ナイフエッジスキャン顕微鏡用試料作製、イメージング、および解析プロトコル

本手順の全体的な目的は、ナイフエッジ走査顕微鏡（KESM）による切断およびイメージングのための生物学的試料の調製方法と、得られた画像スタックデータの可視化について実証することです。まず、組織を固定、染色し、包埋することで、KESMでのイメージングに向けた準備を行います。次に、KESMの設定を行い、自動制御ソフトウェアを用いて切断およびイメージングを実施します。

得られた画像に対して、ノイズ除去、レジストレーション、およびクロッピングを行います。最終ステップとして、ウェブベースのアトラスおよび3D可視化ソフトウェアでデータセットを読み込み、解析します。これにより、最終的に、サブマイクロメートル解像度で全脳レベルの神経および血管組織を示す結果を得ることができます。

連続ブロック面走査電子顕微鏡法などの既存のメソスケール解析手法に対する本手法の主な利点は、解像度は低くなるものの、より大きな体積をイメージングできる点にあります。この手法は、コネクトミクスおよび神経科学全般における重要な疑問の解決に寄与します。また、本手法は脳の構造的組織に関する知見を提供できるだけでなく、肺や腎臓などの他の臓器系にも適用可能です。

この手順を開始するには、摘出したマウス脳をGolgi Cox溶液が入ったガラス瓶に入れます。ガラス瓶を遮光箱に入れ、室温で10〜16週間放置してください。Golgi Cox溶液が固定液として機能するため、別途固定ステップを行う必要はありません。

10〜16週間後、翌日に脱イオン水で一晩暗所に浸して脳を洗浄し、その後、洗浄した脳を5%アンモニア水溶液（脱イオン水）に浸し、室温・暗所で7〜10日間放置します。7〜10日後、室温の脱イオン水でさらに4時間、脳を洗浄します。次に、段階的なエタノール系列を用いて脳を脱水します。50%エタノール、70%エタノール（4°C）、および85%エタノールの各溶液に、それぞれ24時間ずつ浸漬させます。

室温で95%エタノールで3回、次いで100%エタノールで4〜5回の置換を行います。次に、脱水した脳をアセトンに入れ、1日につき3〜4回の置換を数日間行います。その後、aiteとアセトンの比率が1:2、1:1、および2:1の各aite・アセトン混合液に脳を浸し、それぞれ冷蔵庫で一晩保存します。

最後に、脳を100% aiteに入れ、冷蔵庫内で一晩おきに3回溶液を交換します。処理した脳を100% aiteに埋め込み、60°Cで3日間加熱します。最後に、硬化した試料ブロックをエポキシ樹脂を用いて金属試料リングに固定し、この手順を開始するために必要に応じてブロックの側面をトリミングします。

マウスが深く麻酔されており、足指へのピンチ刺激に反応しないことを確認します。次に、室温のリン酸緩衝生理食塩水を用いてマウスを経心房灌流し、続いて冷 4% リン酸緩衝パラホルムアルデヒドで灌流します。その後、脱イオン水に 0.1% thi および dye を溶解した溶液でマウスを灌流します。

その後、死体を4 °Cの冷蔵庫に24時間置きます。24時間後、仔牛から脳を取り出し、新しい0.1% Thionine溶液に入れます。脳を4 °Cで7日間保持します。

7日後、段階的なエタノール系列を用いて脳を固定し脱水します。6週間にわたる期間で、50% ethanolに3〜5日間、70% ethanolに7〜10日間、85% ethanolおよび95% ethanolにそれぞれ約2週間、そして残りの期間を100% ethanolで処理します。室温でアセトンを3回交換した後、60 °Cのオーブン内で脳を樹脂に包埋します。

インディアインクを用いて血管ネットワークを染色する手順を開始するにあたり、足指の引込反射がないことを確認し、マウスが十分に麻酔されていることを確かめます。次に、室温のリン酸緩衝生理食塩水を用いてマウスを経心腔灌流させ、続いて室温の10%中性緩衝ホルマリンで灌流します。心血管系から血液を除去し、組織を固定するためには、生理食塩水と固定液による全身灌流が必要です。

次に、3.0 ccsの希釈していないインディアインク灌流液でマウスを灌流します。心血管系の血管系を完全に満たすには、インディアインクが必要です。マウスから摘出した後、得られた脳を段階的なエチルアルコール系列で脱水し、その後、樹脂プラスチックに包埋します。

前述のイメージング用KESMセットアッププロトコルに従い、カメラ、照明装置、およびステージの電源を入れ、ナイフと対物レンズを上げます。次に、試料リングを取り付けます。その後、対物レンズとナイフを下げます。

検体の寸法を測定します。次に、KESMステージコントローラー用の構成ファイルを作成します。ステージを初期化する前に、KESMのナイフと対物レンズを上昇させてください。

KESMステージコントローラー2を起動し、ステージを初期化します。次に、ナイフと対物レンズを下げ、ポンプの電源を入れます。光学系のフォーカスノブを回し、ナイフエッジに対するカメラの視野を調整して、対物レンズとカメラのピントを合わせます。

ステップバイステップでクリックし、イメージングとセクショニングの最初の数ステップを確認します。次に「go」をクリックして、画像処理のためのイメージングとセクショニングを開始します。

KESMスタックプロセッサを実行し、すべての画像からライティングアーティファクトを除去して背景強度を正規化します。すべてのデータサブフォルダに対してこれを繰り返します。KESM脳アトラスを用いてデータを可視化するには、このウェブサイトにアクセスし、適切なアトラスを選択して異なる深度へ移動してください。

プルダウンメニューから各ステップでの深度を選択し、プラスボタンでZ深度を増やし、マイナスボタンで減少させます。その他のオプションとして、ズームインやKESM脳アトラスを使用したナビゲーションが可能です。また、プルダウンメニューでオーバーレイ数とオーバーレイ間隔を調整し、VIS labを用いてデータを可視化してください。

アプリケーションを起動し、新しいプロジェクトを作成します。プロジェクトには、「compose 3D from 2D files」、「set world matrix arithmetic one」、および「view 3D connected」を含める必要があります。右マウスボタンを押しながら、「view 3D」に表示されている通りに適切なパラメータをこの順序で設定してください。

マウスを移動させて、クロップ可能なしきい値領域を調整します。方向の変更、照明の変更、または背景のオン・オフの切り替えが可能です。代表的なKESMの結果を以下に示します。ビデオクリップの最初に表示されるのはKESMのボリューム可視化であり、血管データセットである脳全体のインドインクデータスタックで、幅約100 micronsの血管データのクローズアップから始まります。

KESMのこの2番目のクリップでは、マウス全脳のインク注入データを用いて、幅約10ミリメートルの高解像度データからサブサンプリングした全脳血管系の3つの標準的な視覚提示を示しています。矢状面、冠状面、および水平面からの視点に加え、冠状断面のフライスルーを表示しています。また、このビデオクリップでは、KESMによるマウス全脳のゴルジ染色データが示されており、ブロックビューから始まり、続いて矢状面、冠状面、水平面の3つの異なる切断面に沿ったフライスルーが表示されています。

次に、KESMマウス全脳GoGyデータの詳細を示します。最初のビデオクリップは小脳とプルキンエ細胞のものです。2番目のクリップでは、皮質と頂上辺縁細胞を示しています。

最後に、KESMについてです。全脳nleデータがこれら2つのビデオクリップで示されています。まず最初に、NLEデータのクローズアップが表示されます。

この2番目のクリップでは、高解像度データからサブサンプリングしたマウス全脳の標準的な3つのNleデータビューを示しています。また、内部構造を明確に確認するために断面図も表示しています。この手法の開発により、神経科学分野の研究者がマウス脳内の神経および血管ネットワークを探索することが可能になりました。

このビデオを視聴することで、ナイフエッジ走査顕微鏡における試料調製、イメージング、およびデータ解析について十分に理解することができます。