Name: StemCell Technologies社からRosetteSepキットと人間の血液からNK細胞の濃縮 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 学ぶ RosetteSepキットを用いた人間血液からのNK細胞負選択分離法。高純度で生存率の高い自然傷害細胞を迅速に濃縮し、免疫学研究や細胞機能解析に応用可能な信頼性の高いプロトコルを解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

詳細なプロトコルは、それぞれのロゼットのSEP分離カクテルに含まれており、StemCell TechnologiesのWebサイト1で利用できるオンラインになっています。

<ol><li>Procedures and instruction manuals. , 
	
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx">http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx</a> Forthcoming.</li>
</ol>

このテクニックを使用して単離した細胞は、さらに他の細胞分離キットを用いて、異なる集団に分けることができます。

PBS、2％FCSとHistopaqueソリューションを補充は、プロシージャの開始前に室温に戻しておく必要があります。

stemcell technologies社からrosettesepキットと人間の血液からnk細胞の濃縮

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

ナチュラルキラー（NK）細胞は自然免疫系に属し、がんや感染症との戦いで大きな役割を果たす大型顆粒細胞傷害性リンパ球であるが、また妊娠中や移植拒絶反応の初期段階に関与している。これらの細胞は、末梢血中に存在し、それらを単離することができる。細胞は、正または負のどちらか選択を用いて単離することができる。我々は表面のすべてのセル上に存在するマーカーが関心の細胞を標的とする抗体のカクテルを使用して負の選択のためのに対し、正の選択のために我々は、関心の高い細胞の表面マーカーの存在に対する抗体を使用してください。この後者の手法は、それによって不要な細胞の活性化やdifferenciationのリスクを低減、抗体の自由な目的の細胞を残すことを示します。このビデオプロトコルでは、StemCellの技術からRosetteSepキットを使用して、負の選択により、ヒト血液からNK細胞を分離する方法を示します。手順は、ヒト末梢血を（人間の被験者を保護するための制度審査委員会に承認されたプロトコルの下で）取得し、NK細胞上に存在しないマーカーに結合する抗体のカクテルと混合伴いますが、周辺に存在する全ての他の単核細胞上に存在する血液（例えば、Tリンパ球、単球...).カクテルに存在する抗体は、赤血球にグリコフォリンに対する抗体にコンジュゲートされる。すべての不要な細胞や赤血球は、したがって、複合体に閉じ込められます。血液と抗体カクテルのミックスは、その後、希釈Histopaque勾配の上で合成し、遠心分離されています。 NK細胞は、（&gt; 80％純粋）Histopaqueと希釈した血漿との界面で収集することができます。同様のカクテルは、ヒトTリンパ球など他の細胞集団の濃縮のために用意されています。

ナチュラルキラー細胞はリンパ球の小集団である。ここでは、StemCell Technologies社からキットを使用して、負の選択によって、ヒトの血液からこれらの細胞を単離する方法を示します。得られた細胞は、そのための手続きの数に使用する準備が現実的で抗体による手つかずのです、と。

StemCell Technologies社からRosetteSepキットと人間の血液からNK細胞の濃縮

ナチュラルキラー（NK）細胞は、自然免疫系に属する大型の顆粒性細胞傷害性リンパ球であり、がんとの闘いにおいて重要な役割を果たしている...

こんにちは、クリスティーン・ビートンです。私はカリフォルニア大学アーバイン校生理学・生物物理学部のジョージ・チェン研究室で助手研究員を務めています。本日は、Stem Cell Technologies社のカクテルキットを用いて、ヒト血液からナチュラルキラー細胞を陰性選択する方法について説明します。Stem Cell Technologies社のこのキットを使用する理由は、非常に純度の高い細胞が得られ、かつ陰性選択によって抗体に結合していない細胞を回収できるためです。これにより、それらの細胞に予期せぬ事象が発生することを防げます。Tsepキットの仕組みは、血液中で目的外のすべての細胞に結合する抗体を用いるというものです。私の例では、T細胞、B細胞、単球があり、さらに赤血球のグリコフォリンAに結合する抗体があります。ここで行ったのは、白血球に対する抗体と赤血球に対する抗体を結合させたことです。これにより、不要な1つの白血球と複数の赤血球からなる複合体が形成されます。赤血球は白血球よりも密度が高いため、血液と抗体を含む混合カクテルを密度勾配に載せて遠心分離すると、赤血球がチューブの底に沈降し、それに伴って不要な白血球がすべて一緒に引き込まれます。その結果、勾配の上部に回収されるのは、抗体に全く結合していない、純粋またはほぼ純粋なナチュラルキラー細胞になります。それでは、ヒト血液のチューブからNK細胞を単離しましょう。これはソジウムヘパリンチューブに採取された新鮮な血液です。勾配剤として、Roset epのヒトNK細胞濃縮カクテルを使用します。実験の後半では、密度が1.077の10 77 histo packを使用します。また、2%胎児牛血清を添加したPBSも準備しています。これらは冷蔵庫で保存しているため、使用前に室温に戻るようにしてください。それでは、採血した血液全量を取り出し、50 mLファルコンチューブに入れます。真空容器であるため、内部が真空になっており、中身が飛び散らないように開封する必要があります。キャップにある小さな切り欠きの位置を確認し、慎重に持ち上げてチューブ内に空気を導入します。チューブの真空状態が解除されたら、キャップを簡単に取り外すことができます。次に10 mLピペットを用いて、チューブ内の血液をすべてピペットで吸い出します。血液量は約10 mLになると想定されます。ここに9.5 mLの血液があります。この9.5 mLすべてを50 mLファルコンチューブに入れます。血液が入っていたピペットは直接バイオハザード袋に廃棄します。チューブには常に漂白剤を少量加え、蓋を閉めてからバイオハザード袋に入れます。これが、抗体カクテルを添加する前の血液の状態です。これから血液に抗体カクテルを添加します。血液量が約9.5 mLあり、血液1 mLあたり50 µLのカクテルを添加する必要があるため、450 µLのカクテルを血液に加えます。その後、静かに混ぜると、ほぼすぐに凝集が起こるのがわかります。ご覧の通り、凝集が確認できます。これにより、不要な白血球と赤血球との間での相互混入（クロスリーキング）が現在進行しています。タイマーを20分に設定し、チューブをフード内にそのまま20分間静置します。これで、血液をロゼットサブカクテルと共に20分間インキュベートしました。次に、これをPBSおよび胎児牛血清を加えて1対1に希釈します。この混合液を2本の15 mL histo pack 10 77にオーバーレイします。その後、遠心分離機で20分間遠心分離を行います。約10 µLの血液と抗体カクテルを用意しました。ここに2%胎児牛血清を含む10 µLのPBSを加えます。これで1:1の希釈になります。PBSを血液に加えると、ご覧の通りすぐには混ざり合わないため、ゆっくりと混ぜる必要があります。そのため、ここでは静かに混合します。これでPBSと血液が1:1の割合で混合されました。これを15 mLのHistopackに加えます。血液がヒストパックに混ざるのを避けるため、慎重にオーバーレイします。そのため、血液をすべて吸い上げてしまう25 $\mu$Lピペットではなく、10 $\mu$Lピペットを使用して数回に分けて分注します。簡単にオーバーレイするために、ヒストパックのチューブをほぼ水平に保持します。チューブに少量の血液を滴下し、組織切片用パッド（histo pack）まで下げます。そして、非常にゆっくりと、組織切片用パッドの上に血液を層状に重ねていきます。十分な厚みの血液層ができたら、ピペッティングの速度を少し上げ、チューブをゆっくりと垂直な状態に戻すことができます。ここで、抗体カクテルとPBSを混合した血液20 µLを、Histopack 15 µL 2層の上に重層させました。チューブの接合部を見ると、赤血球の小さな凝集体が徐々に勾配の中へと沈降し始めているのがわかります。このプロセスを迅速に進めるために、遠心分離を行います。これにより、20分以内にすべての赤血球がチューブの底部に集まります。そして、遠心分離を行う際の非常に重要なポイントがあります。ブレーキをオフに設定してください。急ブレーキをかけると、成分が乱れる可能性があるためです。そのため、常にブレーキをオフに切り替え、その後、20分間遠心分離を行い、処理を完了させます。これで、成分の20分間の遠心分離が完了しました。このように、細胞が異なる層に分かれています。まず、チューブの底から見ていきましょう。ここにあるのが、赤血球と、今回の目的ではない細胞です。その上には明確な勾配層があり、さらにその上には黄色いプラズマ層があります。そして、今回注目する細胞、すなわちNK細胞は、この勾配層とプラズマ層の間にある白い細胞の薄い層に存在します。当然ながら、NK細胞は血球のごく一部であるため、この層は非常に薄くなります。次に、滅菌済みのパステールピペットを使用してNK細胞の層を取り除きます。そして、この層を新しい空の50 mL Falconチューブに移します。そこで、層に移動してピペッティングで回収します。当然ながら、細胞数は非常に少ないです。細胞数が多い場合でも、このように細胞数が少なければ、層を非常にきれいに回収することができます。また、製造元の注意書きにある通り、細胞の損失を防ぐために勾配液を少量一緒に回収することが推奨されています。そのため、細胞が確認できる限り、ピペッティングを続けます。すべての細胞を回収し終えると、透明な試薬と黄色い血漿との間に明確なコントラストが見えるはずです。これで、すべての細胞を回収できたと思います。グラジエントを確認すると、ヒストパックと血漿の界面に白く濁った部分は見られません。このようにして、グラジエントから視認できるすべてのNK細胞を取り出して新しい50 mLファルコンチューブに移し、直ちに2%胎児牛血清を添加したPBSをチューブに加えました。50 mLまで満たし、細胞を遠心分離してペレット化します。これが1回目の洗浄となります。この手順をもう一度繰り返し、計2回の細胞洗浄を行います。その後、細胞は培養への導入やフローサイトメトリー染色など、任意の処置が可能な状態になります。NK細胞の純度は少なくとも80%に達し、場合によってはそれ以上の純度が得られます。この手順を用いて、最大98%の純度を得た例もあります。本日は、StemCell Technologies社のTSキットを用いて、ヒト血液からナチュラルキラー細胞を迅速かつ確実に単離する手法をご紹介しました。また、ヒト、ラット、またはマウスから他の細胞種を単離したい場合は、同社のT細胞単離キットを同様にご利用いただけます。これらのキットには、T細胞やB細胞だけでなく、例えばT細胞のサブタイプ向けのものも用意されています。

enrichment-nk-cells-from-human-blood-with-rosettesep-kit-from

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、効率的に拡大し、精製ヒトNK細胞の数が多いし、その機能を評価する方法を説明します。...

拡大、精製、及びヒト末梢血NK細胞の機能的評価

この動画では、細胞外フラックスアナライザーを使用して、活性化したヒトNK細胞のエネルギー代謝を解析する方法を実演しています。電子伝達鎖複合体のさまざまな阻害剤は、酸素消費率またはOCRを通じて測定されるATP合成に影響を与え、細胞代謝と生体エネルギー学に関する洞察を提供します。...

細胞外フラックスアナライザーを用いたヒトNK細胞のエネルギー代謝のリアルタイムモニタリング

このプロトコルは、開発、展開、およびヒトES細胞やiPS細胞から派生したNK細胞のin...

開発、展開、および<em生体内で&gt;</em&gt;ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）からヒトNK細胞のモニタリングとや人工多能性幹細胞（性IPSC）

簡単かつ信頼性のある方法は、異なるNK細胞サブセット内の脱顆粒、サイトカインおよびケモカインの産生などNK細胞機能のセットを分析するために、ここで説明されています。...

NK細胞の機能を監視するためのサイトメトリーに基づくアッセイを流します

本研究の目的は、自然なキラー (NK) 細胞の正常な遺伝子伝達を可能にする技術を策定することでした。人間のデキストランを介したレンチ ウイルス伝達や遺伝子発現効率の向上でマウスの主な NK 細胞実験結果。遺伝子伝達のこのメソッドは、NK...

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

流れ cytometry ベースの人間のナチュラル...

ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

ここでは、解明in vitroとin vivoの分化のフィーダー フリー システムを使用して、マウスの NK 細胞の遺伝子サイレンシングを量産するためのプロトコルを提案する.

生体外でマウスのナチュラル キラー細胞の大量生産のため新規無料の送り装置システム

ヒトナチュラルキラー細胞における治療抗体によるFcγRIIIA駆動事象を研究するためのプロトコルをここに説明する。この人工刺激プラットフォームは、脱顆粒、ケモカイン/サイトカイン産生、および結合に関与する抗体のFcγRIIIaおよびFc部分によって媒介されるシグナル伝達経路などの下流エフェクター機能の尋問を可能にする。...

治療抗体の存在下におけるFcγRIIIa関与によるヒトナチュラルキラー細胞事象の評価

本プロトコルは、3Dおよび2D培養条件の両方で、軽度の細胞毒性を有するCD3−/CD45+CD56+細胞をヒト拡大電位幹細胞(hEPSC)から分化させる方法を示しています。これにより、複雑な微小環境を破壊することなく、日常的な表現型検証が可能になります。...

ヒト増殖電位幹細胞からのナチュラルキラー細胞の作製

ここでは、ヒトiPS細胞由来のキメラ抗原受容体(CAR)を発現するナチュラルキラー細胞を分化・増殖させ、様々な悪性腫瘍に対する死傷性を向上させる方法を紹介します。このプロトコールは、ナチュラルキラー(NK)に最適化されたiPS細胞由来CAR-NK細胞の分化と増殖、およびさまざまな腫瘍細胞株に対する抗腫瘍活性の測定を示しています。...

ヒト人工多能性幹細胞由来キメラ抗原受容体発現ナチュラルキラー細胞の進歩

学ぶ RosetteSepキットを用いた人間血液からのNK細胞負選択分離法。高純度で生存率の高い自然傷害細胞を迅速に濃縮し、免疫学研究や細胞機能解析に応用可能な信頼性の高いプロトコルを解説します。

StemCell Technologies社からRosetteSepキットと人間の血液からNK細胞の濃縮

さらに動画を探す