ビデオレートでスキャニング共焦点顕微鏡とMicroendoscopy

このビデオでは、標準的な既製コンポーネントを使用して、ビデオレート走査型共焦点顕微鏡を構築する方法を示します。走査型共焦点顕微鏡は、2つの走査型ミラーの協調的な動きに依存して、ラスター平面を横切るビームを平行移動させます。最初のミラーからの光は、最初のリレーレンズセットを横切って水平に走査され、2番目の走査型ミラーの静止点に焦点を合わせます。次に、同じスキャンモーションがスキャンレンズとチューブレンズを介して変換され、拡大した光ビームが対物レンズの背面開口部に配置されます。

2 番目のミラーは、最初のミラーに比べて動きが遅いため、Y 軸を同時にスキャンし、図示された平面の上下にスキャン アクションを行い、サンプル表面に長方形のラスターを作成します。市販の顕微鏡を購入するよりもこのプロトコルの主な利点は、低コストで、イメージングプロジェクトの特定のニーズに合わせて機器をカスタマイズできることです。レーザーを使用するときは、目の損傷を防ぐために適切な安全対策を講じることが重要です。

可能な限り、適切なレーザー保護メガネを着用してください。ビームの位置合わせやビームとの接触を積極的に行わない観客や研究者は、常に眼鏡を着用してください。光沢のある反射性の時計やジュエリーをすべて取り外します。

最も重要なことは、ビームブロックまたはマウントされた名刺を使用してビームの経路を終端することにより、常にビームを追跡し、制御するようにすることです。これは、ビームの経路を予測するのが難しい場合があるため、ミラーをライニングする際に特に重要です。また、ビームパスに対して目を水平にしないでください。

顕微鏡を組み立てる前にビームの平面を横切る必要がある場合は、レーザーをオフにしてください。光学ブレッドボードと90度ブラケット、すべてのミラー、レンズ、ダイクロイック、適切なクランプと取り付け金具、スキャンミラーとフォトディテクタの両方を含む、建設に必要なすべての機器が利用可能であることを確認してください。また、スキャンアクションをテストし、アライメント中にミラーを操作するための関数ジェネレータを手元に用意しておくと便利です。

また、安定性のためにブレッドボードをボルトで固定することを強くお勧めします。顕微鏡の構築を開始するには、ピグテールファイバーエータを光学マウントに配置し、このアセンブリを光学ブレッドボードの中央に配置します。これは、次に示すように、青色のビームの原点に対応します。

光源をオンにします。調整ネジを使用して、ビームが水平方向と垂直方向の両方で直線的に移動するようにビームを大まかに調整します。ファイバーコレーターの前にアイリスを配置します。

次に、ビームが中心を通過するようにアイリスの高さを調整します。次に、アイリスをビームパスに沿ってエータから離します。ビームの位置合わせを確認します。

必要に応じて、2 つの調整ネジを使用して、ビームをアイリスに再配置します。レーザービームをミラーの中央に配置して、取り付けられたDIICミラーをビームパスに配置します。ミラーホルダーを回転させてビームを約90度反射させ、ビームの高さが変わらないようにします。

cl マウントのネジを締めて、ミラーをテーブルに取り付けます。次に、取り付けられた共振ガルバンメトリックミラーをレーザービームパスに配置します。レーザービームが鏡面の正確な水平中心に配置されるように注意してください。

ミラーマウントを回転させて、レーザービームを90度の角度で反射させます。次に、ミラーからの反射を大まかに調整して、同じレーザービームの垂直高さを維持します。次に、虹彩を2つ取り、共鳴するギャルの真正面に置きます。

次に、共振ガルミラーから反射されたレーザー光線を基準として、以前と同様に垂直方向の高さを設定します。次に、光学ブレッドボードのネジ穴をアイクランプのガイドとして使用して、2つの虹彩を直線的に下ろします。パス内の最初のミラー (ビームを最初のアイリスの中心にするためのダイクロイック) を調整します。

次に、パス内の 2 番目のミラーを調整します。ビームを 2 番目の虹彩の中心に配置するための共鳴ガル。ビームが両方の虹彩を通して整列するまで、これら 2 つのミラーを繰り返し調整します。

共振ガルミラーから反射されたレーザービームが、おおよそのミラーの中心からまだ反射していることを確認します。ビームがずれている場合は、ファイバーコレーターマウントを調整し、ビームを両方の開いた虹彩の中心に揃えて調整を繰り返します。次のステップは、最初の固定テレセントリック平面を画像化する 2 つのリレーレンズを 2 番目の固定テレセントリック平面に配置することです。

この特定の顕微鏡では、最初のリレーで選択されたレンズの焦点距離Fが同じであるため、ここでの2つのミラー間の距離は単に4つのFです。このセットアップでは、Fは90ミリメートルに等しいため、4つのF位置は走査ミラーから360ミリメートル離れます。レンズがビーム経路の中央に正確に配置されるようにするには、最初のレンズをビーム経路に配置し、ビーム経路の次のアイリスにあるレーザービームスポットを確認します。レンズに続いて、ビームの垂直中心がアイリスの中心にくるようにレンズの高さを調整します。

次に、水平ビームの位置を調整して、ビームをアイリスの中央に配置します。このプロセスを2番目のレンズで繰り返します。次に、走査型ミラーを設置し、顕微鏡を回転させて、垂直に調整する必要がある部品の簡単な配置と位置合わせを容易にします。

2番目のテレセントリックプレーンの正確な位置を見つけるには、レゾナントガルOをスキャンユニットに接続して電源を入れます。名刺を使用して、2つのレンズを通るスキャンビームの経路をたどります。第2のテレセントリック平面は、常在のgal Oから約4Fに位置し、走査ビームが静止しているように見える位置として識別できる。

この場所の下のブレッドボードに鉛筆で印を付けます。テレセントリックプレーンが特定されたら、走査ミラー入力をゼロボルトに設定し、ミラー制御ハードウェアの電源を入れて、ミラーがニュートラル位置に落ち着くようにします。次に、標準のスキャンガリルミラーをテレプレーンの正確な位置に配置します。

テレプレーンのビームがスキャニングミラーの正確な中心に当たるようにミラーの位置を調整し、ミラーマウントを締めます。次に、ガルミラーを固定している固定ネジを緩めて回転させ、ビームが垂直に伝播していることを確認します。次に、レーザーとスキャン電子機器の電源を切ります。

ファイバーを切断し、スキャンミラーを切断します。次に、90度のブレッドボード取り付けブラケットを使用します。2 番目のブレッドボードを 1 番目のブレッドボードに固定します。

最後に、新しいブレッドボードが平らになるように顕微鏡全体を慎重に回転させ、クランプを使用して顕微鏡を所定の位置に固定します。ここでgal oとレーザーを再接続し、gal oをゼロボルトに戻すことを忘れないでください。以前は垂直にセットアップされていた残りの部分は、フラットブレッドボード上で簡単に実行できます。

次に、正式にはスキャンレンズと結像レンズと呼ばれるリレーレンズの2番目のセットを設定します。レンズの適切な組み合わせを選択するための非常に重要な情報については、添付の書面によるプロトコルを参照してください。レンズのセットアップから始めます。

まず、対物レンズにビームを向けるために必要なミラーを配置します。最初の大きな2インチミラーをブレッドボードの端の近くに置き、ミラーマウントを回転させてレーザービームを約90度反射させます。ミラーからの反射を調整して、同じ垂直ビームの高さを維持します。

次に、もう一方の2インチミラーをブレッドボードの反対側の端に配置してビームを90度の角度に向け、調整ネジを使用して所定の位置に固定します。次に、2つの虹彩を設定し、前と同じように2つのミラーを調整してビームを中央に配置します。次に、スキャンレンズをビームパスのガルからの焦点距離に配置し、水平位置と垂直位置を調整します。

レーザースポットを 2 つのミラー間の最初のアイリスの中央に配置します。大きな2インチのチューブレンズをスキャンレンズから適切な距離に慎重に配置し、ビームが最初のアイリスの中心に来るように水平と垂直の位置を調整します。このセットアップでは、結像レンズは75ミリメートルプラス300ミリメートルの距離に配置され、すべてのコンポーネントが所定の位置にあります。

gal Oを標準の電気機能発電機または制御回路の出力に取り付け、ピークツーピーク電圧を1〜3ボルトに設定します。次に、名刺を使用して2つのミラーのスキャンを開始します。レーザービームを、真空管レンズの300mm後にある静止面に配置します。

対物レンズをビーム経路に配置し、対物レンズの後部開口部をできるだけ静止面に近づけて配置します。サンプルステージをセットアップし、平行移動可能なZ軸マウントが対物レンズマウントに当たらないようにします。共焦点、ピンホール、検出器をセットアップするには、まずすべての電源と光ファイバーを切断します。

顕微鏡アセンブリを回転させて、再びブレッドボードに載せ、共振走査型ミラーを保持します。コリメータと標準スキャンミラー、電源ケーブル、電源ケーブル、および制御ケーブルにファイバーを再接続した後、ステージ上で前と同様に標準スキャンガルを駆動する制御電圧にゼロボルトを配置し、2つのカバースリップの間に明るい染料サンドイッチのサンプルを置きます。次に、レーザー光源をオンにして、染料に焦点を合わせます。

名刺を使用して、蛍光をできるだけ明るくするようにレーザー出力を調整します。サンプルから対物レンズを通ったスキャニングシステムを通じて、レーザービームを反射して蛍光発光を透過するダイクロイックミラーまでの蛍光発光を追跡します。この蛍光シグナルは、ダイクロイックミラーの反対側で見つけます。

次に、部屋の照明を暗くします。ダイクロイックミラーの後ろにミラーを配置して、放射を90度の角度で反射します。次に、ミラー付きのアイリスを使用して、蛍光ビームをブレッドボードに対してできるだけまっすぐかつ平行に向けます。

次に、共焦点ピンホールユニットは、Thor Labsの空間フィルターケージマウントアセンブリを使用してセットアップされます。次の図は、セットアップの概要を示しています。走査ミラーは、静止対物レンズを持つテレの静止平面に座っています。

静止面間のレンズの後方開口面ペアは、スキャンされたビームを中継する役割を果たします。最初のレンズペアには、1対1の望遠鏡を形成する等しい焦点レンズがあります。正式にはスキャンレンズと結像レンズとして知られる2番目のレンズのペアは、焦点距離が等しく、焦点距離である必要はなく、対物レンズの後部絞りが過剰に満たされるようにするためのビーム拡大望遠鏡として機能することがよくあります。

サンプルから放出された光は、スキャンシステムを通過し、ダイクロイックミラーを通過します。短焦点レンズまたは対物レンズは、共焦点ピンホールを介して発光光を集束させ、レンズによって照合します。最終的なレンズは、共焦点フィルタリングされた発光を光電子増倍管に集束させます。

空間フィルターユニットを発光ビーム経路に沿って配置し、最初の集光レンズマウントを発光ビームの中央に配置するようにします。この例では、ピンホールサイズが100ミクロンの空間フィルターユニットが選択されました。次に、短焦点レンズをユニットに取り付け、ピンホール表面に明確な焦点が観察されるまでZトランスレーションマウントをスライドさせます。

ユニット全体が蛍光ビームによって設定された直線に沿って向けられていることを確認してください。clamp ユニットをブレッドボードに取り付けます。次に、トランスレーションステージの調整ノブを使用して、2つの軸を調整し、ピンホールマウント表面で2D検索を実行し、ピンホールを通過する蛍光信号が最大化されるポイントを見つけます。

次に、コーティングレンズをケージマウントに載せます 名刺を使ってピンホールをあげた後、共焦点ユニットを通過する蛍光イオンを見つけ、放出された蛍光ができるだけ一致するまでコーティングレンズをポストに沿ってスライドさせます。フォトマルチプライフィルムチューブアセンブリをセットアップします。焦点距離50mmのレンズを蛍光発光ビームの経路に置き、その焦点を見つけます。

ブレッドボード上のこの位置をマークします。次に、レーザーを完全にオフにし、光増倍管を、そのウィンドウがマークされた焦点にできるだけ近づくように配置します。次に、調整可能なレンズチューブを使用して、アセンブリをフォーカシングレンズに接続します。

ピンホールをたどる露出したすべてのビームパスに暗いテープを巻き付け、レーザーをオンにして、出力を極端に低く保ちます。光電子増倍管の電源を入れ、オシロスコープでその電圧を注意深く読み出します。レーザー強度が増加すると、読み出しやDCオフセットのようなスパイクがオシロスコープの画面に表示されるまで電圧を上げます。

この信号が実際に蛍光から発生していることを確認するには、レーザーの電源をオフにするか、ビーム経路を遮断して信号の損失を観察します。最後に、オシロスコープで最大の信号が得られるようにピンホールを繰り返し位置合わせします。最初にフォーカシングレンズのZ位置を操作し、次にYZトランスレーションステージを調整することで、ビデオレート顕微鏡ハードウェアが完成します。

まず、フォトマルチプライヤーチューブをオフにします。次に、付属の書面によるプロトコルに示されているように、ミラー、カスタムコントロールボード、およびコンピューターを接続します。このシステムは、共焦点走査型マイクロ内視鏡検査の実施に適合させることができます。

ステージをファイバー保持ステージに交換する場合は、付属のテキストまたは詳細をご覧ください。完成した直立共焦点走査型顕微鏡とマイクロ内視鏡は、ここに示すように表示されます。レーザービームと放射ビームは、目安として引き出されています。

マイクロ内視鏡検査では、ファイバーマウントが画像ファイバーを所定の位置に保持し、実験を行います。このファイバーマウントは、XYステージと簡単に交換して使用できます。ここに示す直立顕微鏡プラットフォームは、ビデオレートフレームグラバーカードを使用して白い名刺に印刷された小文字のMを撮影し、入力信号から画像を生成するための代表的なテスト画像です。漂白。

白い紙には、紫外線や青色光によって容易に励起される蛍光力が含まれており、暗闇の後ろに明るい背景をもたらします。この蛍光発光を収集するために、Letter Mと515ナノメートルを中心とする発光フィルターが選択されました。画像のわずかな歪みは、特に画像フレームの横方向のエッジ付近で観察できます。

この歪みは、8キロヘルツのgvoミラーの正弦波スキャンパターンに起因し、添付のドキュメントで詳細に説明されています。この動画は、名刺をスキャンして取得した動画レートデータの例を示しています。このビデオを見れば、ビデオレート共焦点走査型顕微鏡の作り方と位置合わせの方法を十分に理解できるはずです。

レーザー光線での作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、反射するジュエリーをすべて取り外すだけでなく、目をビームラインと同じ高さにして作業しないようにするなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。