Name: ナイフエッジスキャン顕微鏡用試料作製、イメージング、および解析プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶナイフエッジスキャン顕微鏡（KESM）によるマウス脳の試料作製、イメージング、およびデータ解析の手法。神経回路網と血管構造をサブミクロン分解能で可視化し、コネクトミクス研究に応用できます。

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このプロジェクトは、NIH / NINDS（＃1R01 - NS54252）、NSF（＃0905041、＃0079874）、テキサス先端技術プログラム（＃ATP - 000512〜0146 - 2001＃ATP - 000512〜0261 - 2001）、テキサス州で賄われていた＆M研究財団、テキサスA＆M大学のコンピュータ科学と工学科、および3Scan。我々は、技術相談やKESMイン​​ストルメンテーションのサポートのためのバーナードメサ（マイクロスターテクノロジーズ）に感謝いたします。 KESMの設計と実装の主要部分は2007年に亡くなったブルースH.マコーミック、によって行われた。

1。試料の準備：ゴルジ - コックス<ol><li>このプロトコルは、密接にMayerichらのプロトコルに従います。7。 </li><li> C57BL/6Jマウスは、イソフルラン吸入麻酔を使用して、深く麻酔し、断頭。 </li><li>脳は、ゴルジ - コックスの固定液（1％クロム酸カリウム、1％重クロム酸カリウム、及び脱イオン水の1％塩化第二水銀）に削除され、配置されます。 </li><li>脳は10〜16週間、室温で、暗所でゴルジ - コックスのソリューションに残されている。 </li><li>脳は、暗所で一晩脱イオン水で洗浄されています。 </li><li>リンスの脳は、室温で暗所で7〜10日間脱イオン水で5％水酸化アンモニウム溶液中に浸漬される。この長い準備時間は、黒い沈殿物が完全に組織に形成するチャンスがあったように、脳全体の浸透性を確保することでした。 </li><li>脳は4時間とt室温で脱イオン水で再び洗浄する室温で50％、70％、冷蔵庫（4℃）で、85％、95％（3の変更）、および100％（4〜5変更）：段階的なエチルアルコール、一連の脱水鶏。脳は、24時間ごとに溶液中に残っている。 </li><li>脱水の脳は、1:2のアラルダイトからアセトンの比率、1:1、2:1、そして最終的ににあるアラルダイト - アセトン混合物、続いて（3〜4の変化、一日ごとに）アセトンに入れられ冷蔵庫に100％アラルダイト（3の変更、一晩たびに）、（4℃）。 </li><li>最後に、処理された脳は、100％アラルダイトに包埋し、℃で3日間（アボットとソテロ2で参照されたい埋め込 ​​みプロトコル）を60に加熱される。 標本はLRホワイトに埋め込まれている場合、検体は重合前に標準的な手順である各一晩冷蔵庫に保管されているLRホワイトソリューションの3つの変化を通じて、最後の100％エタノール溶液から転送されます。 3つの変更が完全に浸透を確保するために行われている。試料はtです。60密閉容器で重合される新鮮なLRホワイトに転送鶏°適切な重合のための時間と温度の必要量である24時間C、。 </li><li>図。 1は、アラルダイトに埋め込まれているゴルジ - コックス染色した脳を示しています。 </li><li>硬化試料ブロックは、エポキシ樹脂を用いて金属試料のリングに搭載されており、ブロックの側面は、（図2参照）、必要に応じてトリミングされます。 </li></ol> 2。試料の準備：ニッスル<ol><li>マウスは、ケタミンとキシラジン（1.7mgをケタミン/ 20グラムの体重当たり0.26ミリグラムのキシラジン）腹腔内投与を使用して、深く麻酔ですし、transcardially部屋の250mLのに続いて、室温の液（pH7.4）リン酸緩衝生理食塩水50mLを用いて灌流中立温度10％液（pH7.4）緩衝ホルマリン。そして最終的に希釈していないインドのインク3.0 CCと。 </li><li>生理食塩水と固定液で全身の血流は、心臓血管系から血液をクリアするとtiを修正する必要がある ssues。墨汁灌流は完全に心臓血管系の血管系を埋めるために必要です。 </li><li>その結果、脳は、傾斜エチルアルコール（25％-100％）の一連の後、脱水して、上記1.8から1.9のプロトコールに従って、アラルダイトプラスチックに埋め込まれています。 LR白埋め込むメディアの場合、上記の1.10プロトコルが続いている。 </li></ol> 4。試料の調製：一般種、一般的な臓器<ol><li>一般的なケースの場合、固定のいずれか10％中性緩衝ホルマリンあるいは4％パラホルムアルデヒドで行うことができます。 </li><li>小さな組織のボリュームの場合、代わりに血流の拡散は固定と染色をお勧めします。小さな生物や臓器の場合には、また、染色は、脱水工程中に行うことができます。 </li><li>ソリューションの浸透のための時間が全体のマウスの脳よりもはるかに小さい臓器または生物のために削減できるものの、埋め込みプロトコルでは、上記と同じです。 </li></ol>jove_title"&gt; 5。KESMのセットアップおよびイメージング<ol><li>舞台をオンに、ポンプの電源を切り、カメラをオンにする、照明をオンにします。 </li><li>ナイフと客観を上げる。 </li><li>試料のリングを取り付けます。 </li><li>測定試料の寸法とKESMステージコントローラ2アプリケーションの構成ファイルを作成します。 </li><li> KESMステージコントローラ2を起動し、ステージを初期化する。 </li><li>下のナイフ/客観、ポンプの電源を入れます。 </li><li>光学電車の中で焦点調節ノブを回すと、ナイフエッジに相対カメラの視野を調整することによって、客観的とカメラのピントを合わせる。 </li><li>イメージングを開始するには[戻る]を押してください。 </li><li>図を参照してください。 3-8。技術的な詳細については、9、7を参照してください。 </li></ol> 6。画像の処理とデータの準備<ol><li>設定ファイルのフォルダ（00000、00001、等）の下でデータのフォルダにKESMスタックプロセッサの実行ファイルをコピーします。 </li><li>照明のアーティファクトを削除し、すべてのバックグラウンド強度を正規化するKESMスタックプロセッサを実行するイメージ。すべてのデータのサブフォルダに対して手順を繰り返します。 </li><li> KESMの脳アトラスのWebサーバに設定し、アップロードとファイルの設定データからマルチスケールのタイルを準備します。 </li><li>図を参照してください。 9。 </li></ol> 7。データの可視化と解析<ol><li> KESMブレインアトラスを用いて可視化。に移動し<a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a>と適切なアトラスを選択してください。 <ol><li> Googleマップのようにナビゲートします。 </li><li> Googleマップのように拡大および縮小。 </li><li> [ - ] zの深さを増加または減少させる別の深さに移動するには、どちらかの[+]またはをクリックし、プルダウンメニューから、各ステップでどのように深く関わって選択し、。 </li><li>プルダウンメニューを使用してオーバーレイの数を調整します。 </li><li>プルダウンメニューを使用してオーバーレイの間隔を調整します。 </li><li>図を参照してください。 11。 </li></ol></li><li> MeVisLabを使用して可視化。 <ol><li> MeVisLabを起動します。 </li><li>新しいプロジェクトを作成します。 </li><li>以下では、新しいモジュールはTYによって作成することができますコマンドボックスにモジュール名でping。 </li><li>モジュールを作成する[Compose3Dfrom2DFiles]、および目的のフォルダへ移動。ファイルの文字列を入力し、[GetFileList]をクリックします。選択した画像がメモリに収まることを確認してください。 [Create3D]ボリュームを作成する]をクリックします。 </li><li>モジュール[SetWorldMatrix]、および"スケール"を設定の作成の下に適切なボクセルのサイズ（0.6、0.7、10X 0.45NA目標は1.0）にX、Y、Zを"小学校の変換"。リンク[Compose3Dfrom2DFiles]へ[SetWorldMatrix]。 </li><li>マトリックスを設定し、"進む"、"無視"、"無視"に"マトリックス組成"の下に変換します。 </li><li>モジュール[Arithmetic1]を作成し、"（マックス- IMG）反転"に"関数"を設定。 リンク[SetWorldMatrix]へ[Arithmetic1]。 </li><li>モジュールを作成する[View3D]と[Arithmetic1]を接続します。 </li><li> View3Dでは、マウスの右ボタンを押している間、しきい値を調整するためにマウスを動かす。あなたは、地域、変化の方向（マウスの左ボタンを押している間、マウスを動かす）、変更照明（ボリュームrenderinを切り抜くことができますなど、背景をgまたはMIP）をオン/オフ</li><li>図を参照してください。 10。 </li></ol></li></ol> 8。代表的な結果： ここで、我々は、全脳データと詳細を提示する。イチジク。 12月15日ショー全脳インドインク、ゴルジ体、およびニッスルデータは1、4、3を設定します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1、固定染色し、そして埋め込 ​​まれたマウスの脳<img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2組み込み、マウスの脳標本は、標本のリングに取り付け。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。ナイフエッジスキャン顕微鏡（KESM）。 KESMの写真は、その主要なコンポーネントがマークで示されています：（1）高速ラインスキャンカメラ、（2）顕微鏡対物、（3）ダイヤモンドナイフのアセンブリと光のコリメータを、（4）SPEcimenタンク（水浸イメージングのための）、（5）三軸の精度エアベアリングステージ、（6）白色光顕微鏡の照明、組織切片の除去のための（7）水ポンプ（バックで）、（8）ステージ制御と画像取得のためのPCサーバ、（9）花崗岩のベース、および（10）花崗岩の橋。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。KESMのイメージングの原理。 KESMの操作のプリンシパルが示されている。目標とナイフは（広い5ミリメートル試料は20nmと1-5の移動速度の分解能での位置決めステージの移動（実線矢印）に貼付しながら、所定位置に保持される、とダイヤモンドナイフに対してこすりれる10Xの目的のために）、ナイフ（実線矢印）上を流れる薄セクションを生成する。ラインスキャン画像は、ナイフの非常に先端付近で行われます。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。KESMカメラと客観的な焦点をコントロール。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6。KESMナイフのアセンブリとコントロール。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図7"> 図7。初期観測ポートを介して焦点。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図8"> 図8。KESMステージコン ​​トローラ2アプリケーション（スクリーンショット）。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図9"> 図9。KESMスタックプロセッサのアプリケーション（スクリーンショット）。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図10"> 図10。MeVisLabアプリケーション（スクリーンショット）。 <img alt="図11" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図11"> 図11 KESM脳アトラス：Webベースインターフェース（スクリーンショット）。 <img alt="図12" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図12"> 図12。KESM全脳水墨データ。 KESMのデータスタックの体積の可視化は、血管のデータセットとして使用されています。 （a）のクローズアップ、血管データの。幅〜100ミクロン。 （BD）全体のマウスの脳の血管系の3つの標準ビュー（高解像度のデータから間引き）。幅〜10mmの。 <img alt="図13" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図13"> 図13。KESM全脳マウスゴルジデータ。 <img alt="図14" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図14"> 図14。KESMゴルジデータの詳細。 <img alt="図15" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図15"> 図15。KESM全脳ニッスルデータ。 （A）クローズアップNのISSLデータ。 〜300 UM 3。全マウスの脳ニッスルのデータ（高解像度のデータからサブサンプリング）の（BD）3つの標準ビュー。断面には、内部構造の明確な見解のために示され。

<ol><li>Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbbott%2C+LC+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).</li>
<li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
<li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure%3A+Neurons+and+vasculatures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22%5BJournal%5D)">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22High-Throughput+Image+Reconstruction+and+Analysis%3A+Intelligent+Microscopy+Applications%22">High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications</a>. Ravi Rao, A., Cecchi, G. , Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).</li>
<li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li>
<li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li>
<li>McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).</li>
<li>Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+connectome%3A+A+structural+description+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li>
</ol>

トッドハフマンは3Scan、KESM技術（米国特許＃6744572）を製造販売する営利企業となります。

KESMは、生物学的試料の大量のサブミクロンレベルの調査（〜1 cm 3）とすることができます。ボリュームのこの種は、これらの器官の構造的な組織についての前例のない量的な情報を提供し、様々な機能の計算機モデルを有効にすることができますこのような脳、肺、心臓、腎臓、などの全体の小動物の器官は、そのような器官から画像をスキャン保持するのに十分です。回路とネットワークダイナミクス、電気的性質、流体と空気の流れのダイナミクス、および筋肉のダイナミクスを含めてこれらの器官の側面、。 この記事で説明する試料調製のプロトコルとポスト解析のプロトコルがKESMへ簡単にアクセスし、結果のデータを持っている外部の研究グループを支援することが期待されています。 KESM操作プロトコルは、これらの外部の研究者がこのユニークな画像診断法の利点と限界を理解するのに役立ちます。

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

ナイフエッジスキャン顕微鏡用試料作製、イメージング、および解析プロトコル

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

高スループット、高解像度、3D顕微鏡技術の大きな進歩は、サブミクロンの分解能で神経解剖学的、大量のデータの取得を有効にしている。全脳規模なデータを生成する最初のそのような楽器の一つは、ナイフエッジの走査型顕微鏡（KESM）7、5、9、開発し、著者らの研究室でホストされている。 KESMは、複雑な神経回路網の詳細（ゴルジ体）1、4、8、血管のネットワーク（墨汁）1、4、および細胞体の分布（ニッスル）3明らかに、セクションとサブミクロンの解像度で画像全体をマウスの脳に使用されています。 KESMの使用は、マウスでも脳に限定されるものではありません。私たちは正常にタコの脳6、マウスの肺、及びラットの脳を画像化している。我々は現在、全体のゼブラフィッシュの胚に取り組んでいます。微小循環および血行動態の研究に;これらのようなデータは大幅にconnectomics研究10に貢献できるとproviによる立体学の研究に鼎正確な地上真実。 この記事では、我々は試料作製（固定、染色、および埋め込み）を含むパイプライン、、KESMの設定とセットアップ、切片およびイメージングKESMと、画像処理、データの準備、およびデータの視覚化と分析を説明します。強調は、試料作製し、得られたKESMデータの可視化/分析になります。我々は、この記事で紹介する詳細なプロトコルがKESMとその利用率を高めるために、アクセスを広げるために期待しています。

脳標本の準備からデータの可視化と分析に、ナイフエッジの走査型顕微鏡を使用してシリアルのセクショニング画像への完全なプロセスが記載されている。この手法は、現在のマウスの脳のデータを取得するために使用されますが、それは他の臓器、他の種に適用可能です。

ハイスループット、高解像度の3D顕微鏡技術における大きな進歩により、...における大量の神経解剖学的データの取得が可能になりました。

本手順の全体的な目的は、ナイフエッジ走査顕微鏡（KESM）による切断およびイメージングのための生物学的試料の調製方法と、得られた画像スタックデータの可視化について実証することです。まず、組織を固定、染色し、包埋することで、KESMでのイメージングに向けた準備を行います。次に、KESMの設定を行い、自動制御ソフトウェアを用いて切断およびイメージングを実施します。得られた画像に対して、ノイズ除去、レジストレーション、およびクロッピングを行います。最終ステップとして、ウェブベースのアトラスおよび3D可視化ソフトウェアでデータセットを読み込み、解析します。これにより、最終的に、サブマイクロメートル解像度で全脳レベルの神経および血管組織を示す結果を得ることができます。連続ブロック面走査電子顕微鏡法などの既存のメソスケール解析手法に対する本手法の主な利点は、解像度は低くなるものの、より大きな体積をイメージングできる点にあります。この手法は、コネクトミクスおよび神経科学全般における重要な疑問の解決に寄与します。また、本手法は脳の構造的組織に関する知見を提供できるだけでなく、肺や腎臓などの他の臓器系にも適用可能です。この手順を開始するには、摘出したマウス脳をGolgi Cox溶液が入ったガラス瓶に入れます。ガラス瓶を遮光箱に入れ、室温で10〜16週間放置してください。Golgi Cox溶液が固定液として機能するため、別途固定ステップを行う必要はありません。10〜16週間後、翌日に脱イオン水で一晩暗所に浸して脳を洗浄し、その後、洗浄した脳を5%アンモニア水溶液（脱イオン水）に浸し、室温・暗所で7〜10日間放置します。7〜10日後、室温の脱イオン水でさらに4時間、脳を洗浄します。次に、段階的なエタノール系列を用いて脳を脱水します。50%エタノール、70%エタノール（4°C）、および85%エタノールの各溶液に、それぞれ24時間ずつ浸漬させます。室温で95%エタノールで3回、次いで100%エタノールで4〜5回の置換を行います。次に、脱水した脳をアセトンに入れ、1日につき3〜4回の置換を数日間行います。その後、aiteとアセトンの比率が1:2、1:1、および2:1の各aite・アセトン混合液に脳を浸し、それぞれ冷蔵庫で一晩保存します。最後に、脳を100% aiteに入れ、冷蔵庫内で一晩おきに3回溶液を交換します。処理した脳を100% aiteに埋め込み、60°Cで3日間加熱します。最後に、硬化した試料ブロックをエポキシ樹脂を用いて金属試料リングに固定し、この手順を開始するために必要に応じてブロックの側面をトリミングします。マウスが深く麻酔されており、足指へのピンチ刺激に反応しないことを確認します。次に、室温のリン酸緩衝生理食塩水を用いてマウスを経心房灌流し、続いて冷 4% リン酸緩衝パラホルムアルデヒドで灌流します。その後、脱イオン水に 0.1% thi および dye を溶解した溶液でマウスを灌流します。その後、死体を4 °Cの冷蔵庫に24時間置きます。24時間後、仔牛から脳を取り出し、新しい0.1% Thionine溶液に入れます。脳を4 °Cで7日間保持します。7日後、段階的なエタノール系列を用いて脳を固定し脱水します。6週間にわたる期間で、50% ethanolに3〜5日間、70% ethanolに7〜10日間、85% ethanolおよび95% ethanolにそれぞれ約2週間、そして残りの期間を100% ethanolで処理します。室温でアセトンを3回交換した後、60 °Cのオーブン内で脳を樹脂に包埋します。インディアインクを用いて血管ネットワークを染色する手順を開始するにあたり、足指の引込反射がないことを確認し、マウスが十分に麻酔されていることを確かめます。次に、室温のリン酸緩衝生理食塩水を用いてマウスを経心腔灌流させ、続いて室温の10%中性緩衝ホルマリンで灌流します。心血管系から血液を除去し、組織を固定するためには、生理食塩水と固定液による全身灌流が必要です。次に、3.0 ccsの希釈していないインディアインク灌流液でマウスを灌流します。心血管系の血管系を完全に満たすには、インディアインクが必要です。マウスから摘出した後、得られた脳を段階的なエチルアルコール系列で脱水し、その後、樹脂プラスチックに包埋します。前述のイメージング用KESMセットアッププロトコルに従い、カメラ、照明装置、およびステージの電源を入れ、ナイフと対物レンズを上げます。次に、試料リングを取り付けます。その後、対物レンズとナイフを下げます。検体の寸法を測定します。次に、KESMステージコントローラー用の構成ファイルを作成します。ステージを初期化する前に、KESMのナイフと対物レンズを上昇させてください。KESMステージコントローラー2を起動し、ステージを初期化します。次に、ナイフと対物レンズを下げ、ポンプの電源を入れます。光学系のフォーカスノブを回し、ナイフエッジに対するカメラの視野を調整して、対物レンズとカメラのピントを合わせます。ステップバイステップでクリックし、イメージングとセクショニングの最初の数ステップを確認します。次に「go」をクリックして、画像処理のためのイメージングとセクショニングを開始します。KESMスタックプロセッサを実行し、すべての画像からライティングアーティファクトを除去して背景強度を正規化します。すべてのデータサブフォルダに対してこれを繰り返します。KESM脳アトラスを用いてデータを可視化するには、このウェブサイトにアクセスし、適切なアトラスを選択して異なる深度へ移動してください。プルダウンメニューから各ステップでの深度を選択し、プラスボタンでZ深度を増やし、マイナスボタンで減少させます。その他のオプションとして、ズームインやKESM脳アトラスを使用したナビゲーションが可能です。また、プルダウンメニューでオーバーレイ数とオーバーレイ間隔を調整し、VIS labを用いてデータを可視化してください。アプリケーションを起動し、新しいプロジェクトを作成します。プロジェクトには、「compose 3D from 2D files」、「set world matrix arithmetic one」、および「view 3D connected」を含める必要があります。右マウスボタンを押しながら、「view 3D」に表示されている通りに適切なパラメータをこの順序で設定してください。マウスを移動させて、クロップ可能なしきい値領域を調整します。方向の変更、照明の変更、または背景のオン・オフの切り替えが可能です。代表的なKESMの結果を以下に示します。ビデオクリップの最初に表示されるのはKESMのボリューム可視化であり、血管データセットである脳全体のインドインクデータスタックで、幅約100 micronsの血管データのクローズアップから始まります。KESMのこの2番目のクリップでは、マウス全脳のインク注入データを用いて、幅約10ミリメートルの高解像度データからサブサンプリングした全脳血管系の3つの標準的な視覚提示を示しています。矢状面、冠状面、および水平面からの視点に加え、冠状断面のフライスルーを表示しています。また、このビデオクリップでは、KESMによるマウス全脳のゴルジ染色データが示されており、ブロックビューから始まり、続いて矢状面、冠状面、水平面の3つの異なる切断面に沿ったフライスルーが表示されています。次に、KESMマウス全脳GoGyデータの詳細を示します。最初のビデオクリップは小脳とプルキンエ細胞のものです。2番目のクリップでは、皮質と頂上辺縁細胞を示しています。最後に、KESMについてです。全脳nleデータがこれら2つのビデオクリップで示されています。まず最初に、NLEデータのクローズアップが表示されます。この2番目のクリップでは、高解像度データからサブサンプリングしたマウス全脳の標準的な3つのNleデータビューを示しています。また、内部構造を明確に確認するために断面図も表示しています。この手法の開発により、神経科学分野の研究者がマウス脳内の神経および血管ネットワークを探索することが可能になりました。このビデオを視聴することで、ナイフエッジ走査顕微鏡における試料調製、イメージング、およびデータ解析について十分に理解することができます。

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Research

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