ラットにおける養子遅延型過敏症の誘導とモニタリング

私はクリスティーン・ビートンです。カリフォルニア大学アーバイン校の生理学・生物物理学部のジョージ・チェン研究室で助手研究員を務めています。これから数日間かけて、ルイスラットにおける適応的DTH（遅延型過敏反応）の誘導および測定の手順について解説します。

この手順には5日間かかります。ここでは、まず抗原特異的T細胞を活性化させ、その2日後に、それらをナイーブラットに初回投与する方法を説明します。さらに2日後、それらのT細胞が特異的に反応する抗原をラットの耳に投与してチャレンジを行います。そして1日後、それらのラットにおける炎症の程度を測定します。

組織培養に使用する血清を得るために、採血を行います。そのために心穿刺を実施します。左人差し指を太陽神経叢に置き、肋骨の間から針を心臓まで到達させ、可能な限り多くの血液を吸引します。

1回の採血で、日や効率によって異なりますが、1匹のラットから2〜10 mLの血液を得ることができます。培養に血清が必要な理由は、sygeneic（同系）であるLewisラット細胞を培養したいためです。したがって、ここではLewisラット血清を使用します。

次に、血液をチューブに移します。その際、組織培養に血清を使用するため、溶血を防ぐためにシリンジから針を外すよう注意します。心拍が停止し、ラットが死亡したため、これから胸腺を摘出します。

まず、組織培養に使用するため、毛が飛び散って臓器に混入しないよう、70% ethanolでスプレーします。また、解剖にはオートクレーブ滅菌済みの器具を使用します。そこで、まず皮膚を切り除きます。

皮膚を取り除いた後、心臓のすぐ上に位置する胸腺を傷つけないよう、胸郭の両側を慎重に切開します。胸腺は、心臓のすぐ上に位置する淡い、ほぼ白色の器官としてここに確認できます。その後、器官全体を取り出すようにして摘出しますが、後でクリーンベンチ内で精製するため、摘出時に完全にきれいに取り出すことに細心の注意を払う必要はありません。

そして、ペニシリンとストレプトマイシンを添加したPBSを含むチューブにそれを入れます。細菌の増殖を防ぐため、ここから細胞の単一細胞懸濁液を作成します。そのために、70 µmのセルストレーナーを使用します。

もちろん、すべて滅菌済みの器具を使用します。胸腺をシャーレに移します。ご覧の通り、あまりきれいではありません。

胸腺は白色の器官であり、その表面にはリンパ節や血栓が付着しています。そのため、これらを除去します。また、洗浄後の胸腺を回収できるよう、抗生物質を添加したPBSを約10 mL、セルスクリーナーに準備しておきます。

洗浄するため、胸腺からすべての汚染物質を単純に取り除きます。これで胸腺はほぼ完全に清潔になったので、ピンセットで胸腺を持ち上げ、セルストレーナーの上でハサミを用いて小さく切り分け、そのすべての断片をセルストレーナーの中に入れます。その後、もちろん滅菌済みの1 mLシリンジのプランジャーを使用し、胸腺の断片をセルストレーナーに押し出すことで、単一細胞懸濁液を作成します。

そして、単一細胞がセルストレーナーを通過し、外側のPBS中に入ります。これで細胞をセルストレーナーに通しましたが、PBSが透明ではなくなっているのがわかります。ここには単一細胞懸濁液が含まれており、これを氷上に保持してある50 mLチューブに移します。

次に、セルストレーナーにPBSを補充し、シリンジのプランジャーを押し出してチューブに転送する操作を数回繰り返し、チューブ内のPBSが30から40 mLになるまで行います。完了後のセルストレーナーはこのようになります。すべての細胞を回収したので、1200 RPMで約10分間遠心分離して細胞を沈殿させます。

こちらが遠心分離機から取り出した細胞です。ペレットはかなり大きく、これは上清を除去した直後であるため予想通りです。もちろん、ペレットはチューブの底に残っています。再懸濁をより容易にするため、ペレットがまだほぼ乾燥している状態で砕きます。

そして、PTが完全に分散し、再び単一細胞懸濁液に戻るまで、指でかなり強く叩きます。ここから、滅菌済みPBSで細胞を再懸濁します。タイマー1個につき5 mLのPBSを添加します。今回はタイマーが1個のみであるため、5 mLだけ添加します。

これが、灌流装置に導入する懸濁液です。灌流温度は30 °Cに設定し、細胞の生存を維持しつつも、数時間以内に死滅するようにします。これにより、細胞に抗原を処理させながら、培養系への汚染を防ぐことができます。

活性化させたいT細胞を確認すると、全く健康的ではないことがわかります。一部では死滅が始まっています。形態が不自然であり、正常な状態ではなくなっています。

これで、これらの細胞を活性化させる準備が整いました。実際、これらの細胞は待機時間を経て抗原を強く求めている状態です。一部の細胞は死滅し、溶液中に毒性化合物を放出するため、迅速に洗浄することが極めて重要です。

次に、PBS溶液を加えて、チューブの全量を50 mLにします。同時に、刺激待ちのT細胞を別の50 mLチューブに移します。これにより、両方のチューブを同時に遠心することができます。

こちらが先ほど採取した血液です。37°Cで10分間静置した後、氷上に置きました。ご覧の通り、完全に凝固しています。この血液から血清を回収する必要があります。

まず、滅菌済みのパステールピペットを用いて、チューブから凝血塊を剥がし、目的の血清を含む液体をすべて回収します。この際、凝血塊に捕捉されなかった一部の細胞も一緒に回収されます。この液体を別のチューブに移します。移送中に凝血塊の小さな破片が混入することがありますが、最終的に液体中の細胞を除去する必要があるため、大きな問題はありません。

液体が入った小型チューブを遠心分離します。これにより、細胞や混入している凝血塊を除去します。血球成分と血清を分離させるため、血液の液状部分のみを遠心分離します。2分間の遠心分離で十分です。

血清の遠心分離が完了しましたので、細胞から血清を取り出します。血清は本来黄色い色をしていますが、今回は赤みを帯びており、溶血が起きていることを示しているため、最適な例ではありません。完璧な状態ではありませんが、それでもろ過の手順を説明します。

0.2 micronのシリンジフィルターを使用して、血清をろ過し、滅菌状態であることを確認します。ただし、溶血が認められたため、このロットの血清は刺激に使用しません。以前の実験で凍結保存していたラット（Louis種）血清を使用します。

左側にT細胞、右側に抗原提示細胞のPTがあります。これから両方のチューブから上清を除去します。そして先ほどと同様に、指でタッピングしてペレットを崩し、細胞が再び単一細胞懸濁液に戻っていることを確認します。

これをT細胞と抗原提示細胞の両方の細胞セットに対して行います。その後、細胞を懸濁させ、細胞数をカウントします。次に、3 million個のT細胞と150 million個の抗原提示細胞を混合し、直径10 centimeterのペトリ皿に入れます。

総量 10 mL の血清チューブが2本あります。右側は今日調製したもので、溶血のため赤みを帯びていますが、左側は数日前に調製して冷凍保存していたチューブです。こちらは黄色く、溶血は見られず、格段に良好な状態です。

これが本日、組織培養に使用するものです。6つのペトリ皿を刺激するのに十分な細胞があるため、抗原提示細胞に30 mLの培地を、T細胞に同培地を30 mL加えます。次に、抗原提示細胞のチューブに、抗原であるbovine serum albuminを加えます。

ストック溶液の濃度は1 mg/mlであり、ペトリ皿内での最終濃度を10 µg/mlにしたいと考えています。また、T細胞にLouisラット血清を添加します。最終的にペトリ皿内で1%のラット血清になるように十分な量を加えます。

抗原提示細胞の懸濁液をホモジナイズし、その後、この細胞懸濁液を5 mLずつ各ペトリ皿に移します。抗原提示細胞の懸濁液を取り出す際、少量の脂肪や線維組織の塊が混在していることに気づくかと思いますが、これは至って正常です。

サイト調製を行う際は常に発生しますが、心配する必要はありません。取り除ける場合は除去し、そうでなければそのままペトリ皿に入れておきます。

細胞培養には全く影響しません。すべてのAPCをペトリ皿に移した後、T細胞を用いて同じ手順を繰り返します。したがって、各ペトリ皿に5 mLのT細胞懸濁液を加えます。

これで全ての細胞がペトリ皿に入りました。全てのT細胞が抗原提示細胞と接触する機会を得られるよう、非常に十分に混合することが重要です。そのため、ペトリ皿を重ねて、皿を動かしながら目に見えない「8の字」を描くようにして混合します。全ての細胞が十分に混ざり合うよう、この操作を数回繰り返します。

すべての混合が完了したら、これらのディッシュを37 °C、5%CO2の加湿条件下にあるインキュベーターに入れます。48時間インキュベートしたところ、培地の色がわずかに変化してよりオレンジ色になり、細胞が十分に活性化されました。

顕微鏡下で、すべてのペトリ皿を一つずつ確認します。非常に大きな細胞が活性化T細胞であり、非常に小さなものが死滅した抗原提示細胞です。T細胞が巨大化していることから、刺激が非常によくかかっていることがわかります。

そして、シャーレを少し動かしてみると、おっと、こちらの左側に、今は中央に見えますが、細胞が大きく凝集しているところがあり、これらが活発に分裂している細胞です。そこで、これからすべての細胞を遠心分離管に入れ、遠心分離して回収し、細胞数をカウントした後、ラットに10 million個を注入します。刺激が非常に良好であったため、1匹のラットに注入するのに、これらすべてのT細胞を必要とすることはありません。

そこで、2枚のペトリ皿の細胞のみを使用します。遠心分離を行い、1,000万個を注入し、残りの細胞は数日後に凍結保存するために培養します。

培養液は、T細胞増殖因子と馬血清を添加した通常のT細胞培養液を使用します。T細胞は非接着性であるため、特別な操作は必要ありません。ほとんどの細胞が培養液と共に回収されるようにします。

最後に、すべてのペトリ皿を新しい培地で洗浄し、すべての細胞を確実に回収します。刺激に使用したものと同じ培地を10 mL使用します。通常、1回目の培地回収時にT細胞はすでに回収できていると考えられますが、培地は依然としてペトリ皿に残っている場合があります。これは絶対に必要な工程ではありませんが、これらの細胞は非常に貴重であるため、一切失いたくないと考えています。

したがって、これらを遠心分離して沈殿させます。これにより、一部の死細胞が除去され、主に生存している細胞から開始できます。そして、新鮮な培地を添加します。

再度、1,500 RPMで約8分間遠心分離します。細胞をペレット化させるだけなので、ブレーキはかけたままにします。両方のチューブを慎重に確認すると、一方に小さなペレットが形成されているのが分かります。

これは2枚のペトリ皿からのものです。そして、こちらが4枚のペトリ皿からのペレットです。これらのペレットが非常に大きいのは、活性化T細胞だけでなく、抗原提示細胞も含まれているためです。

それでは、上清を除去します。注入に使用する細胞には、注入用の培地を1 mL加えます。また、別の細胞は、T細胞増殖因子と馬血清を含む100 mLの培地に懸濁させます。これで、注入に使用する細胞の準備が完了しました。

これらの細胞を、50 mLのプラスチックフラスコ2本に分注します。各フラスコに、骨髄由来のT細胞増殖因子を10%加え、さらに10%の熱不活化馬血清を加えます。

次に、必要量の大部分の培地を加えます。T細胞は過度なピペッティングを好まないため、上下に激しく混ぜ合わせることはしません。そのため、必要最低限の量だけをピペッティングし、そのまま加えて完了となります。これで準備が整いました。

インキュベーターに入れる準備ができました。毎日状態を確認します。おそらく24時間後に、そうでなければ40時間後、遅くとも48時間後には継代（分割）する必要があるでしょう。ですが、毎日確認することにします。

これらの細胞はT細胞成長因子において非常に速く増殖する傾向があります。そのため、少なくとも48時間ごと、おそらくはより短い間隔で継代する必要があります。また、培地の色の変化も確認します。

これで活性化され、完全に活性化した状態になりました。これがラットに注入するのに最適なタイミングです。そして2日後に、ラットの耳にチャレンジ投与を行います。

細胞が静止期に戻るまで数日間待つと、炎症部位へ迅速に遊走しなくなります。そのため、細胞を37 °C、5% CO2のインキュベーターに入れます。その後、25ゲージの針を用いてラットに注入します。細胞を腹腔内に注入したので、ラットをそのまま保持し、48時間後に耳にチャレンジ試験を行います。

数日前に、GFPで標識したアルブミン特異的T細胞をラットに注入しました。そして今日、同じラットの耳にチャレンジ試験を行います。右耳にアルブミンを注入します。

そして、左耳にはPBSを注入します。注入するvolinの用量は20 µgを20 µLに溶解したものです。また、使用するアルブミンは、Texas redでラベル化されたアルブミンとラベル化されていないアルブミンを1:1で混合したものを使用します。

こちらが注射の手順を実演する耳です。私は右利きですので、左手を使います。左手のグローブを外し、一本の指を耳の下に、もう一本を上に置いて皮膚を伸ばします。これにより、針の位置を正確に確認し、非常に薄い皮膚の2層の間に針を刺入することができます。

そのため、極めて細い針を挿入できるよう、27ゲージの針を使用します。方向を変えて見ると、Texas redがどこに入り、PBSがどこに入ったかが明確にわかります。さて、現在はチャレンジ投与から42時間が経過しましたので、バネ仕掛けのマイクロメーターを使用して耳の厚さを測定します。

そこで、アルブミンで感作させた右耳と、感作させていない左耳の両方を測定します。耳の厚さの差によって、炎症の強さを把握することができます。以上が、ラットで遅延型過敏反応（DTH）を誘導するための全手順となります。

これまで、抗原特異的T細胞をin vitroで活性化する方法、それらをラットに養子移入する方法、そしてそれらのラットに抗原刺激を与えて炎症の程度を測定する方法について説明しました。Chand研究室では、ラットの炎症におけるカリウムチャネル遮断薬の効果を検証するために、この手順を日常的に用いています。