーガラスで覆います。メンブレン表面にある浸潤細胞を注意深く観察し、撮影します。図1に示すように、浸潤した絨毛外細胞はMatrigel層とメンブレンの孔を通過し、メンブレンの下面に現れます。また、孔が見える場合もあります。浸潤細胞数は、手動またはコンピューターソフトウェアを用いて計数し、治療群間で比較することができます。図2に示すように、核染色のほかに、免疫細胞化学を用いて浸潤細胞の特性を解析することが可能です。ここでは、細胞が絨毛細胞であることを確認するために、サイトケラチン7に対する抗体を使用しました。マウス胎盤からの栄養膜細胞の単離法を実証しました。次に、栄養膜細胞浸潤のin vitroアッセイを示しました。この手順を大部分（すべてではありませんが）用いることで、純度の高い栄養膜細胞集団を得ることができます。さらなる純度が必要な場合は、初代ヒト栄養膜細胞で報告されているように、磁気ビーズ分離法やフローサイトメトリーを行うことができます。本手順では市販のMatrigel浸潤チャンバーを使用しましたが、コーティングされていないTranswellチャンバーにMatrigelを任意の厚さで添加することでも作製可能です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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