心臓組織工学のためのフィブリンゲルにおける心筋細胞のカプセル化

この手順の全体的な目標は、心臓組織工学のために、新生児ラット心筋細胞をFIハイドロゲルにカプセル化することです。これは、最初に生後2〜3日の新生児ラットの子犬の心臓を分離することによって達成されます。次に、心臓をコラゲナーゼで消化します。

心臓細胞を細胞外マトリックスから分離するために、心臓細胞をフィブリンハイドロゲルにカプセル化します。最後に、コンストラクトを2週間培養します。最終的に、結果は、構造が電気刺激に応答して約1.3ミリニュートンの収縮力を生成する能力を持っていることを示しています。

さらに、コンストラクトの整列した構造は、筋細胞タンパク質からの組織学的染色を通じて観察できます。人工心筋コンストラクトは、傷跡組織を人工組織で修復または置換することにより、心筋梗塞の潜在的な治療法として役立ち、それによって損傷や病気後の心機能を改善します。これらのコンストラクトは、収縮力や正常および病態生理学的な心臓の発達に対するさまざまな刺激の影響を研究するための貴重なin vitroモデルシステムとして役立ちます。

各人のために中程度および滅菌手術器具を準備した後、フード、作業面に吸収性ベンチアンダーパッドを置き、滅菌ドレープで覆います。滅菌手術器具と4×4のガーゼパッドを滅菌ドレープに置きます。器具に触れずに、滅菌番号20のメスの刃を開き、ドレープの上に置きます。

子犬の首を切った後、ベタジンに浸したガーゼで胸を綿棒で拭きます。肩甲骨をつまんで子犬を固定します。部分開胸術を行って心臓を露出させ、肩甲骨に加えられる圧力を上げて、心臓を肋骨を越えて強制します。

肩甲骨解剖の場合は、メスの刃を心臓の後ろに走らせて大血管を切断し、臓器を切除します。PBSグルコースを含むシャーレに心臓を氷の上に置きます。心臓が分離されたら、氷冷したPBSグルコースですすいで、残留血液と結合組織を取り除きます。

各ハートの上部3分の1を取り除き、下部の3分の2が残るようにします。心室組織の大部分のみを分離し、組織を氷冷PBSグルコースを含む新鮮なペトリ皿に入れます。滅菌済みのマイクロハサミと鉗子を使用して、心臓を約1立方ミリメートルの小片に慎重に刻みます。

組織を50ミリリットルの円錐管に移し、10ミリリットルを除くすべてのバッファーを取り除きます。7ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を加えます。コラゲナーゼ組織混合物を摂氏37度で7分間振とうします。

ティッシュピースを砕くために静かに10回ピペットで動かします。ピースが落ち着くのを待ってから、液体を吸引して廃棄します。7ミリリットルのコラゲナーゼを組織片に加え、再度7分間消化します。

残りのステップごとに、ティッシュピースをバラバラにするために10回静かにピペットで動かします。それらが落ち着いたら、上清を引き出し、それを回収します 別の50ミリリットルの円錐管に、組織片に7ミリリットルのコラゲナーゼを加え、7分間再度消化します。各上清チューブに、消化からの上清を追加するたびに、異なる血清学的ピペットで10ミリリットルの停止溶液を追加します。.

フィブリンゲルコンストラクトのキャスティングの準備をするには、プロトコールの書面による部分を参照してください。以前に構築したマンドレルを6ccシリンジケーシングに入れます 3ccシリンジをプランジャーとして使用して、Oリングとテフロンワッシャーの間にしっかりとシールします。1ミリリットルのフィブリンゲルを作るには、112マイクロリットルのフィブリノーゲンストックを558マイクロリットルの20ミリモルヒープに追加して、円錐形のチューブにF溶液を作成します。

0.9%生理食塩水を別の円錐形チューブにバッファーします。135マイクロリットルのDMEMに17マイクロリットルのトロンビンストックと1.3マイクロリットルの2つの正常カルシウム溶液を追加してT溶液を作成します。3番目の円錐形のチューブで、細胞をスピンダウンし、1ミリリットルあたり2,940万個の細胞の濃度、またはコンストラクト内の細胞の所望の最終濃度の6倍の濃度まで再懸濁します。

一般に、この方法に不慣れな個人は、コンストラクトの製造ステップに苦労します。フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液を混合した後、フィブリンの重合が急速に起こります。したがって、個々の個人は、鋳型鋳造への注入時にヒドロゲルに気泡が混入するのを防ぎながら、均質な溶液を確保するために迅速に作業する必要があります。

フィブリンゲルコンストラクトをキャストする準備ができたら、18ゲージの1.5インチの針で1ミリリットルのシリンジを準備します。21ゲージの1インチ針も用意してください。1ミリリットルのフィブリンゲル溶液を作るには、667マイクロリットルのF溶液を50ミリリットルの遠心分離チューブに加え、続いて167マイクロリットルの細胞溶液を加えます。

そして最後に、167マイクロリットルのT溶液。気泡が入らないように、混合物を慎重にピペットで動かします。この時点で、反応が始まっており、コンストラクトの注入はすぐに行われるべきです。

シリンジと18ゲージの針を使用して、フィブリン溶液を吸い上げます。気泡が針に入らないように、シリンジを反転させないように注意してください。18ゲージの針を21ゲージの針に交換します。

シリンジを軽くたたいて、気泡を押し出します。次に、テフロンOリングの溝に続くストッパーケースの間にシリンジを金型に挿入し、溶液を金型に注入します。金型を傾けて、完全に充填されるようにします。

次に、残りの型を埋めます。型をパラフィルムで3個ずつ包み、インキュベーターまたはオーブンに摂氏37度で入れます。ゲルを20分間インキュベートして、フィブリンが完全に重合するのに十分な時間を確保します。

各培養ジャーに、コンストラクトごとに21ミリリットルの心筋コンストラクト培地を入れます。滅菌済みの3ccシリンジケーシングをプランジャーとして使用して、コンストラクト付きのマンドレルをDMEM付きの大きなペトリ皿に押し込みます。次に、コンストラクトをサンプルジャーに入れます。

瓶を摂氏37度で2週間インキュベートします。フィブリンコンストラクトクランプの分析を開始するには、ワニ口が刺激装置からのリード線を浴中の電極上のワイヤーにクリップします。データ収集ボード、パルス発生器、力変換器の電源を入れます。

力変換器を5G設定に設定し、ゼロにします。カスタムラボビュープログラムを開き、力変換器からのデータを表示および保存します。ピンセットを使用して各サンプルのデータフォルダに新しい空のテキストファイルを作成し、テフロンサポートからコンストラクトリングを静かにスライドさせ、力測定システムの固定金属ポストの上に置いて、マンドルサポートからコンストラクトを削除します。

ミディアムバス。ピンセットを使用して、力変換器のポストの周りにコンストラクトを押し上げます。コンストラクトのもう一方の端をトランスデューサーアームの上に置き、トランスデューサーが読み取るまで締めます。

心臓刺激装置に1.0Gの力がかかります。パルス電圧を 20 ボルト、持続時間を 6 ミリ秒、レートを 1 ヘルツに設定します。出力オンオフボタンを押して、電気ペーシングを開始します。

波形が規則的になるまで録音を開始します。MATLAB で波形を解析して、力の収縮速度と緩和速度を求めます。心筋細胞フィブリンコンストラクトは、最初は金型の全幅をカバーします。

2週間の培養後、最初の幅の約5分の1に縮小します。コンストラクトの電気的ペーシングは、ここに示すようにトゥイッチフォースデータを生成します。Twitchの戦力は約1.3ミリニュートンと予想されています。

コンストラクトの細胞生存率は、コンストラクトへの酸素の拡散制限により、細胞が培養培地と接触しているコンストラクトの表面からどれだけ離れているかに依存します。コンストラクトの表面では、共焦点顕微鏡を用いて高い細胞生存率が観察された。コンストラクトの整列した構造は、ミオシン重鎖を赤色のConnexion 43に染色することにより観察され、これは緑色で筋細胞間の細胞結合に必要です。

マスターすると、プロトコル全体は約5時間かかります。Iアイソレーション部分には約3時間かかります。コンストラクトの製造部分には約2時間かかりますが、この手順を試みる際には、フィブリンネットワークに気泡が取り込まれるのを防ぐために、針を常に下に向けておくことが重要です。

さらに、金型を傾けると、射出中に針穴が常に最高点に保たれ、金型鋳造がフィブリン溶液で完全に満たされることが保証されます。このビデオを見れば、まず新生児ラットから心筋細胞を単離し、次にフィブリン溶液を簡単に組み立てやすい円筒形の型に射出成形することで、心筋細胞をリング状のフィブリンハイドロゲルにカプセル化する方法を十分に理解できるはずです。