血液培養から細菌性病原体の検出および抗菌剤耐性テストのための一日のワークフロースキーム

この手順の全体的な目的は、従来の法よりも短時間で血液培養分離株を同定し、その薬剤感受性を評価することです。これは、まず、新しい16 s ribosomal DNA MultiPro PCRアッセイを用いて血液培養分離株を同定することによって達成されます。

その後、分離株を抗生物質パネルとともに6時間インキュベートします。次のステップでは、定量的16sリボソームDNA PCRアッセイを用いて、抗生物質存在下における分離株の増殖または増殖抑制を判定します。最終的に、これらの結果から、培養とPCRを組み合わせることで、血液培養分離株の同定および薬剤感受性試験をより迅速に行えることが示されます。

自動化されたPhoenixやIICシステムなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、事前の培養状態が不要であり、同定および薬剤感受性試験の結果を同日中に得られる点にあります。手順のデモンストレーションは、当研究室の大学院生であるVandy HansonとGIDが行います。微生物の増殖が陽性となった血培100 µLを、900 µLの0.9%塩化ナトリウムを含む反応チューブに希釈します。その後、サンプルを13,400 ×gで5分間遠心分離し、細菌をペレット化させます。

Reese、ペレットを100 µLの滅菌脱イオン水に懸濁してください。サンプルを4 °Cで保管し、次に使用するまで保持します。すべてのサンプルの準備が整ったら、目的の細菌から特定の16 sリボソームDNAを増幅させるためのリアルタイムPCR反応液を調製します。

脱イオン水を用いて、1反応あたりの容量を20 µLに調整します。96ウェルPCRプレートの各ウェルに、PCRミックスを20 µLずつ分注します。次に、各ウェルにサンプルを5 µL加え、PCRプレートを密封します。

次に、ABI Prism 7, 900 HT リアルタイムPCRシステムでPCRを実施します。PCR完了後、結果を解析するために、まず「analysis settings」タブを使用してCT解析を0.1に調整します。次に、ベースライン設定を、開始サイクルを6、終了サイクルを15に絞り込みます。各サンプルのCT値を記録してください。

PCR結果を陽性と判断するためのカットオフ値は、一般的にCT値35に設定できます。この例では、e coliに感染した血液培養の同定プロファイルが2つの反応ミックスで示されています。ユニバーサル16 s ribosomal DNAプライマーが含まれており、CT 25.2および25.95の2つの増幅曲線が生成されました。

3番目の増幅曲線はColi特異的なプローブから得られたものです。その他の特異的プローブでは検出可能な信号は得られませんでした。病原体が特定された後、抗生物質感受性試験を実施できます。

まず、陽性の血液培養液から5 mLのブロスを血清分離管に分注します。サンプルを2000 ×gで10分間遠心分離し、遠心後、管内の上清を除去します。次に、滅菌綿棒を用いて、管内のゲル層から細菌を0.9% sodium chlorideに転移させ、濁度が0.5 McFarland標準に達するまで調整します。

これは、1mLあたり約1.5×10⁸ CFU（コロニー形成単位）に相当します。次に、この懸濁液を2倍濃度のMuller Hintonブロスで希釈し、約5×10⁵ CFU/mLの濃度にします。

抗生物質を各ウェルに50 µLずつ分注済みのマイクロタイタープレートに、懸濁液を1ウェルあたり50 µLずつ分注します。抗生物質の代わりに水を加えたウェルを用いて、各サンプルの陽性増殖コントロールを必ず含めてください。分注が終わったら、プレートに蓋をします。

その後、細菌を増殖させるため、プレートを37 °Cで6時間インキュベートします。陰性増殖対照として、細菌懸濁液の一部を4 °Cで保存してください。6時間のインキュベーション後、各ウェルの内容物と陰性対照サンプルを別々の滅菌チューブに移します。

16,000 ×gで5分間遠心分離した後、上清を80 µL取り除き、ペレットを80 µLの滅菌脱イオン水で再懸濁します。16SリボソームDNAリアルタイムPCRに使用する前に、サンプルを水で1:10に希釈します。

IQ cyber green super mixおよび16 s ribosomal DNAプライマーを用いてPCRミックスを調製し、96ウェルPCRプレートの各ウェルに20 µLずつ分注します。次に、各サンプルを5 µLずつウェルに加え、プレートを封止します。

次に、結果を解析するためにPCRを実施します。まず、カットオフCT値を算出します。一般的に、カットオフCTは、陽性増殖コントロールのCTに、陰性増殖コントロールのCTの0.5倍を加え、そこから増殖コントロールのCTを引いた値となります。

ただし、グラム陰性桿菌におけるピペラシリン・タゾバクタムおよびセフダジジン、ならびに黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）におけるアモキシシリン、オキサシリン、トリメトプリム・スルファメトキサゾール、または腸球菌（Enterococcus spp.）におけるアモキシシリンについては、乗数因子0.5を0.25に低減させる必要があります。各サンプルの菌株の感受性または耐性は、サンプルのCT値をカットオフCT値と比較することで判定できます。

CT値がカットオフ値を上回れば感受性あり、カットオフ値を下回れば耐性ありであることを示します。以下は、薬剤感受性増幅プロットの例です。前述の E coli 株を用い、個別の曲線で示される複数の抗菌薬に対する感受性試験を行いました。

CT値が低いサンプルは、抗生物質の存在下で増殖が起こったサンプルであり、テストした抗生物質に対して耐性があることを示しています。反対に、CT値が高いことは、増殖が起こらなかったサンプルであることを表しており、テストした抗生物質への感受性を示しています。この手法に習熟すれば、適切に実施することで9時間で完了させることができます。