Name: のTaqManワンステップRT-PCR法によるキッズスツールからノロウイルスの検出とGenogrouping (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: 学ぶTaqManワンステップRT-PCR法によるノロウイルスの検出とゲノグループ分類。小児便検体からウイルスRNAを抽出し、高感度・高特異性で診断するコスト効率の良い手法を確立し、臨床および疫学研究に有用です。

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著者らは、NOVのための標準と制御陽性の親切な贈り物を疾病管理予防のための国立カリシウイルス研究所センター（CDC）に感謝したいと試薬を提供するためのジョンズホプキンス大学公衆衛生学部の研究室です。

1。糞便サンプル<ol><li>糞便サンプルは、RNAを維持するために凍結保存する必要があります。 10パーセント糞便懸濁液を作成するには、解凍糞便サンプルの約0.1グラムをとり、PBS 1 mlに完了します。 </li><li>繰り返し凍結融解を避けるために、200μlのアリコート。 -70℃でアリコートを格納する</li><li>解凍および抽出に使用する前に、10分間4000グラムでアリコートを遠心分離します。 </li></ol> 2。グアニジン＆シリカの抽出のためのシリカ粒子の調製<ol><li> RTで、二酸化珪素の30グラムを中断し、最大250 mLのdH 2 Oで完了します。 </li><li>沈降の24時間後、吸引により上清215 mLを削除します。最大250 mLまでのdH 2 Oを追加し、振とうすることによりシリカペレットを中断します。 </li><li>別の24時間後、吸引により上清を除去し、塩酸（HCl）を用いて、pHを2.0にシリカ懸濁液のpHを調整します。アリコートガラスのボットで得られたシリカ懸濁液tles、オートクレーブ。 </li></ol> 3。グアニジン＆シリカの抽出のためのL6バッファーの調製<ol><li>室温で、0.1 Mトリス塩酸50mLのpHは6.4と0.2 M EDTA、pH8.0の溶液を11 mLのグアニジニウムチオシアネート（GuSCN）とトリトンX-100の1.3グラムの60グラムを溶解させたL6バッファを準備します。 </li></ol> 4。グアニジン＆シリカの抽出のためのL2バッファの準備<ol><li>室温で、0.1 Mトリス塩酸150mLを、pHを6.4にグアニジニウムチオシアネート（GuSCN）の180グラムを溶解させたL2バッファを準備します。 </li></ol> 5。抽出法<ol><li>各抽出年11肯定的な糞便サンプルは、ポジティブコントロール、およびDEPC処理水として、ネガティブコントロールとして、含まれるべきである。 </li><li>マイクロ遠心チューブに次のように混ぜる。バッファL6、シリカ粒子の20μLを1 mL、10％糞便抽出懸濁液200μLを追加します。簡単にボルテックスし、15マイルRTで残すN。 </li><li> 10秒間6000グラムで、懸濁液を遠心分離し、70％エタノールで2回洗浄し、アセトンで1時間、続いて二回バッファL2の1ミリリットルでペレットを洗浄する。 56℃乾燥した加熱ブロックにペレットを乾燥℃で5分間。 </li><li> RNaseフリーのdH 2 O50μLを追加することにより、シリカペレットの水和物は、RNA。 15分間RNasinの1μL、56で反転管とインキュベートすることにより混合°Cを追加します。 </li><li>卓上遠心機で、フルスピードで3分間遠心し、RNAを含む上清の40μLを収集します。 </li><li>光度計2000分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用して抽出したRNAサンプルを定量化する。次いで-70℃で保存を使用するまで、6ヶ月まで。 （ 注：完全なトータルRNAを維持する良い方法は、cDNAに変換されます）。 </li></ol> 6。商業RNA別途準備ウイルスRNAキットを使用して別の抽出完全な手順については、冊子プロブで発見されQIAGENキットでided。簡単に手順は次のとおりです。 <ol><li>バッファAVLのピペットで560μLを1.5 mLチューブにキャリアRNAを含む、10％糞便懸濁液140μLを追加します。 15秒間パルスボルテックスで混和。 10分間室温でインキュベートします。 </li><li> 15秒間パルスボルテックスサンプルと混合するエタノール56​​0μL（96〜100％）を追加し、手短に遠心します。 </li><li> 2 mlのコレクションチューブに入れ、スピンカラムに、このソリューションの630μLを適用します。 6000グラムで1分間遠心してから、クリーンな2 mLのチューブにスピンカラムを配置します。 </li><li> 1分間6000グラムで、バッファAW1および遠心の500μLと結合したRNAを含むカラムを洗浄します。きれいな2 mlのコレクションチューブにカラムを配置します。 </li><li> 3分間、フルスピード（20,000 gまたは14,000 rpmで）500 Buffer AW2をμLの遠心でカラムを洗浄します。 </li><li> 、新しい1.5 mlマイクロ遠心チューブにスピンカラムを置き40μLDEPC処理水を追加し、フルスピードでRNAを溶出します。を繰り返す溶出したRNAの最後の80μL用のce。 </li><li>光度計2000分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用して抽出したRNAサンプルを定量化する。次いで-70℃で保存を使用するまで、6ヶ月まで。 （ 注：完全なトータルRNAを維持する良い方法は、cDNAに変換されます）。 </li></ol> 7。特異的なTaqManプローブによるワンステップリアルタイムRT-PCRにより抽出したRNA中のノロウイルスの検出楽器StepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems社）。 方法論<ol><li>潜在的なRNaseのコンタミを除去するためにAWAY RNase Aですべての作業面、ピペット、および遠心分離機を拭いて清掃してください。 </li><li>ピペットNOV GIとGIIスクリーニングマスターは、 表1によるとミックスします。プライマーとTaqManプローブは、 表2に記載されています。 </li><li>各反応チューブに適したマスターミックスのアリコートを10μL。 </li><li>原液未知のサンプルの5μLを追加します。対応する反応ウェルにRNAを、陰性対照としてDEPC処理水、またはそれぞれGI GII陽性コントロールRNA、。すべての検体をduplicateで実行する必要があります。それぞれ300μg/μLのおよび500μg/μLの濃度の正のコントロールと基準は、疾病管理予防のための国立カリシウイルス研究所センター（CDC）によって提供されていました。 </li><li> 10秒のために6000グラムで、反応プレートを遠心します。 </li><li>実験のプロパティ画面で、実行のための実験のタイプを定義して選択します。のTaqMan試薬は試薬の種類、およびその前のPCR増幅読み取りと選択されているように表示されていることを確認します。 </li><li> 表3に示す温度プロファイルを用いて15μLの反応を実行します。 </li><li>結果を分析します。 </li></ol> 8。従来のRT-PCRおよびシーケンシングを用いたGIとGII月のジェノタイピング （それが一般的で広く使われている方法ですので、それはこのビデオに記載されていません。） 楽器。アプライドバイオシステムズStepOneとQuantitecテンプレートを使用してStepOnePlusリアルタイムPCRシステム。 方法論<ol><li>タイピングの前に、サンプルの遺伝子型（GIまたはGII）は、RT-PCRは、上記のスクリーニングによって決定されます。 GI NOV RNAは、GIのジェノタイピングマスターミックスとGII遺伝子タイピングマスターミックスとGII月RNAを増幅する必要があります。 </li><li>ピペットNOV GIとGII遺伝子タイピングマスターは表4に従って混合します。プライマーGI SKF / SKRとG2 SKF / SKRは、 表5に記載されています。 </li><li> 0.2mLの反応チューブに適したマスターミックスのアリコートを45μL。 </li><li>それぞれ陰性対照チューブにDEPC処理水の5μL、事前スクリーニング、11（GIおよび/またはGII）は、対応する反応チューブへの積極的なRNAの5μLを追加します。 </li><li> 表6の熱プロファイルを使用して50μLの反応を実行します。 </li><li> PCR産物contaiを送る少なくとも100は、増幅されたカプシド領域のng /μLの精製と配列決定のために会社をマクロゼンする寧。 （9700大セネカハイウェイ。ロックビル、MD 20850およびシークエンシングサンプルあたり10ドル）。 </li></ol> 9。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1は、TaqMan下痢子供から糞便サンプルから抽出したRNAアッセイに使用されるワンステップRT-PCRから代表的な結果を示しています。ポジティブサンプルの閾値サイクル（Ct）がGIIのGIとCt 39未満またはCT 37に等しく設定された。ポジティブコントロール用のCT-値は、それぞれ27およびGIとGIIのためのORF1-ORF2のジャンクションの18未満であることが判明した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3232/3232fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2 <table border="1"><tbody><tr><td> マスターミックス </td><td> 最終濃度 </td><td> 体積（μL） </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 2.875 </td></tr><tr><td>のQuantiTect RT-PCRマスターミックス</td><td> 1X </td><td> 6.250 </td></tr><tr><td> RTミックス</td><td> 1X </td><td> 0.125 </td></tr><tr><td> 50μMコグRプライマー</td><td> 1μM </td><td> 0.250 </td></tr><tr><td> 50μMコグFプライマー</td><td> 1μM </td><td> 0.250 </td></tr><tr><td> 10μMリングプローブ</td><td> 1μM </td><td> 0.125/0.250 * </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 10.00 </td></tr></tbody></table>各プローブの0.125μLがGIIのテストに使用している間に、各プローブの* 0.250μLは、GIテストのために使用されていました。 スクリーニングGIとGIIについては、 表1を参照。キアゲンのQuantiTectマスターミックス（トルヒーヨら 、2006）7。 <table border="1"><tbody><tr><td> 名 </td><td> ジェノグループ </td><td> 使用 </td><td> 配列（5 'から3'） </td></tr><tr><td>コグ1R </td><td> GI </td><td>プライマー</td><td> CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C </td></tr><tr><td>コグ1F </td><td> GI </td><td>プライマー</td><td> CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA </td></tr><tr><td>コグ2R </td><td> GII </td><td>プライマー</td><td> TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA </td></tr><tr><td>コグ2F </td><td> GII </td><td>プライマー</td><td> CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG </td></tr><tr><td>リング1A </td><td> GI </td><td>プローブ</td><td> FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td>リング1B </td><td> GI </td><td>プローブ</td><td> FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> Ring2-TP </td><td> GII </td><td>プローブ</td><td> FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1 </td></tr></tbody></table> genogroups I、II（影山ら 、のリアルタイム定量的RT-PCRに使用される表2のプライマーおよびプローブオリゴヌクレオチド2003）8。 <table border="1"><tbody><tr><td> 手順 </td><td> 温度（°C） </td><td> 時間（分） </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 50 </td><td> 30:00 </td><td> cDNA合成</td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td>午前15時</td><td> HotStartのTaqポリメラーゼの活性化</td></tr><tr><td> 3 </td><td> 95 </td><td>夜12時15分</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 60 </td><td> 1時</td><td> 45Xサイクル</td></tr></tbody></table> テーブル（3）ワンステップのTaqManリアルタイムRT-PCR用のサーマル·プロファイル（トルヒーヨら 、2006）7。 <table border="1"><tbody><tr><td> マスターミックス </td><td> 最終濃度 </td><td> 体積（μL） </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 29.50 </td></tr><tr><td> 5XキアゲンRT-PCRバッファー</td><td> 1X </td><td> 10.00 </td></tr><tr><td> 10mMのdNTPミックス</td><td> 0.4mMの</td><td> 2.00 </td></tr><tr><td>酵素ミックス</td><td></td><td> 2.00 </td></tr><tr><td> 40 U /μLRNAsin </td><td> 20 U /μL </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> 10μMSKF </td><td> 0.1μM </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> 10μMのSKR </td><td> 0.1μM </td><td> 0.50 </td></tr></tbody><tbody><tr><td></td><td></td><td> 45.00 </td></tr></tbody></table> 表4。キアゲン遺伝子型GIとGIIのためのワンステップRT-PCRマスターミックス。 <table border="1"><tbody><tr><td> 名 </td><td> ジェノグループ </td><td> 使用 </td><td> 配列（5 'から3'） </td></tr><tr><td> G1SKF </td><td> GI </td><td>プライマー</td><td> 5'-CTG C​​CC GAA TTY GTA AAT GA - 3 </td></tr><tr><td> G1SKR </td><td> GI </td><td>プライマー</td><td> 5'-CCA ACC CAR CCA TTR TAC A - '3 </td></tr><tr><td> G2SKF </td><td> GII </td><td>プライマー</td><td> 5'-CNT GGG AGG GCG ATC GCA A - 3 </td></tr><tr><td> G2SKR</td><td> GII </td><td>プライマー</td><td> 5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3 </td></tr></tbody></table> 表5。キャプシド領域の領域C（小島ら 、2002）の増幅に用いるプライマー5。 <table border="1"><tbody><tr><td> 手順 </td><td> 温度（°C） </td><td> 時間（分） </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 30:00 </td><td> cDNA合成</td></tr><tr><td> 2 </td><td> 96 </td><td>午前15時</td><td> HotStartのTaqポリメラーゼの活性化</td></tr><tr><td> 3 </td><td> 94 </td><td>夜12時03分0 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 52 </td><td> 1時</td><td> 40Xサイクル</td></tr><tr><td></td><td> 72 </td><td>夜12時30 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 10時</td><td>アニーリング</td></tr></tbody></table> 表6のTaqManワンステップRT-PCR用のサーマル·プロファイル。

<ol><li>Medici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+Norovirus+infections+in+sporadic+cases+of+viral+gastroenteritis+among+children+in+Northern+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy.</a> L. Medical Virology. 78, (2006).</li>
<li>Vidal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+recombinant+Norovirus+causing+outbreaks+of+gastroenteritis+in+Santiago%2C+Chile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clinica+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile.</a> J. Clinica Microbiology. 4, (2006).</li>
<li>Xavier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+caliciviruses+associated+with+acute+infantile+gastroenteritis+in+Salvador%2C+an+urban+center+in+Northeast+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).</li>
<li>Boom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Kojima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genogroup-specific+PCR+primers+for+detection+of+Norwalk-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses.</a> J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).</li>
<li>Mattison, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+comparison+of+two+norovirus+ORF2-based+genotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).</li>
<li>Trujillo, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+TaqMan+real-time+reverse+transcription-PCR+for+rapid+detection%2C+quantification%2C+and+typing+of+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).</li>
<li>Kageyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+reactive+and+highly+sensitive+assay+for+Norwalk-like+viruses+on+real-time+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

糞便サンプルから核酸を単離するための経済的なインハウス方式を使用して、我々は、キアゲンから商用QIAmpウイルスRNAキットと同じように同じ結果を取得し、一緒に私たちの研究室で開発されたTaqMan RT-PCRで、私たちは月の広い範囲を検出することができますGIとGII遺伝子型に属する品種。領域Cプロトコルの最近の出版物は78％6のタイピング速度を報告した。現代のNOV株の多様性が前の年の間に増加しているので、成功率はテストされている標本の領域Cのプライマーのミスマッチに依存します。それがこうして時間7ターンアラウンドを短縮し、増幅後の製品の処理を排除するようにアッセイは、通常の診断に有用である。別に診断から、このプロトコルはまた、この疾患の公衆衛生上のコントロールに有用であるため、11月の感染症の疫学を明確にするために使用することができます。 スクリーニングを実行するときにRT-PCR、プライマー/プローブセット用のネガティブコントロール（NC）反応が閾値ラインを通過蛍光成長曲線を示すべきではありません。偽陽性は、プライマー/プローブ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>グアニジンイソチオシアネート</td><td>シグマAdrich </td><td> G9277 </td><td></td></tr><tr><td>トリスHCl </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> T5941 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td>シリカ</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> S5631 </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX 100 </td><td> BDHケミカル</td><td> 14530 </td><td></td></tr><tr><td>ジエチル</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> D-5758 </td><td></td></tr><tr><td>別途準備ウイルスRNA Miniキット（250） </td><td> QIAGEN </td><td> 52906 </td><td></td></tr><tr><td>定量テックプローブRT-PCRキット（200） </td><td> QIAGEN </td><td> 204443 </td><td></td></tr><tr><td>キアゲンワンステップRT-PCRキット（200） </td><td> QIAGEN </td><td> 210212 </td><td></td></tr><tr><td> RNase阻害剤2000個</td><td> A.Biosystems </td><td> N808-0119 </td><td> 2000 UNIDが/バイアル</td></tr><tr><td>ノンスティックRnaeフリーマイクロチューブ</td><td> Ambionの</td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td>純アガロース1000年</td><td>インビトロジェン</td><td> 16550-100 </td><td></td></tr></tbody></table>

のtaqmanワンステップrt-pcr法によるキッズスツールからノロウイルスの検出とgenogrouping

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

ノロウイルス（NoVs）はすべての年齢の人間の世界的な散発的な急性胃腸炎の集団発生の主要原因となっています。彼らは、ロタウイルスに似た公衆衛生上の影響を持つ子どもの入院の重要な原因となっています。 NoVsは偉大な遺伝的多様性のRNAウイルスであり、新しい株の連続的な外観があります。五genogroupsが認識され、GIとGIIを彼らの多くの遺伝子型とヒトへの感染のために最も重要なサブタイプである。しかし、これら2つの遺伝子型の診断は、診断と治療を遅らせることは、問題のままである。1、2、3 糞便検体からのRNA抽出のために最も一般的に使用されるメソッドは、QiagenからQIAmpウイルスRNA市販のキットです。このメソッドは、コントロールRNaseがそのバッファを、シリカゲルメンブレンの結合特性を組み合わせて、マイクロスピンの速度と一緒にカラムにRNAの最適な結合を提供しています。このメソッドは、簡単で高速かつ信頼性が高く、カーです。製造元から提供されている記述で詳述されているいくつかのステップでiedを。 ノロウイルスは、下痢の最も一般的な原因として、ロタウイルスに次ぐです。ノロウイルスの診断は、下痢の病因のすべての研究で同様の発生、または個々の下痢症で使用できる必要があります。現在ではしかし、ノロウイルスの診断は、診断の簡単な方法の欠如に起因するわずか数センターに限定されています。この遅延の診断と治療1、2、3。さらに、国内および間に腐食性のバッファのコストと規制輸送に起因するこれらの製造キットの使用ロジスティック問題を引き起こします。結果として、このプロトコルで我々は、グアニジニウムチオシアネートの抗ヌクレアーゼのプロパティと一緒にシリカ粒子の核酸結合特性を使用して、元のブームらの方法4に基づいて、代替的、経済的、社内の方法を説明。 <p class=&quot;jove_content&quot;&gt;糞便検体からNoVs分離株の検出とgenogrouping（GIとGII）は、異なるターゲットを利用したいくつかのRT-PCRのプロトコルが開発されている。コンセンサスは、高感度、特異性、高スループットと使いやすさと再現性を兼ね備えているためのTaqManケミストリーを用いたRT-PCRは、診断のための最良の分子技術であろうということである。診断に最も適したのでNOVのゲノムの中で最も保存領域と、ここではオープンリーディングフレーム1（ORF1）-ORF2のジャンクショ​​ン領域を標的とするアッセイを説明します。さらに、遺伝子解析カプシド（領域C）もともと小島らによって記載されたプライマーを用いて5の主要タンパク質から高可変N末端 ​​シェルをターゲットにして、従来のRT-PCRのために詳述されている。従来のPCRからのPCR産物のシークエンシングは、GIとGII genogroupsに属する遺伝子の分化を可能にします。

オープンリーディングフレーム1（ORF1）ORF2接合領域に特異的なプライマーとTaqManプローブを利用して子どもの便からノロウイルス分離株の検出および遺伝子型の識別のためのワンステップRT-PCRアッセイ、ノロウイルスゲノムの中で最も保存領域です。説明します。非商業的、費用対効果の高いRNA抽出法が詳述されている。

のTaqManワンステップRT-PCR法によるキッズスツールからノロウイルスの検出とGenogrouping

ノロウイルス（NoVs）は、あらゆる年齢層の人間において、世界的に散発的な急性胃腸炎のアウトブレイクを引き起こす主要な原因となっています。これらは、...の重要な原因であり、

特異的TECHMANプローブを用いたワンステップリアルタイムR-T-P-C-Rによる抽出RNA中のNeurovirusの検出について。今回は、Neurovirusについてお話しします。本研究はペルーのリマにある大学のグループおよびジョンズ・ホプキンス大学によるものです。ノロウイルスは、下痢の原因として最も軽視されてきたものの一つであることが分かりました。我々のグループの調査では、下痢による小児の入院数および人口当たりの下痢発症数の両面において、ノロウイルスはコロナウイルスに次いで2番に多いことが判明しています。では、なぜこれまでノロウイルスは診断されてこなかったのでしょうか？その理由は、これがRNAウイルスであり、培養が不可能であるため、診断には特殊な分子生物学的手法が必要となるからです。我々が用いる手法がRT-PCRであり、ここではノロウイルスの診断にRT-PCRをどのように使用するかを実演します。院内Ciag GUINE法（Boomら、1989年）：糞便検体からウイルスRNAを抽出するために、院内G guine ATE法を用いました。この手法は、市販のca amp viral RNA kitに代わる手法です。どちらの手法も、シリカ粒子の核酸結合特性に基づいています。G Guad Dium Bio NAの抗ヌクレアーゼ特性と組み合わせることで、RNA抽出用のシリカ懸濁液を調製します。シリカ粒子を調製するために、30 gramsの二酸化ケイ素を量り取り、250 millimeterの脱イオン水を加え、振とうしてケイ素を懸濁させます。24時間の沈殿後、上澄み液215 millilitersを除去し、250 millilitersの脱イオン水を吸引により分注し、再度振とうしてケイ素を懸濁させます。さらに24時間後、上澄み液を吸引により除去し、塩酸を用いてシリカ懸濁液のpHをpH 2.0に調整します。シリカ懸濁液をガラス瓶に入れ、オートクレーブで抽出します。次に、前段階で調製したシリカ粒子を用いたウイルスRNAの抽出について説明します。使用時まで-70 °Cで保存してください。10%糞便懸濁液を作成するには、抽出前に約0.1 gの便を採取し、1 mLのPBSで定量を完了させます。下層のサンプルを5秒間ボルテックスし、次に4,000 RPMで10分間遠心分離します。各反応において、陽性コントロールとしてニューロウイルス陽性の糞便サンプルを、またマイクロ遠心チューブに入ったDEPC処理水を準備します。L6バッファー 1 mL、調製したシリカ粒子 20 µL、および糞便抽出液 200 µLを混合します。短時間ボルテックスし、サンプルを室温で15分間放置します。15秒間遠心分離します。その後、ペレットをbuffer L twoで2回洗浄し、続いて70% ethanolで2回、さらにacid onで1回洗浄します。ペレットをドライヒートブロックを用いて56 °Cで5分間乾燥させます。50 µLのRNAフリー蒸留水を加えることで、シリカペレット中のRNAを再懸濁します。1 µLのRNA sinを加え、ボルテックスで混合した後、56 °Cで15分間静置します。最大速度で3分間遠心分離し、RNAを含む上清を回収します。ノンDROP法を用いてサンプルを定量し、抽出したRNAを-70°Cで保存します。ウイルスRNAの抽出には市販の抽出キットを使用してください。市販のkay amp viral RNAキットを用いた糞便からのRNA抽出について実演します。本キットには、シリカゲルMinPinカラム、バッファーA-V-L-A-W、W1、W2、A VE、およびキャリアRNAが含まれています。簡潔に、手順は以下の通りです。バッファーA VLの一部をキャリアRNAと混ぜ合わせ、ボルテックス処理します。この溶液を、114 µLの糞便懸濁液が入った1.5 mLチューブに分注し、ボルテックスで混合します。室温で15分間インキュベートします。その後、サンプルをパルス遠心分離します。サンプルにエタノールを加え、ボルテックスミキサーで15秒間混合します。その後、軽く遠心分離し、溶液を2 mLコレクションチューブにセットしたスピンカラムに分注します。遠心分離を行います。次に、スピンカラムを新しい回収チューブに移します。キャリアRNAを含まないバッファーAW1を用いて、結合したRNAとともにカラムを洗浄し、遠心分離します。カラムを清潔な2 mL回収チューブに移し、バッファーでカラムを洗浄します。W2遠心機を用いて最高速度で遠心分離を行い、ピンカラムを清潔な1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ、最高速度で遠心します。バッファーA VEを用いてRNAを溶出し、ウイルスRNAは使用まで-70 °Cで保存します。抽出したRNA中のノロウイルスの検出は、特異的なTaqManプローブを用いた1ステップリアルタイムPCRにより行います。ジェノグループ1およびジェノグループ2用のマスターミックスを作製します。アッセイ中は、酵素RTミックスを氷上で保持してください。キットには、PCR水、マスターミックス2×、およびジェノグループ用のプライマーとプローブが含まれています。Group one用プライマーとプローブをDina Group twoに加えました。最後に、酵素RT mixを使用前にボルテックスし、PCR水とマスターミックス、2XプライマーのCOG G1フォワードおよびリバース、そしてUniGroup用のプローブ ring one Aおよびone Bを混合しました。Group oneマスターミックスとCOG G2のプライマー、VAリバース、およびプローブを加えました。2番目のチューブにTheo Group 2マスターミックスを入れます。最後に、両方のINOグループマスターミックスに酵素artixを加えます。ボルテックスし、適切なマスターミックス10 µLを反応ウェルに分注します。別のキャビネットで、未希釈のRNA 5 µL、G1およびG2陽性コントロールRNA各5 µL、ならびに陰性コントロール5 µLを、対応する反応ホイールに加えます。6,000 gで10秒間遠心分離します。ステップ1のソフトウェアに詳細設定が表示されます。そして、実験プロパティ画面において、実験はnorovirusとして特定されます。ターゲット画面では、実験タイプを「presence or absence」に設定します。PCR反応プレートで検出したいターゲットの名前を入力してください。Ginaで、グループ1および2のリポーターファミリーとクエンチャーTamaraをサンプルおよびレプリケート画面で設定します。反応プレートに含まれるサンプル数および陽性・陰性コントロール数を入力し、ランメソッドでセットアップするサンプルまたはターゲット方向を選択します。まず、相補的DNAを合成するために、50 °Cで逆転写を行います。次に、ホットスタートポリメラーゼを活性化させるため、温度を95 °Cまで上げます。95 °Cでの加熱を起点としてサイクリングを開始し、続いて60 °Cでアニーリングと増幅を同時に行います。このサイクリングを4〜5回繰り返し、プレートのセットアップに戻ります。テンプレートを保存し、実験を保存して、「Start Run」をクリックします。増幅プロット画面では、機器がラン中にデータを収集するに従って、サンプルの増幅およびプロットのコントラストを確認できます。正規化されたダイブ蛍光とサイクル数。PCRの初期サイクルでは、蛍光信号にほとんど変化は見られません。これがベースラインを定義します。ベースラインからの蛍光強度の増加は、蓄積された標的の検出を示しています。ベースライン付近に固定の蛍光しきい値を設定する必要があります。CT値（しきい値サイクル）というパラメータは、蛍光強度がこの固定しきい値を超える時点の小数を含むサイクル数として定義されます。増幅プロット画面は、陰性コントロールウェルにおける蛍光の上昇や、期待されるサイクルでの検出可能な蛍光の欠如といった、異常な増幅を特定し検討するために有用です。キットを用いた手法は信頼性は高いものの、膨大な時間とリソースを必要とします。本研究では、同様に信頼性が高く、費用対効果に優れ、国内で容易に入手可能な試薬を用いることで海外からの購入材料への依存を回避できる手法を提示しました。これにより、最終的に、小児における胃腸炎の最も一般的なウイルス原因のより容易な診断と迅速な治療につながります。これは、同等の結果が得られた経済的な院内核酸抽出法を用いることで達成されました。Kerogen社の市販キットおよび、当研究室で開発したTAC MAN、R-T-P-C-Rを用いて得られました。これにより、広範囲のニューロウイルス感染を検出することが可能です。本アッセイは、増幅後の産物処理が不要なため、検査時間を短縮でき、日常的な診断において有用であることが証明されています。本プロトコルは、診断以外にもノロウイルスの感染疫学を解明するために利用でき、したがって本疾患の公衆衛生上の管理に有用です。

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Medicine

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便定量ポリメラーゼ連鎖反応解析による ヘリコバクター・ピロリ 菌感染と抗生物質耐性の検出

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定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

学ぶTaqManワンステップRT-PCR法によるノロウイルスの検出とゲノグループ分類。小児便検体からウイルスRNAを抽出し、高感度・高特異性で診断するコスト効率の良い手法を確立し、臨床および疫学研究に有用です。

のTaqManワンステップRT-PCR法によるキッズスツールからノロウイルスの検出とGenogrouping

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