Name: ビデオレートでスキャニング共焦点顕微鏡とMicroendoscopy (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: 学ぶ ビデオレート走査共焦点顕微鏡の構築方法。標準部品を用いて低コストでカスタマイズ可能なシステムを組み立て、神経科学や生体物理学の動的イメージング研究に応用できます。

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著者らは、このプロジェクトを支援するためThorLabsに感謝します。 AJNはNSF大学院奨学金の支援を承認することを希望。 この研究の一部はNIHのディレクターの新イノベーター賞プログラムを通じて国立衛生研究所、OD007096 - 01 DP2助成金番号1によって賄われていた。新イノベーター賞プログラムに関する情報がでています<a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a> 。著者はハーバードエレクトロニクス研究室の使用のためにトムヘイズに感謝します。

<ol><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. , Springer Verlag. 985-985 (2006).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+photobleaching+analysis+for+the+study+of+cellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics.</a> European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).</li>
<li>Stephens, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Microscopy+Techniques+for+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging.</a> Science. 300, 82-86 (2003).</li>
<li>McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Analyses+of+Drosophila+Gastrulation+Provide+Insights+into+Collective+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration.</a> Science. 322, 1546-1550 (2008).</li>
<li>Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dishevelled+controls+cell+polarity+during+Xenopus+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation.</a> Nature. 405, 81-85 (2000).</li>
<li>Laemmel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibered+Confocal+Fluorescence+Microscopy+%28Cell-viZio%29+Facilitates+Extended+Imaging+in+the+Field+of+Microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation.</a> Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).</li>
<li>Moussata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+confocal+laser+endomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Endoscopica%22%5BJournal%5D)">The confocal laser endomicroscopy.</a> Acta Endoscopica. 39, 448-451 (2010).</li>
<li>Dunbar, K., Canto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+endomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Confocal endomicroscopy.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 631-637 (2008).</li>
<li>Udovich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+optics%22%5BJournal%5D)">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).</li>
</ol>

このビデオこのビデオの制作はThorlabs、Inc。によって後援されて

このビデオレートでの撮像システムは、約8 kHzで動作する共振ガルバノミラーを利用しています。フルパワーで実行すると共振ミラーは非常に大きいです、そしてその高いピッチは十分な露光時間で厄介な、あるいは危険なことができます。ここに示されていないが、それが大幅にシステムボリュームおよび/またはそのような耳栓のような適切な聴力保護具を着用することを減らすために透明なケース内の共振ガルバノミラーを保護することをお勧めします。 共振ガルバノミラーは、正弦波パターンでスキャンします。しかし、フレームグラバカードは、両方の水平および垂直方向に完全にリニア掃引速度を仮定して信号を読み込む。正弦波スイープは、スキャンの端で速度が低下するので、画像圧縮アーチファクトは、高速（水平）画像の軸に沿って観察することができます。この問題を最小限にする一つの方法は、意図的に共振ガルバノミラーの走査範囲を駆動するよりもはるかに大きいです。リレーレンズの直径。こうすることで、正弦波走査パターンののみ、ほぼ直線の中央スイープは、画像の歪みを最小限に抑え、サンプルを通過します。もう一つのアプローチは、高速軸を線形化するポストプロセス、収集画像になります。これは、イメージングで公知の蛍光パターンを（gridなど）で実現し、収集した画像をunwarps処理のスクリプトを作成するには、既知のパターンの寸法を使用することができます。 この特定のスキャンシステムは、多くの場合、直立型ビデオレートでの顕微鏡を必要とするin vivoイメージング、 内の目的のために設計されました。細胞イメージング実験のために、倒立顕微鏡は、より一般的に使用されています。ここで紹介する設計は、簡単にそのような倒立顕微鏡を構築するために変更することができます。必要なことは、最後の2&quot;直径のミラーの回転です。代わりに下に走査ビームを指示するために鏡を向けると、ミラーが上にビームを指示することができます。対物レンズの配置トン試料ステージと一緒にミラーから同じ距離には、反転幾何学でのイメージングが可能になります。イメージングシステムはmicroendoscopicイメージングのためだけに構築されている場合は、すべてで垂直に顕微鏡のデザインを&quot;折り&quot;する理由はありません。代わりに、全体のスキャンシステムは、光学テーブルに対物レンズ平行に配向を持つ単一の水平のブレッドボード上に構築することができます。 これはほとんどの市販の共焦点顕微鏡で見ることができるように、より汎用性の高いシステムを希望するユーザーは、変数ピンホールを組み込んだ検討するかもしれない、最大のビルドのシンプルさと位置合わせを容易にするために提供しながら、このビルドの顕微鏡は、固定ピンホールの設定を使用していることに注意してください。ユーザーは、発光強度を変化させるサンプルを補うためにピンホールの大きさを調整できるようにすることで、これは、ユーザーがより良い特定のサンプルのシグナルの強さと解像度の間のトレードオフを最適化することができます。 CH顕微鏡用に選択したイメージファイバのOICEは重要です。我々は彼らの近くにファイバのコアの間隔と低相対自己蛍光に起因する住友のコヒーレント画像の繊維を使用することをお勧めします。フジクラ製の画像繊維は、サンプルからの微弱な蛍光シグナルを圧倒し、microendoscopeの究極の感度を制限することができます自家蛍光10の高い量を、有することが見出された。そのようなこの特定のセットアップで使用される8 - 30Nとして住友製造された繊維は、、彼らのフジクラ同等物よりもはるかに低い自家蛍光レベルがあります。 leeched繊維束がmicroendoscopyにとって魅力的と見なされるかもしれないが、彼らのデザインは、通常、ファイバコアのまばらなサンプルオブジェクトは、潜在的な関心の重要な地域を残していることを意味し、離れすぎて個々のファイバーのコアを配置します。 最後に、それは顕微鏡がここで説明しながら、in vitroおよび in vivoアプリケーションシート内の様々な有用になることに注意してくださいアドオンとは、フル機能の商用システムの数分の一のコストのために作成することができます、それはそのような透過光を検出、表示するための接眼レンズ、または非共焦点広視野落射蛍光用ビームのパスなどの機能を持っていません。それは最初からこれらの機能を持つシステムを構築することは可能ですが、そのようなシステムを希望する読者は彼らのニーズを満たすのではなく、完全に新しいビルドを開始するために、既存の商用システムを変更したいこともあるかもしれません。

<table border="1"><tbody><tr><td> パーツ名 </td><td> メーカー </td><td> アイテム番号 </td><td> 仕様 </td><td> 数量 </td></tr><tr><td> 515 nmのバンドパスフィルタ</td><td>彩度</td><td> HQ515/50M </td><td> 46 FWHM </td><td> 1 </td></tr><tr><td>色消しレンズ25.4ミリメートル径。 x 50mmのFL、MgF2のコーティング</td><td>エドモンドオプティクス</td><td> NT49 - 766 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>色消しレンズ25.4ミリメートル径。 X 76.2ミリメートルFL、MgF2のコーティング</td><td>エドモンドオプティクス</td><td> NT49 - 768 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>色消しレンズ25.4ミリメートル径。 X 88.9ミリメートルFL、MgF2のコーティング</td><td>エドモンドオプティクス</td><td> NT49 - 769 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td>色消しレンズ50ミリメートル径。 X 300ミリメートルFL、MgF2のコーティング</td><td>エドモンドオプティクス</td><td> NT45 - 179 </tD&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8kHzのR高周波光スキャナ</td><td>電気光学製品株式会社（EOPC） </td><td> SC - 30 </td><td> 8 kHzの</td><td> 1 </td></tr><tr><td> AGCドライバ</td><td>電気光学製品株式会社（EOPC） </td><td> ACG：8K </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H7422 - PA光センサモジュール</td><td>浜松市</td><td> H7422 - PA </td><td>現在の推奨制限</td><td> 1 </td></tr><tr><td> M9012の電源</td><td>浜松市</td><td> M9012 </td><td> H7422 - PAを使用するための</td><td> 1 </td></tr><tr><td> HC PL APO CS目的</td><td>ライカ</td><td> 11506284 </td><td> 10x/0.40 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Solios EA / XA画像取込装置のカード</td><td> Matroxの</td><td> Solios EA / XA </td><td> MILソフトウェアが必要です。OEMは、推奨される相互接続</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 12V電源</td><tD&gt; Meanwell </td><td> LPV - 100から12 </td><td> +12 V、8.5A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5倍の顕微鏡対物レンズ</td><td>ニューポート</td><td> M - 5X </td><td> 0.10 NA、25.4ミリメートル焦点距離</td><td> 1 </td></tr><tr><td>コヒーレントイメージファイバ</td><td>住友</td><td> 8 - 30N </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 / 4&quot;-20のキャップスクリューとハードウェアキット</td><td> ThorLabs </td><td> HW - KIT2 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 100μmのピンホールを装着</td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td>空間フィルタを構築するための理想的な</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30mmのケージキューブクランプ</td><td> ThorLabs </td><td> B6C </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30mmのケージSystemキューブ、4ウェイ</td><td> ThorLabs </td><td> C4W </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 406 nmの、5mWで、Bピンコード、SMファイバピグテールレーザーダイオード、FC / PC </td><td> ThorLabs </td><td> LPS - 406 - FC </td><td>廃止された製品、LP405 - SF10に置き換え</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5分間エポキシ、263 </td><td> ThorLabs </td><td> G14250 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 6軸キネマティック光学マウント</td><td> ThorLabs </td><td> K6X </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8〜32キャップスクリューとハードウェアキット</td><td> ThorLabs </td><td> HW - KIT1 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8〜32セットスクリュータイプとハードウェアキット</td><td> ThorLabs </td><td> HW - KIT3 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>外部RMSスレッドと内部SM1スレッド付きアダプタ</td><td> ThorLabs </td><td> SM1A4 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> ADJ。 FC / PCとFC / APCコリメータ、F = 2.0 mmのARC：400〜600 nmの</td><td> ThorLabs </td><td> CFC - 2X - </td><td> F = 2.0ミリメートル</td><td> 1 </td></tr><tr><td>調節可能なファイバコリメータアダプタ、ネジ​​切りSM1 </td><td> ThorLabs </td><td> AD9.5F </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>アルミブレッドボード、12&quot;× 18&quot;× 1 / 2&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> MB1218 </td><td> 1 / 4&quot;-20ネジ</td><td> 2 </td></tr><tr><td>卓上型レーザーダイオード/ TECコントローラ</td><td> ThorLabs </td><td> ITC4001 </td><td> 1 A/96 W </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DMLP 425nmのロングパスダイクロイックミラー</td><td> ThorLabs </td><td> DMLP425 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O1&quot;光学のためのキネマティックマウント</td><td> ThorLabs </td><td> KM100 </td><td></td><td> 3 </td></tr><tr><td> ThorLabsファイバピグテールレーザーダイオード用のLD / TECマウント</td><td> ThorLabs </td><td> LM9LP </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O18 mmの光学用レンズマウント</td><td> ThorLabs </td><td> LMR18 </td><td>含まれているもの、保持リング</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2&quot;光学用レンズのマウント</td><td> ThorLabs </td><td> LMR2S </td><td>固定リング含まれ、内部および外部のスレッドがで</td><td> 2 </td></tr><tr><td>ミニシリーズケージアセンブリロッド、6&quot;ロング、O4ミリメートル、数量1 </td><td> ThorLabs </td><td> SR6 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1.0&quot;ペデスタルピラーポスト、8から32タップ、1&quot;ロング</td><td> ThorLabs </td><td> RS1P8E </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> O1&quot;ピラーポストエクステンション、長さ= 0.5 </td><td> ThorLabs </td><td> RS05 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> O1&quot;ピラーポストエクステンション、長さ= 0.75&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> RS075 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> O1&quot;保護されたシルバーミラー、厚3.2ミリメートル</td><td> ThorLabs </td><td> ME1 - P01 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O1&quot;SM1の回転調節可能なフォーカシングエレメント、L = 1&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1V10 </tD&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O2&quot;保護されたシルバーミラー、厚3.2ミリメートル</td><td> ThorLabs </td><td> ME2 - P01 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> P100S - ø100μmのピンホールを装着</td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>ポラリス低ドリフトO1&quot;キネマティックミラーマウント</td><td> ThorLabs </td><td> POLARIS - K1 </td><td>低ドリフト</td><td> 1 </td></tr><tr><td> SM1レンズチューブ、L = 1&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1L - 10 </td><td>含まれているもの、保持リング</td><td> 4 </td></tr><tr><td> SM1ネジ30mmのケージプレート、0.35&quot;厚</td><td> ThorLabs </td><td> CP02 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> SM1のM25光コンポーネントスレッディングアダプター</td><td> ThorLabs </td><td> SM1A24 </td><td>外部SM1スレッドと内部M25.5x0.5スレッド</td><td> 1 </td></tr><tr><td>小さなビーム直径eterガルボシステム</td><td> ThorLabs </td><td> GVSM001 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>小さなクランプフォーク</td><td> ThorLabs </td><td> CF125 </td><td> 1月25日は&quot;スロット、普遍的にザグリ</td><td> 15 </td></tr><tr><td>空間フィルタシステム</td><td> ThorLabs </td><td> KT310 </td><td>ピンホールは別売り</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5.6＆9 mmのレーザー用TE -冷却マウント</td><td> ThorLabs </td><td> TCLDM9 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>ブレッドボード用の垂直ブラケット</td><td> ThorLabs </td><td> VB01 </td><td>各</td><td> 2 </td></tr><tr><td>計画-アポクロマート</td><td>ツァイス</td><td> 1101-957 </td><td> 20x/0.75 NA </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>

ビデオレートでスキャニング共焦点顕微鏡とmicroendoscopy

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

共焦点顕微鏡は、迅速、高感度、および複雑なシステムの高解像度の光学セクショニングを可能にする、生物学および生物医学科学の非常に貴重なツールとなっています。共焦点顕微鏡は、日常的に生細胞内2-4を特定の細胞標的1、モニターダイナミクスを研究し、全体の生物5,6の三次元進化を視覚化するために、例えば、使用されています。このような共焦点microendoscopesなどの共焦点イメージングシステムの拡張機能は、 生体内 7 の高分解能イメージングが可能で、現在臨床の設定8,9の疾患のイメージングと診断に適用されている。 共焦点顕微鏡は、単純な幾何光学を使用して、いわゆる&quot;光学セクション&quot;を作成することによって三次元分解能を提供します。標準的な広視野顕微鏡では、試料から発生する蛍光は、対物レンズによって収集され、検出器に直接中継。受け入れる一方、イメージング薄いサンプルのことが、厚い試料は客観的な焦点面の上下に発生する蛍光がぼやける。対照的に、共焦点顕微鏡は、試料の高分解能3次元表現を構築するためにアウトフォーカスの光を拒絶する、サンプルの仮想、光学セクショニングが可能になります。 共焦点顕微鏡は、検出のビーム経路に焦点アパーチャを使用してこの偉業を達成。客観的で、サンプルから収集された蛍光は、スキャニングミラーを介して、プライマリダイクロイックミラー、慎重に長く、ストークスシフト蛍光放出を渡しながら、このようなレーザの励起光として短い波長を反映するように選択したミラーを介して中継される。この長波長の蛍光信号は、対物レンズの焦点面と正確に共役平面に配置されているピンホールの両側にレンズのペアに渡されます。オブジェクトの焦点ボリュームから収集された光子は、コリメートされています対物レンズにより、ピンホールを介して共焦点レンズにより集光されています。焦点面の上または下に生成された蛍光は、したがって、適切にコリメートされず、顕微鏡の焦点からの光だけが見えるような光学部を作成し、共焦点ピンホール1を通過しません。 （ 図1）。したがって、ピンホールが効果的に唯一の限られた空間的な位置に検出された放射を閉じ込め、焦点面内の仮想アパーチャとして機能します。 近代的な商業共焦点顕微鏡では比較的簡単とアクセス可能な以前は複雑な画像処理手順を作成する、ユーザーは完全に自動化された操作を提供します。これらのシステムの柔軟性とパワーにもかかわらず、商業的な共焦点顕微鏡は、このようなin vivoイメージングの用途で多くのようにすべての共焦点イメージングタスクに適していません。彼らのニーズを満たすためにカスタマイズされたイメージングシステムを作成する機能がなければ、重要な実験がリアクタンスから残ることができる多くの科学者へのH。 この記事では、我々は基本的なコンポーネントからカスタム、ビデオレート共焦点イメージングシステムの完全な構築のためのステップバイステップの方法を提供します。正立顕微鏡は、標準速度共振ガルバノミラーは、遅軸をスキャンしながら、高速走査軸を提供するために、共振ガルバノミラーを用いて構築されます。対物レンズのフォーカスの正確なスキャンビームを作成するには、これらのミラーは、4つのリレーレンズを使用して、いわゆるテレセントリック平面に配置されます。共焦点検出は標準的な、既製の光電子増倍管（PMT）を使用して実行され、画像がキャプチャされ、Matroxの画像取込装置のカードと付属のソフトウェアを使用して表示されます。

カスタム、リアルタイムの走査型共焦点イメージングシステムの完全な構造が記載されている。容易にビデオレートの顕微鏡とmicroendoscopyに使用することができるこのシステムは、コストのほんの一部で、標準的な商用共焦点システムを使用してアクセスできませんイメージングジオメトリとアプリケーションの配列が可能になります。

ビデオレートでスキャニング共焦点顕微鏡とMicroendoscopy

共焦点顕微鏡法は、生物学および生物医学において不可欠なツールとなっており、迅速かつ高感度で高解像度な光学的な...

このビデオでは、標準的な市販部品を用いてビデオレート走査共焦点顕微鏡を構築する方法を実演します。走査共焦点顕微鏡は、2つの走査ミラーの協調動作によって、ビームをラスタ面上で移動させる仕組みに基づいています。最初のミラーからの光は、第1リレーレンズセットを介して水平方向に走査され、第2走査ミラー上の固定点に再び集光されます。その後、同様の走査動作が走査レンズおよびチューブレンズを通じて伝達され、拡大された光ビームが対物レンズの背面開口部に照射されます。1枚目のミラーに比べて低速で動作する2枚目のミラーがY軸を同時に走査することで、図示した平面の上方および下方への走査が可能となり、試料表面に矩形のラスタを作成します。市販の顕微鏡を購入する場合と比較して、本プロトコルの主な利点は、低コストであることと、イメージングプロジェクトの特定のニーズに合わせて装置をカスタマイズできることです。あらゆるレーザーを使用する際は、眼への損傷を防ぐために適切な安全対策を講じることが不可欠です。可能な限り、常に適切なレーザー保護メガネを着用してください。ビームの調整や操作に直接関与していない見学者や研究者も、必ずメガネを着用してください。光沢のある時計や反射しやすいジュエリーはすべて外してください。最も重要な点として、ビームブロックや固定した名刺を用いてビームの経路を遮断し、常にビームを追跡し制御するようにしてください。これは、ビームの経路を予測するのが困難なミラーのアライメント中に特に重要です。また、絶対に目をビームの経路と同じ高さにしないでください。顕微鏡を組み立てる前に、ビームの経路を横切る必要がある場合はレーザーの電源を切ってください。光学ブレッドボードと90度ブラケット、すべてのミラー、レンズ、ダイクロイックミラーに加え、適切なクランプと取付金具、2枚のスキャンミラー、および光検出器など、構築に必要なすべての装置が揃っていることを確認してください。また、アライメント中にスキャニング動作のテストやミラーの操作を行うため、ファンクションジェネレーターを手元に用意しておくと便利です。安定性を高めるため、ブレッドボードをボルトで固定することを強く推奨します。顕微鏡の組み立てを開始するには、ピグテールファイバーアトーを光学マウントに装着し、このアセンブリを光学ブレッドボードの中央に配置します。これは、ここに示されている青色ビームの起点に相当します。光源を点灯させます。調整ネジを使用して、ビームが水平および垂直の両方向に直線的に進むように大まかに調整してください。ファイバーコリメーターの前面にアイリスを配置します。次に、ビームが中心を通るようにアイリスの高さを調整します。その後、ビームパスに沿ってアイリスをATORから遠ざけます。ビームのアライメントを確認してください。必要に応じて、2本の調整ネジを使用してアイリス上のビーム位置を調整します。マウントした二色性ミラーをビーム光路上に配置し、レーザービームがミラーの中心に位置するようにします。ビームの高さが変わらないように注意しながら、ミラーホルダーを回転させてビームを約90度に反射させます。マウントのネジを締めて、ミラーをテーブルに固定します。次に、マウントした共振ガルバノメトリックミラーをレーザー光路内に配置します。この際、レーザー光がミラー表面の正確な水平中心に位置するように注意してください。ミラーマウントを回転させ、レーザービームを90度の角度で反射させます。次に、ミラーによる反射を粗調整し、レーザービームの垂直方向の高さを維持します。続いて、2つのアイリスを用意し、共振ガルバノミラーの直前に配置します。次に、共振ガルバノミラーで反射したレーザービームを基準にして、これまでと同様に垂直方向の高さを設定します。次に、光学ブレッドボード上のネジ穴を目安にして、2つのアイリスを直線状に固定します。経路上の最初のミラーであるダイクロイックミラーを調整し、最初のアイリスの中心にビームを合わせます。次に、光路上の2番目のミラーを調整します。2番目のアイリスでビームを中央に合わせるために、共振ガルバノミラーを調整してください。ビームが両方のアイリスを通過して整列するまで、これら2つのミラーを繰り返し調整します。共振ガルバノミラーで反射したレーザービームが、引き続き近似的なミラーの中心で反射していることを確認します。ビームが逸脱している場合は、ファイバーコリメータのマウントを調整し、ビームが両方のオープンアイリスの中心にくるように調整を繰り返します。次のステップは、最初の固定テレセントリック面を2番目の固定テレセントリック面に結像させるための、2枚のリレーレンズを配置することです。この顕微鏡では、第1リレーで選択したレンズの焦点距離が等しくFであるため、2つのミラー間の距離は単純に4Fとなります。この構成では、Fは90 mmであるため、4Fの位置は走査ミラーから360 mm離れた場所になります。レンズがビームパスの中心に正確に配置されるようにするため、まず第1レンズをビームパスに設置し、ビームパス上の次のアイリスに投影されたレーザービームのスポットを確認します。レンズの設置後、ビームの垂直方向の中心がアイリスの中心に一致するようにレンズの高さを調整してください。次に、水平ビームの位置を調整し、ビームをアイリスの中心に合わせます。この手順を2枚目のレンズでも繰り返します。続いて、スキャンミラーを設置し、顕微鏡を回転させます。これにより、通常であれば垂直方向に調整が必要な部品の配置とアライメントを、より容易に行うことができます。2番目のテレセントリック面の正確な位置を特定するために、共振ガルバノメータをスキャンユニットに接続し、電源を入れます。名刺を使用して、2つのレンズを通過するスキャンビームの経路を追跡してください。2番目のテレセントリック面は、共振ガルバノメータから約4Fの位置にあり、スキャンビームが静止して見える位置として特定できます。この場所の下にあるブレッドボードに鉛筆で印を付けます。テレセントリック面を特定したら、スキャニングミラーの入力を0 Vに設定し、ミラー制御ハードウェアの電源を入れ、ミラーをニュートラルポジションに安定させます。その後、標準のスキャニングGalilミラーをテレプレーンの正確な位置に配置します。テレプレーンにおけるビームがスキャニングミラーの正確な中心に当たるようにミラーの位置を調整し、ミラーマウントを締め付けます。次に、ガルバノミラーを固定しているロックネジを緩めて回転させ、ビームが垂直に伝搬していることを確認します。その後、レーザーとスキャニング電子回路の電源を切ります。ファイバーとスキャンミラーを取り外します。次に、90度ブレッドボード用マウントブラケットを使用して、2枚目のブレッドボードを1枚目に固定します。最後に、新しいブレッドボードが水平になるように顕微鏡全体を慎重に回転させ、クランプを使用して顕微鏡を固定します。ここでgal oとレーザーを再接続し、gal Oを0 Vに戻すことを忘れないでください。以前は垂直に設置していた残りのセットアップは、水平なブレッドボード上で容易に実施できます。次に、正式にはスキャンレンズおよびチューブレンズと呼ばれる2組目のリレーレンズを設置します。適切なレンズの組み合わせを選択するための非常に重要な情報については、付属の書面によるプロトコルを参照してください。まず、レンズの設置から開始します。まず、ビームを対物レンズに導くために必要なミラーを配置します。最初の2インチの大型ミラーをブレッドボードの端に近づけて設置し、ミラーマウントを回転させてレーザービームを概ね90度方向に反射させます。ミラーでの反射を調整し、ビームの垂直方向の高さを一定に保ってください。次に、もう一つの2インチミラーをブレッドボードの反対端に配置して、ビームを90度の角度に方向づけ、調整ネジを使用して固定します。続いて、2つのアイリスを設置し、前述と同様に2つのミラーを調整してビームを中心に合わせます。その後、ビーム光路上のgalから焦点距離の位置にスキャンレンズを配置し、その水平および垂直方向の位置を調整します。レーザースポットを2枚のミラー間にある最初のアイリスの中心に合わせます。2インチの大型チューブレンズをスキャンレンズから適切な距離に慎重に配置し、水平および垂直方向の位置を調整して、ビームを最初のアイリスの中心に合わせます。このセットアップでは、すべてのコンポーネントを配置した状態で、チューブレンズを75 millimetersに300 millimetersを加えた距離に配置します。gal Oを標準的な電気関数発生器または制御回路の出力に接続し、ピーク間電圧を1〜3 Vに設定します。次に、名刺を用いて2つのミラーのスキャンを開始します。チューブレンズから300 mm後の固定平面でレーザービームの位置を確認します。対物レンズを光路に配置し、対物レンズの後方開口部ができるだけ定在面に近づくように配置します。サンプルステージをセットアップし、Z軸の移動マウントが全可動範囲内で対物レンズのマウントに接触しないことを確認してください。共焦点顕微鏡、ピンホール、および検出器をセットアップするには、まずすべての電源と光ファイバーを切り離します。顕微鏡アセンブリを回転させ、共振走査ミラーを保持した状態で再びブレッドボード上に設置します。ファイバーをコリメータおよび標準走査ミラーに再接続し、電源、供給、および制御ケーブルを接続した後、ステージ上の標準走査ガルバノメータを駆動する制御電圧に、前と同様に0 Vを印加します。2枚のカバーガラスの間に挟んだ明るい染料のサンプルを配置します。次に、レーザー光源をオンにし、染料に焦点を合わせます。名刺を用いて、蛍光が最大限に明るくなるようにレーザー出力を調整します。サンプルからの蛍光放出が、対物レンズ、走査システムを経て、レーザー光を反射し蛍光放出を透過させるダイクロイックミラーに到達する経路を辿ります。ダイクロイックミラーの反対側で、この蛍光信号を確認してください。ここで室内の照明を落とします。ダイクロイックミラーの後方にミラーを配置し、エミッションを90度の角度で反射させます。次に、ミラー付きのアイリスを用いて、蛍光ビームをブレッドボードに対して可能な限り直線かつ平行に導きます。次に、Thor Labs社の空間フィルタケージマウントアセンブリを使用して、共焦点ピンホールユニットを設置します。この図にセットアップの概略を示します。スキャニングミラーは、固定の対物レンズに対してテレフォーカス位置にある固定平面に配置されます。固定面の間にある後方開口面のレンズペアは、走査ビームを中継する役割を果たします。最初のレンズペアは等しい焦点距離を持ち、1対1の望遠鏡を構成します。正式に走査レンズおよびチューブレンズとして知られる2番目のレンズペアは、焦点距離が等である必要はなく、多くの場合、対物レンズの後方開口面がオーバーフィルされるようにするためのビーム拡大望遠鏡として機能します。試料から放出された光は、スキャニングシステムを逆方向に通り、ダイクロイックミラーを透過します。短焦点レンズまたは対物レンズによって、放出光が共焦点ピンホールに集光され、その後レンズでコリメートされます。最終的なレンズにより、共焦点フィルタリングされた放出光が光電子倍増管に集光されます。空間フィルタユニットをエミッションビームの光路上に配置し、第1集光レンズのマウントがエミッションビームの中心にくるように注意して調整します。ここでは、ピンホール径 100 microns の空間フィルタユニットを選択しました。次に、短焦点レンズをユニットに取り付け、ピンホール表面に明確な焦点が見えるまでZ軸移動マウントをスライドさせます。ユニット全体が蛍光ビームの直線に沿って配置されていることを確認します。ユニットをブレッドボードに固定してください。次に、移動ステージの調整ノブを使用して2軸を調整し、ピンホールマウント表面で2次元探索を行い、ピンホールを通過する蛍光信号が最大となる点を探します。次に、ピンホールの後のケージマウントにコーティングレンズを配置します。名刺を使用して、共焦点ユニットを通過する蛍光イオンを確認し、放出される蛍光が可能な限り集光されるまで、ポストに沿ってコーティングレンズをスライドさせます。光電子増倍管アセンブリをセットアップします。蛍光放出光路に焦点距離 50 millimeter のレンズを配置し、その焦点を確認します。ブレッドボード上のこの位置に印を付けます。次に、レーザーを完全に消灯し、光電子増倍管の窓が、印を付けた焦点にできるだけ近づくように配置します。その後、調節可能なレンズチューブを使用して、アセンブリを集光レンズに接続します。ピンホール以降の露出しているすべてのビームパスに遮光テープを巻き、レーザーの出力を極めて低く設定して電源を入れます。オシロスコープで電圧を確認しながら、光電子増倍管を慎重に起動します。レーザー強度を上げながら、オシロスコープの画面にスパイク状の読み取り値またはDCオフセットが表示されるまで電圧を上げます。レーザー出力をオフにするか、ビーム光路を遮断して信号が消失することを確認し、この信号が確かに蛍光によるものであることを確認します。最後に、オシロスコープで信号が最大になるようにピンホールの位置を繰り返し調整します。まず集光レンズのZ位置を操作し、次にYZ移動ステージを調整することで、ビデオレート顕微鏡のハードウェア構成が完了します。まず、光電子増倍管の電源を切ります。次に、付属の書面プロトコルの図に従って、ミラーのカスタム制御ボードとコンピュータを接続します。このシステムは、共焦点走査型マイクロエンドスコピーの実施に適応させることが可能です。ステージをファイバー保持ステージに置き換える手順については、付随するテキストまたは詳細を確認してください。完成した正立共焦点走査型顕微鏡とマイクロエンドスコープは、ここに示すようになります。レーザー光および放射光は、視覚的なガイドとして描かれています。マイクロエンドスコピー操作では、実験時にイメージファイバーを固定するためにファイバーマウントが使用されます。このファイバーマウントは、用途に応じてXYステージに容易に交換することが可能です。ここに示されている正立顕微鏡プラットフォームは、ビデオレートフレームグラバーカードを用いて入力信号から画像を生成し、白い名刺に印字された小文字のMを撮影した代表的なテスト画像です。漂白済み。白色の紙にはUV光や青色光で容易に励起される蛍光物質が含まれており、暗い部分の背後に明るい背景が生じます。この蛍光放出を収集するために、Mレターおよび515 nanometersを中心とするエミッションフィルターを選択しました。特に画像フレームの側端付近で、わずかな画像の歪みが観察される場合があります。この歪みは、8 kHzのgvoミラーによる正弦波スキャンパターンに起因するものであり、付属の資料で詳細に説明されています。この動画では、ビジネスカードをスキャンして得られたサンプルビデオレートデータを示しています。この動画を視聴することで、ビデオレート共焦点走査型顕微鏡の構築およびアライメント方法について十分に理解できたはずです。レーザー光を用いた作業は極めて危険であるため、本手順の実施中は、反射性のジュエリーをすべて外すことや、ビームラインと目の高さを合わせないようにすることなど、常に十分な予防措置を講じてください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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