Name: 高腔内圧で血管内皮へのイメージングの白血球接着 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: 学ぶ 高腔内圧下での血管内皮への白血球接着の可視化手法。ラットまたはマウスの頸動脈を用いて、生理的な血流条件下で炎症メカニズムをリアルタイムで観察できます。高血圧と動脈硬化の関連性を解明するのに役立ちます。

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この研究は、ビクトリア州政府のOIS​​プログラム、国民健康、オーストラリアのプログラムやプロジェクトの助成金の医学研究評議会（JPFチン-塵）と大学院の奨学金（Dミッシェル）によって部分的にサポートされていました。

1。頸動脈を分離<ol><li> CO 2 / O 2窒息経由Euthanase10週齢のSprague Dawleyラット。 </li><li>最小限の血管の伸縮性を確保大動脈、心臓と消費税の左と右の総頸動脈。 </li><li>氷冷クレブス緩衝液中で大動脈と心臓から頚動脈を分離し、緊密な解剖を行う。 </li><li>マウントする前に氷上でクレブスで孤立した血管を保つ。 </li></ol>約。時間= 45分 2。プライミング容器室<ol><li> 37バッファを介し℃、carbogenガス（5％CO 2 95％O 2）を導入することで、生理的pHに維持血管チャンバーフラッシュクレブスバッファーの近位および遠位のコネクタで</li><li>チューブやカニューレが完全にフラッシュされると、整列されていることを確認します。 </li><li> P1（近位）とP2（遠位）変換器を介してクレブスバッファーをフラッシュします。トランスデューサには、気泡のないことを確認するためにタップを閉じます。 </li><li>対応するコネクタにトランスデューサを接続し、再び空気の泡を確実にない、よりクレブスバッファーをフラッシュします。チャンバーにタップをオフに閉じてください。 </li></ol>約。時間= 15分 3。血管の加圧室<ol><li>圧力機器の電源をオンにします。圧力サーボ、圧力モニター、蠕動ポンプ（図1）。 </li><li>圧力は20 mmHgの（1のダイヤル）でチューブを介して自動実行クレブス緩衝液の圧力のサーボで蠕動ポンプと、空気の泡を保証しません。 </li><li>閉じたP2トランスデューサにチューブを接続します。圧力が安定になります。 </li><li>どんな泡を吐き出すのに血管チャンバーにP2のタップを開くには、その後オフ閉じます。 </li><li>クレブスバッファー（ - 7 mLの5）と風呂を埋める。 </li></ol>約。時間= 10分 4。容器の取り付け<ol><li>各カニューレ上に解剖顕微鏡の代わりに黒のポリエステルネクタイ（図2）に基づく。 </li><li>離れてカニューレとカニューレホルダーを移動して、P1のカニューレ上にマウント¼容器（大動脈弓の端）。容器を引き裂くしないことを確認します。 </li><li>クレブス緩衝液で満たされた注射器を使用すると、静かにP1のトランスデューサーを介して血管の過剰な血液を洗い流す。チャンバーにP1をオフに閉じます。 </li><li>ポリエステルのネクタイとP1のカニューレに安全な容器。 </li><li> P2カニューレに取り付けるためのカニューレ/近いカニューレホルダーを移動します。 </li><li>遠位カニューレに容器の先端を（〜¼長さの）マウントします。ポリエステルタイで固定します。 </li></ol>約。時間= 20分 5。容器を加圧<ol><li>容器内に曲げたり、ストレッチを確保しないようにカニューレホルダーを調整します。 </li><li> P1とP2は、チャンバーに閉じた状態で自動から手動に圧力サーボを切り替えます。 10秒内の圧力の継続的な低下が存在しない圧力のサーボを確認してください。ある場合は、リークが発生している接続と変換器は、所定位置に固定する必要があります。 </li><li>チャンバーへの自動その後オープンP2に背圧サーボを調整します。顕微鏡下でタップをチャンバーに開いたときに血管が拡張させ観察。 </li><li>マニュアルに圧力のサーボを切り替えます。 10秒内の圧力の継続的な低下のためにもう一度確認してください。漏れがある場合、システムはタイトな圧力と容器内の穴になる可能性がありますされていません。 </li><li>チャンバーに自動オープンP1に切り替えます。手動設定で圧力が安定していることを確認してください。 </li><li>ない漏れの場合、手動設定の増加ダイヤルの2（40 mmHgの）へ。 </li><li>自動に調整し、顕微鏡下で血管を観察。必要に応じて、手動設定に漏れがないvessel.Checkには曲がりのないことを確認するためカニューレホルダーを調整する。 </li><li> 5.7所望の圧力に到達するまでに、3（60 mmHgの）を4（80 mmHgの）などのダイヤルを増やす - 手順5.6を繰り返します。 </li></ol>約。時間= 15〜30分 6。加圧容器をインキュベート<ol><li> 37温度コントローラセットを接続℃を</li><li>血管室バスへの2番目の蠕動ポンプ散らすクレブス緩衝液（1 mL /分）で。 </li><li>バスの唯一の最上位層が除去されることを保証室にアスピレータを接続します。 </li><li>自動に設定された圧力で1時間、37℃で加圧された容器をインキュベートする。 </li><li>圧力が定期的に（手動への切り替え）漏洩されていません確認してください。 </li><li>様々な薬理学的介入の効果は、単にインキュベーション中にお風呂に化合物を添加することによって観察することができます。 </li></ol>約。時間= 1時間 7。全血と加圧容器を灌流<ol><li>インキュベーション中に少なくとも7.5 mLのヒト全血/ 40 Uのヘパリン/ mLの血液中に収集された容器を得る。 37℃で50mlファルコンでインキュベート℃の</li><li> tの最後の10分前37彼10分間VybrantDil（1:1000）とインキュベーションのラベルの血·ダークのC。 </li><li> 10分後、気泡をクリアシリンジで血液を収集し、37℃で設定されたヒートジャケット℃でシリンジポンプに取り付けて</li><li>室/容器にP1のトランスデューサをオフに閉じ、シリンジと廃液チューブを接続する。 </li><li>任意の気泡を除去するため廃液チューブを介して1000μL/ minでパージの血液。 </li><li>チャンバーにP1を開きます。圧力のサーボは、所望の圧力を維持するために自動的に調整されます。 </li><li> 100μL/ minの血液を灌流。 </li><li>デジタルカメラのレコード1で15秒間灌流血管の2つのフィールド、3、5、7.5および10分に結合蛍光顕微鏡を使用する。 </li><li>郵便灌流血管内皮の完全性と機能がさらに炎症反応を検証するために免疫組織化学によって決定することができるようミオグラフと接着分子の発現などの薬理学的技術を介して評価することができる。 </li></ol>約。時間= 15分 8。代表的な結果： 圧力室のセットアップの概略図を図1に示されています。と蛍光顕微鏡の結果に結合デジタルカメラは、ライブビデオの録画を経由して瞬時に視覚化することができます。代表的なビデオ画像は、白血球が、彼 ​​らが10秒間静止残った場合内皮に付着すると考えられる図3に見られている。連続ループ接着細胞でのビデオ録画とフィールド当たりの平均としてカウントすることができます。低い（ 図3A）と高い（ 図3B）圧力の両方に密着性のある量の高い管腔内圧における白血球接着の顕著な増加を引き起こすだろうが見られ、これはまた、（ 図4）定量的に実証される。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。加圧ex vivoでの血管チャンバー概略図。近（P1）変換器と血圧が容器内で操作できるようにする、遠位（P2）変換器に接続されているカニューレ容器。灌流は、P1のトランスデューサーを介して、圧力はP2変換器を介して維持されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。タイでCannuala。黒いポリエステルのネクタイは、各カニューレに接続されています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。灌流の10分後の代表的なビデオ画像を 80 mmHgの（）で蛍光下。ダイナミック細胞接着（赤矢印）、120 mmHgの（B）。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。低い（80 mmHgの）と高圧（120 mmHgの）で1時間のインキュベーション後のSprague Dawleyラット頸動脈の動脈における白血球接着。 *** P &lt;0.001、としてBonferroniの事後検定を用いて2方向反復測定ANOVAで分析した。

<ol><li>Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+burden+of+disease+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional burden of disease and risk factors.</a> Lancet. 367, 1747-1757 (2001).</li>
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<li>Riou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+pressure+promotes+monocyte+adhesion+to+the+vascular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall.</a> Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).</li>
<li>Ley, K., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial%2C+not+hemodynamic%2C+differences+are+responsible+for+preferential+leukocyte+rolling+in+rat+mesenteric+venules.+Circ+Res%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res.</a> 69, 1034-1041 (1991).</li>
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<li>Eberth, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+pulsatility+in+hypertensive+carotid+artery+growth+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling.</a> J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).</li>
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</ol>

治験実施計画書は、アルフレッド医学研究と教育分署動物倫理委員会とアルフレッド病院倫理委員会によって承認された。

これはリアルタイムで加圧条件下では無傷の孤立した血管の内皮への白血球の接着を研究するために修正された方法です。容器室の血流だけでは、大規模なマウスやラットの血管の炎症誘発性菌株の迅速な検証が可能になります。圧力操作を有効にすると、より良い模倣- ING生理学的および病態生理学的状態、動的な細胞間相互作用が非常に高い腔内圧力に低いから観察することができます。血管の直径は、十分な細胞イメージングプログラムを使用して測定することができるため、せん断流れおよび速度を決定し、したがって、操作することができます。 そのミオグラフ機能により、浴室に置かれた薬理学的介入は、このモデルは機械論的とシグナル伝達経路の研究を可能にすると可能な実験条件に別のディメンションを追加します。内皮保存が圧力の操作中に確認することはできませんが、アセチルコリンとPEへの応答がポスト灌流9を行うことができる。 それは、このセットアップは、細胞間の相互作用ではない拍動血流も収縮期または拡張期圧の影響についての管腔内圧の影響を示すことに注意する必要があります。白血球接着に対する急性圧力の変化が観察された一方さらに、、この設定はまた、慢性的な圧力の効果（すなわちインキュベーション時間の増加と慢性的な圧力の動物モデルを用いて）を見に利用することができます。のSprague Dawleyラット総頚動脈は、このセットにまで実証されていますが、他の系統と種は、カニューレのサイズに適切な調整で使用することができます。確かに、動物の年齢と体重がセットアップ船舶ごとに個別化する必要があることをこのように容器のサイズに影響を与えるとことに注意することが重要です。結合組織の密接かつ慎重に解剖は非常に白血球の可視化を向上させることができます。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/装置の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>カールツァイス株式会社</td><td>ステレオディスカバリーV.20 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 2000シリンジポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td> 70から2016 </td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラとコントローラ</td><td>浜松ORCA - ER </td><td> C4742 - 95 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光照明システム</td><td>ルーメンダイナミクス</td><td> X - Citeの120 </td><td></td></tr><tr><td>血管の商工会議所</td><td>リビングシステムの計装</td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td>圧力サーボコントローラとペリスタルティックポンプ</td><td>リビングシステムの計装</td><td> PS - 200 </td><td></td></tr><tr><td>灌流圧モニター</td><td>リビングシステムの計装</td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 ×圧力変換器</td><td>リビングシステムの計装</td><td> PT - F </td><td></td></tr><tr><td>温度コントローラ</td><td>リビングシステムの計装</td><td> TC - 01 </td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>インステックラボラトリーズ株式会社</td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil細胞標識溶液</td><td>インビトロジェン</td><td> V - 22885 </td><td> 1:1000を使用してください</td></tr></tbody></table>

高腔内圧で血管内皮へのイメージングの白血球接着

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

世界中で、高血圧は、人口の約4分の1であることが報告と死亡率、世界中の主要な生物医学的危険因子です。血管性高血圧では血管内皮機能障害とアテローム性動脈硬化症や慢性腎臓病2、脳卒中3心不全4など様々な疾病状態につながる増加炎症に関連付けられています。アテローム発生につながる血管の炎症の初期段階では、内皮を介して白血球のローリング、テザリング、アドヒアランスやその後の転生を含む接着カスケードです。内皮への白血球の動員と蓄積は、血管細胞接着分子-1（VCAM - 1）、細胞内の細胞接着分子-1（ICAM - 1）とE -セレクチンと同様の増加などの接着分子の発現増加によって媒介されるサイトカインとケモカイン放出と活性酸素種のアップレギュレーション5。このような静的な接着アッセイなどのin vitro法では細胞間接着に関与するメカニズムだけでなく、細胞接着分子の解析を判断するのに役立ちます。 in vitro試験前で採用されている手法は、内皮上に圧力の急性の増加が単球接着、6しかし、in vitro試験の多くと同様に、これらの結果がリアルタイムで行われていない接着分子と炎症マーカーの発現上昇につながることができることが実証されている生理的流れの条件下で、また全血を持つ。したがって、in vivo試験では 、ますます血管炎症とプラークの開発を実証するために動物モデルで利用されています。生体顕微鏡検査は現在では広く白血球接着、ローリング、マイグレーションと転生7-9を評価するために使用されます。 in vivo試験内皮接着する白血球に圧力の効果を組み合わせるときには、それほど広範です。そのような研究は、免疫組織化学10を介して評価された動脈の成長とリモデリングが炎症マーカーのフローとせん断のリアルタイムエフェクトを調べます。ここでは、全血灌流を使用して無傷の加圧された血管のリアルタイムで白血球の接着を記録するためのモデルを提示する。方法論は、無傷の血管の白血球-内皮接着剤の相互作用のリアルタイム解析を可能にするex vivoの血管室灌流モデル9の変更です。私たちの修正は、管腔内圧だけでなく、生理的な流れの条件だけでなく、加圧条件下での試験を可能にする最大200 mmHgの操作が可能になります。圧力の筋運動記録法のシステムが以前に血管壁と内腔直径11だけでなく、血管の収縮を観察することが立証されているが、これはリアルタイムで白血球-内皮相互作用を示す初めてのことです。ここでは、頸動脈ラットから採取し、蛍光顕微鏡に結合カスタムメイドのフローチャンバーへのカニューレを使用して技術を実証する。容器のチャンバーは、画像の容器を、短い作動距離と大口径対物レンズを可能にする大規模な底のカバーガラスが装備されています。さらに、選択されたアゴニストおよび/またはアンタゴニストは、さらに細胞接着を制御するメカニズムを調べるために利用することができます。生体顕微鏡に比べてこの方法の利点は、侵襲手術のない関与を含んでいないため、より高いスループットを得ることができます。生体内では唯一の全身阻害剤の治療を可能にするのに対し、この方法はまた、所望の容器にローカライズされた阻害剤の治療を使用できるようになります。

これは収穫加圧された血管の内皮への白血球の接着を可視化する方法です。テクニックは、このように高血圧の病態生理学的条件を模倣 - イング200 mmHgに管内の圧力に異なるとのせん断流動下で血管の密着性を研究することができます。

世界的に、高血圧は人口の約4分の1に認められると報告されており、世界における死亡の主要な生物医学的リスク要因となっています。...

この手順の全体の目的は、採取した加圧血管において、白血球の内皮細胞への接着を可視化することです。まず、ラットまたはマウスから頸動脈を単離します。次に、その血管を加圧チャンバーに取り付けます。その後、容器を加圧し、任意の圧力で1時間インキュベートします。最後に、標識した全血を加圧された容器に灌流させます。最終的に、プレシジョンサーボおよび蛍光顕微鏡に接続されたカスタムメイドのex vivo血管チャンバーを通じて、白血球の内皮へのリアルタイムな接着を示す結果を得ることができます。静的な接着アッセイなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、全血を用いて、機能的に完全な動脈における白血球の接着を観察できることです。この手法は、高腔内圧が炎症に及ぼす影響や、それがどのように動脈硬化に寄与するかなど、高血圧研究における重要な疑問を解決するのに役立ちます。10週齢のSprague-Dawleyラットから頸動脈を単離し、灌流チャンバーのプライミングと加圧を行った後、まず各カニューレに黒色のポリエステルタイを装着し、血管をバスへ移動させ、血管の4分の1をP1カニューレに固定して、解剖顕微鏡下で血管をマウントします。Krebs緩衝液を満たしたシリンジを使用して、血管を損傷させないように注意しながら操作してください。P1トランスデューサーを通して、血管内の余分な血液をゆっくりと洗い流します。チャンバーへのP1の経路を遮断します。ポリエステルタイを使用して、血管をP oneカニューレに固定します。カニューレとカニューレホルダーを近づけ、P twoカニューレに取り付けられるようにします。血管の遠位側4分の1の端をP twoカニューレに取り付けます。ポリエステルタイで固定し、容器の加圧を開始します。P1およびP2をチャンバー側で閉じた状態で、容器に曲がりや伸びが生じないようカニュラホルダーを調整します。圧力サーボをオートマチックからマニュアルに切り替えます。プレッシャーサーボを確認し、10秒以内に圧力が低下しないことを検証します。圧力が低下した場合はリークが存在することを示しており、気密性を確保するために接続部およびトランスデューサをしっかりと固定する必要があります。プレッシャーサーボをオートマチックに戻し、P2を開いて顕微鏡下のチャンバーに圧力を送り、血管が拡張する様子を観察します。タップを開いてチャンバーに通します。圧力サーボをマニュアルに切り替えます。再度、圧力の低下がないか確認してください。圧力が低下し続ける場合は、システムが気密状態になく、容器に穴が開いている可能性があります。自動設定に戻し、P1をチャンバーに向けて開きます。マニュアル設定で、圧力が安定したままであるかを確認してください。安定していれば、ダイヤルを2に上げ、容器内を40 mmHgに加圧します。オートモードに切り替え、顕微鏡下で容器を観察してください。必要に応じて、マニュアル設定で容器に屈曲がないようカニュラホルダーを調整します。漏れがないか確認します。次に、目的の圧力に達するまで、ダイヤルを1刻みで上げ、その合間に自動設定に切り替えて顕微鏡で容器を観察します。目的の圧力に達したら、チャンバーを実体顕微鏡へ移動させてください。温度コントローラーを接続し、37 °Cに設定します。次に、ペリスタルティックポンプとアスピレーターを接続し、バス内のKrebs緩衝液を新鮮な状態に保ちます。加圧容器を37 °Cで1時間インキュベートします。定期的に漏れがないか確認します。暗所で、Vibrant dyeを添加した全血7.5 millilitersのprecoにラベルを貼ります。その後、37 degrees Celsiusで10分間インキュベートします。血液をシリンジで採取し、気泡を除去した後、37 °Cに設定したヒートジャケット付きのシリンジポンプに取り付けます。チャンバーへのP1トランスデューサーを遮断し、シリンジと廃液チューブを接続します。廃液チューブを通して血液を1000 µL/minでパージして気泡を除去し、チャンバーへのP1を開きます。圧力サーボが自動的に調整され、目的の圧力が維持されます。100 µL/minで血液を灌流させ、デジタルカメラを接続した蛍光顕微鏡を用いて、灌流血管の2つの視野を複数のタイムポイントで15秒間記録します。白血球の代表的な画像がここに示されており、10秒間静止している白血球を内皮に接着しているとみなします。ビデオ録画を連続的にループさせることで、1視野あたりの平均細胞数をカウントでき、低圧および高圧の両方で一定量の接着が認められます。管腔内圧が高くなると、白血球の接着が著しく増加することが観察されます。このことは、80 mmHgよりも120 mmHgの圧力において、1視野あたりの接着細胞数が多いという本グラフの定量的な結果に示されています。この手順に続き、接着分子の遺伝子およびタンパク質発現などのさらなる疑問を解消するために、PCRや免疫組織化学などの他の手法を実施することが可能です。

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我々は、in vivoでの好中球走化性因子のソースに対応して好中球動員中に動的な好中球 -...

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におけるフローの状況の下で白血球 - 内皮相互作用を評価するエクスビボ Autoperfusedマイクロフローチャンバーアッセイ

この簡略化されたマウスの腸間膜静脈の生体内顕微鏡検査は、白血球-内皮および血小板-白血球の相互作用を観察するためのさまざまな炎症モデルで使用できます。...

マウスの腸間膜静脈内の生体顕微鏡白血球 - 内皮及び血小板 - 白血球の相互作用

炎症時に血管壁の損傷後、白血球は血管細胞と血小板との対話熱心。ここでは、白血球や細胞パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを特徴付ける簡単流アッセイについて述べる。...

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ここでは、単球 subpopulation の特定の表面マーカーと共焦点蛍光顕微鏡を用いて in vitro...

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

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ひと誘導多能性幹細胞由来血管内皮細胞 (による ECs) へ白血球接着の評価のためのマイクロ流体アッセイ

このプロトコルでは、生理学的に関連する微小血管環境を再現し、白血球接着/遊走カスケード全体を再現することができる生体模倣マイクロ流体アッセイが、炎症性疾患における白血球 - 内皮細胞相互作用を研究するために採用される。...

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

学ぶ 高腔内圧下での血管内皮への白血球接着の可視化手法。ラットまたはマウスの頸動脈を用いて、生理的な血流条件下で炎症メカニズムをリアルタイムで観察できます。高血圧と動脈硬化の関連性を解明するのに役立ちます。

高腔内圧で血管内皮へのイメージングの白血球接着

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