Name: 長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学ぶEpiAirwayモデルを用いた長期宿主-病原体相互作用の特徴付け方法。NTHIとヒト気道上皮組織の共培養により、細菌の生存と挙動を評価し、呼吸器感染症の治療開発に有用な知見を得ることができます。

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我々は彼らのEMのスキルのために有用な議論のためのパトリックヘイデン（マテック）、そしてロバートスミスとジョージア健康科学大学のリビーペリーに感謝の意を表します。この研究は、DADにNIDCD助成金DC010187によって賄われていた

1。 EpiAirway組織のために生物学的安全キャビネットの準備<ol><li>にバックと手袋縛ら毛で、専用の白衣を着て、層流を開始します。 5分後、片側に（ピペット、チップ、遠心チューブなど）キャビネット内の任意のツールを移動、70％エタノールで生物学的安全キャビネットの内部とサッシをスプレーし、きれいなペーパータオルで拭いてください。 70％エタノールでもう一度洗浄インテリアをスプレーし、乾燥するために残す。クリーン側にツールを移動し、エタノールの手順を繰り返します。 </li><li>キャビネット内のエアロゾルのバリアピペットチップと専用のピペッターを使用してください。個別に包装された滅菌血清学的ピペットを使用するには、廃棄包装の外側を、層流を介して接続されての最後を渡すオープン分割し、キャビネット内にピペットをスライドさせます。 </li><li> EpiAirwayインサートは、滅菌ピンセットで処理する必要があります。場所6インチ精密チップ湾曲した自己シール滅菌袋とオートクレーブに鉗子を解剖。使用可能な状態に少なくとも6一日持つのに十分な準備をします。 </li></ol> 2。 EpiAirway組織の開梱<ol><li> 70％エタノールでバイオセーフティキャビネット内の作業面をスプレーし、きれいなペーパータオルで拭いてください。再びスプレーし、表面が使用前に乾燥させます。 EpiAirwayボックスを開き、発泡スチロールや梱包材を破棄する。 </li><li> EpiAirway抗生物質フリーの保守メディア、AIR - 100 - MM ABF（MM）は、マテック独自のものですとインサート付きキットで送信されます。バイオセーフティキャビネット内で、ラベルメディアのタイプと日付で6滅菌50 mlの遠心チューブ、およびキャップを緩めます。 70％エタノールでメディアのボトルをスプレーし、キャビネット内部に開きます。各チューブに新しい滅菌血清ピペットを用いて各チューブに分注しMM 25mlのは、4℃でキャップ、および店舗を締めます毎日MMの新鮮なアリコートを使用してください。 </li><li>カルシウムとマグネシウムと1の新鮮なボトルXダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D - PBS）を使用して、上記2.2を繰り返します。カルシウムとマグネシウムを含まないD - PBSを用いて再び繰り返す。 4ですべてのアリコート℃にて保存してください。 </li><li> EpiAirwayインサートAIR - 100℃の固体培地含有アガロースの上で4℃、24ウェルプレートに到着、および使用のための6ウェルプレートに配置する必要があります。エタノール耐性マーカーを使用して、日付と説明をそれぞれのプレートにラベルを付けます。各ウェルに4℃EpiAirwayのMMの代わりに1ミリリットル。その包装、70％エタノールでスプレー、およびバイオセーフティキャビネット内の場所から輸送プレートを取り外します。テープを外し、プレートを開きます。オートクレーブ鉗子を使用して、EpiAirwayインサート上の湿ったガーゼを取り除く。 </li><li> 6ウェルプレートのウェルにアガロースからそれを解放を支援するためにねじる運動を用いてオートクレーブピンセットで挿入、および場所をピックアップ。いくつかのアガロースは、トランスポートプレートの温度が周囲に増加し、特にとして、インサートに付着する場合があります。注意深くインサートからアガロースを削除するには、滅菌綿棒を使用してください。メンブレンに触れないようにしてください、と空気の泡が挿入下にトラップされていないことを確認してください。 5％CO 2で加湿37℃のインキュベーター内にプレートを置きます。 </li><li>共培養を開始する前に、インキュベーターで平衡化する組織のための少なくとも24時間を許可する。 </li></ol> 3。 EpiAirway組織のメンテナンス<ol><li>オートクレーブ鉗子を使用して、挿入をピックアップし、優しく組織にカルシウムとマグネシウムを予め温めておいたD - PBSを200マイクロリットルをピペッティングし、挿入を揺らし。角度で挿入を傾けて、挿入物の下部にある膜を保持するプラスチック製のリングと照らし合わせて滅菌P1000のピペットチップを置きます。組織には手を触れないでください。 D - PBSで洗浄し、標識滅菌クライオバイアルに配置吸引除去する。サンプルは-20℃で凍結し、後日ムチンおよび/またはサイトカイン発現についてアッセイされ得る。 </li><li>吸引し、新鮮なMMの1ミリリットルで置き換えることにより、毎日の基礎MMを変更します。各ウェルの新たな障壁のピペットチップを使用してください。一晩10％の漂白剤と使用されているメディアを扱い、廃棄する。 </li></ol> 4。 EpiAirway組織の接種<ol><li>チョコレート寒天培地上に凍結グリセロールストックから分類不可能なインフルエンザ菌 （NTHi）の新鮮な培養からストリーク。加湿した5％CO 2インキュベーターで一晩成長する。 </li><li>翌日、約0.7のOD（600 nm）のカルシウムとマグネシウムで予め温めておいたD - PBSでNTHiの単一コロニーを懸濁します。積極的に前に光学密度を測定する渦。 NTHiのmlあたり光学密度の関係は、コロニー形成するユニット（CFU / ml）を0.2のODは、（600 nm）を約1.0 × 10 8 CFU / mlを等しいということです。したがって、0.7のOD（600 nm）は約3.5 × 10 8 CFU / mlである。このアルゴリズムは、接種する前に、各NTHi株に対して検証する必要があります。 </li><li> EpiAirway組織は、AIR - 100は0.6 cm 2および0.4ミクロンの膜の表面積とインサート上で成長されています。組織は、〜1.0 × 10 6〜8.0 × 10 5で構成されている&lt;/&gt;のセルのSup。 12 -このため、1.0 × 10 7 CFUの接種は、約10の感染の多重度に対応しています。接種するために、3.1のように各EpiAirwayインサートを洗い流した後、バイオセーフティキャビネット内の各EpiAirwayインサートの先端面に4.2で調製した細菌懸濁液28マイクロリットルを追加。基礎MMを接種しないでください。インキュベーターに各プレートを返します。 </li></ol> 5。 NTHi接種の定量化<ol><li>消毒に0.1％ゼラチン（PBS - G）、オートクレーブでリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を調製します。各チューブに滅菌PBS - Gの接種、アリコート900マイクロリットルのOD（600nmで）に基づいて、目的の1:10希釈液とラベル滅菌済み1.5 mLエッペンドルフチュー​​ブ。 </li><li>接種NTHiを列挙するために必要なチョコレート寒天プレートの数を決定します。一時間のために上半分で休んでプレートの底に逆さまに空気のインキュベーター内でこれらのプレートを置きます。これは、NTHiのドロップメッキを容易に、37〜暖かい両方にプレート℃、表面が乾燥することができます。 </li><li> 4.2から最初の試験管に細菌懸濁液100マイクロリットルを添加することにより接種のシリアル1:10希釈を開始します。前に次を作る〜5秒間激しくボルテックス各希釈を。各希釈液の半分プレートを使用して、予め温めておいたと表面乾燥チョコレート寒天プレート上に10マイクロリットルのアリコートをドロップします。 5〜6個の10マイクロリットルのアリコートは、一緒に実行せずに各100mmプレートの半分に収まることができます。ときは加湿37の上下を逆に乾燥し、場所℃でCO 2インキュベーターで一晩。 </li><li>翌日、各ドロップ15〜30の別個の植民地を持っている希釈液をカウントし、NTHiの実際の実行可能な接種に戻って計算することによって、CFU / mlを決定する。 </li></ol> 6。 NTHiとの長期共培養<ol><li> 24時間ごとに、3.1のようにインサートを洗う、その後は-20細菌や凍結の同じ系統·今後の分析のための標識クライオバイアルにCを接種されている各組織の洗浄液をプール。これらのサンプルは、ドットブロットまたはELISA法によるサイトカインの発現のためのムチンの存在を検定することができる。また、mRNAおよび定量PCRのために伐採することができる組織は、目的の遺伝子に行うことができます。 3.2のように毎日の基礎MMを変更します。共培養の期間中継続する。 </li></ol> 7。 EpiAirway組織の収穫<ol><li>カルシウムとマグネシウムを含まないD - PBSでサポニンの新鮮な1％の溶液を調製、ろ過滅菌し、37℃に温めて</li><li> 37℃にカルシウムとマグネシウムなしで、MMとD - PBSの別の50 mlチューブを温める</li><li> 5.1のように希釈チューブを準備するだけでなく、インサート番号とNTHi株で標識インサートごとに空の滅菌済み1.5 mLエッペンドルフチュー​​ブ、。 </li><li> EpiAirwaysが付着し、内面化の両方の生物を含むトータル細胞関連細菌、いずれかの、または唯一の内部化細菌のために収穫することができる。 </li><li>ドロッププレート細胞関連または5.2のように空気インキュベーターで一時間NTHi、ラベルや乾燥を侵略するために必要なチョコレート寒天プレートの数を決定します。 </li><li>総細胞関連細菌を回収するために、カルシウムやマグネシウムを含まないD - PBSの200マイクロリットルで三回EpiAirwaysの頂端表面を洗い流した後、インサートを傾けて、基底膜から残りのMMをすすぐ。最初の洗浄は、後で分析するために凍結することができます。以下の洗浄を捨てる。 </li><li>新鮮な6ウェルMMなしプレート、および各組織の頂端表面上に7.1から滅菌1％サポニン溶液のピペット250マイクロリットルで洗浄したインサートを配置。 10分間インキュベーターに戻す。 </li><li>インキュベーターから削除、および滅菌P1000ピペットチップを使用して、使用して往復運動、インサートの端から組織を除去するために円を描くように続いて膜から組織をスクラブ。大口径の滅菌P1000のピペットチップを使用して、7.3で作成した空のラベルが付いたチューブにサスペンションを配置。インサートの頂端表面上にカルシウムやマグネシウムを含まないD - PBS 250マイクロリットルを追加。 </li><li>収穫する、残りの組織があるかどうかを判断する倒立位相差顕微鏡を用いてインサートを調べる。必要に応じて、大口径の滅菌P1000のピペットチップを使用して7.8からチューブに、この懸濁液を追加し、別の滅菌P1000ピペットの先端で再びスクラブ。カルシウムやマグネシウムを含まないD - PBSを用いて1ミリリットルにチューブの合計量をもたらす。 </li><li> 1分間トップスピードで激しくボルテックス細胞懸濁液。 26ゲージの針を備えた滅菌1 mlシリンジを使用して、針を通して注射器に、懸濁液を吸引除去する。ゆっくりと泡を作成しないように注意しながら、針を3回通過サスペンションを渡します。精力的に再び1分間ボルテックス。 </li><li> 7で調製した最初の希釈チューブに大口径のピペットチップ、場所懸濁液100マイクロリットルを使用する。3。 5秒間激しくボルテックスして、シリアル1:10希釈を行います。ドロッププレート表面乾燥チョコレート寒天プレート上に所望の希釈液。 </li><li>のみ内部化された細菌を回収するために、カルシウムまたはマグネシウムなしで、D - PBSを200マイクロリットルを各インサートを3回洗浄。最初の洗浄を保持して凍結する。 100マイクログラム/ mlの最終濃度に予め温めておいたMMに硫酸ゲンタマイシンを追加。収穫されるインサートごとにメディアの1.5 mlを調製。ゲンタマイシン含有MMと基底MMを交換し、頂端表面にゲンタマイシン含有MMの300マイクロリットルを追加。一時間に戻って、CO 2インキュベーターにプレートを置きます。 </li><li>頂端表面からゲンタマイシン含有MMを削除して、カルシウムとマグネシウムなしで予め温めておいたD - PBSでインサートの先端面と基底膜を洗浄。 7.7から7.11のように進んでください。 </li></ol> 8。代表的な結果： NTHiによる5日間共培養した後、（A.）感染していないEpiAirway組織と（B.）組織の走査電子顕微鏡写真を図1に示されています。NTHiによる長期共培養は根尖に重大な損傷が発生しない組織、EpiAirwayモデルの有用性を強調。組織内部の時間の経過とともに定量化内部化された細菌の数を示すグラフを図2に示されています。両方の結果は非常に再現性がある、NTHi宿主-病原体を研究するための人間の上気道のin vitroモデルにおける EpiAirway組織に一貫性と生物学的に関連すること相互作用。 <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。EpiAirway組織の走査型電子顕微鏡。 A.非感染制御の組織。 NTHiと共培養の五日後にB.組織。頂端表面に有意な損傷は、感染した組織で観察されていません。 <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。NTHiの数はEpiAirwayの共培養中に経時的に内面化。株をR2866は、各指定された時点で内部化された細菌のために伐採約1.0 × 10 7 CFU /インサート（0日）、で接種した。バーは、n = 3が、少なくとも二重に複製表します。エラーバーはSDです。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このメソッドは、空気 - 液体界面における原発性ヒト呼吸器組織の生物学的に関連する背景に長期的な宿主 - 病原体相互作用の調査が可能になります。ここでは、感染微生物としてNTHiを使用しましたが、時間をかけて許容細胞毒性を導入しない任意の細菌の相互作用は、この方法で定量することができる。 EpiAirwayモデルはまた、ウイルス、薬物、または化学物質に影響を与える人間の上気道5の研究に用いることができる、6、7、8。我々は、少なくとも10日間NTHiに感染して40日以上、および組織のための感染していない組織を維持している。我々は、必要に応じて感染組織が、大幅に長く維持される可能性があると考えて。 この方法の制限は、再構築することができないこれらの組織で有能な免疫システムを含め、in vitroモデル内の任意のそれに似ています。組織の毎日の洗浄は、これらの組織で生産されたムチンのための自然なアウトレットが9以上が望ましいの確立、正常な粘膜線毛クリアランスを模倣するために行われています...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ＃ </th><th>コメント</th></tr><tr><td>サポニン</td><td>カルビオケム</td><td> 558255 - 25GM </td><td>カルシウムやマグネシウムを含まないD - PBS中の1％は、滅菌フィルタ</td></tr><tr><td> 1 Xダルベッコのカルシウムとマグネシウムとリン酸緩衝食塩水</td><td>ロンザ</td><td> 17 - 513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 Xダルベッコのカルシウムまたはマグネシウムなしでリン酸緩衝食塩水</td><td>ロンザ</td><td> 17 - 515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway抗生物質フリーの組織</td><td>マテック</td><td> AIR - 100 - ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway抗生物質フリーのメンテナンスのメディア</td><td>マテック</td><td> AIR - 100 - MM - ABF </td><td>キットに同梱</td></tr><tr><td> 10Xリン酸緩衝食塩水</td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> 1Xに希釈して使用前に</td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td> JTベイカー</td><td> 2124〜01 </td><td> 1 X PBSおよびオートクレーブで0.1％の最終濃度に追加</td></tr><tr><td> Difco社製GCミディアムベース（チョコレート寒天培地） </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> 500ミリリットルのddH 2 O、60℃まで冷却のオートクレーブ36グラム</td></tr><tr><td> BBLヘモグロビン（チョコレート寒天培地） </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> 60〜クールな500ミリリットルのddH 2 Oでオートクレーブ10グラム、° Cと上記のGC培地のベースとミックス</td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleXの濃縮（チョコレート寒天培地） </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> ° Cおよび再水和IsoVitaleX 10mlを追加し、チョコレート寒天プレートに注ぐ55のGC培地のベースとヘモグロビンの混合物を冷却する</td></tr><tr><td>解剖鉗子、先端の細い、湾曲した</td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td>セルフシール滅菌袋</td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸ゲンタマイシン、10 mg / mlの</td><td>ロンザ</td><td> 17 - 519Z </td><td>殺すゲンタマイシン用EpiAirwayのMMに10マイクロリットル/ mlを追加</td></tr></tbody></table>

長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのepiairwayモデルの利用

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

2、分類不可能なインフルエンザ菌 （NTHi）は呼吸器粘膜1の再発や慢性感染症を引き起こす可能性が人間に適応したグラム陰性細菌である。これらの生物が呼吸組織上および内部に生存するメカニズムを研究するために、細菌やヒトの細胞の成功を長期的な共培養を行うことができるモデルが必要となります。我々は、気液界面、EpiAirwayモデル（マテック、アッシュランド、マサチューセッツ州）に上げ、一次ヒト呼吸器上皮組織を使用してください。これらは、タイトジャンクショ​​ン、繊毛とnonciliated細胞、ムチンを産生、および感染症に反応してサイトカインを産生する能力を保持する杯細胞を含む非不死化、高分化型、3次元の組織です。 人間の上気道の in vitroモデルで 、この生物学的に関連は多くの方法で使用することができ、この方法の全体的な目標は、時間をかけてNTHiと定量細胞に関連すると内面化細菌とEpiAirway組織の長期的な共培養を行うことです。 。同様に、共培養感染のムチン産生とサイトカインプロファイルを決定することができます。このアプローチは、多くの現在のプロトコルで、既存の方法を改良したものを長時間3を介して細菌感染をサポートすることができるではないヒト細胞の水中単層またはトランスウェル培養を、使用してください。生物が覆っている媒体に複製することができるたとえば、、これは実験を逮捕、細胞毒性と宿主細胞の損失の許容できないレベルになることがあります。 EpiAirwayモデルは長期的な宿主 - 病原体相互作用の特性評価が可能になります。さらに、EpiAirwayのソースではなく不死のラインよりも、正常なヒト気管気管支細胞であるため、それぞれの構造でと機能4の両方に実際の人間の上気道組織の優れた表現です。 この方法の場合は、EpiAirway組織は、配信前に2日間の抗微生物及び抗真菌化合物の離乳オフ、およびすべてのプロシージャは抗生物質フリーの条件下で行われています。細菌および初代ヒト組織の両方が同一の生物学的安全キャビネット内で使用されている、と長時間共培養しているので、これは、特別な考慮が必要となる。

このメソッドは、EpiAirways、気液界面で成長させた初代ヒト呼吸器上皮組織、生物学的に関連するとの共培養の拡張細菌の特性評価を可能に<em&gt; in vitroで</em&gt;モデル。アプローチは、長期の共培養に従順であるすべての微生物を使用することができます。

長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用

非定型化インフルエンザ菌（NTHi）は、呼吸器の再発性および慢性的感染症を引き起こす可能性のある、ヒトに適応したグラム陰性菌である。

本実験の全体的な目的は、epi airwayモデルを用い、非定型血性インフルエンザ菌（Nontypeable Hemophilus influenzae：NTHI）とヒト原代呼吸器上皮組織の長期共培養を行うことです。これは、第2段階としてNTHIを頂端面に接種し、細菌を組織に付着および侵入させることで達成されます。インサートは、通常の粘液の流れを模倣し、ムチン廃棄物や細胞破片を除去するため、24時間ごとに予熱したDPBSで洗浄します。次に、任意の時点で組織を回収し、全細胞結合性または内部移行したNTHIの生存率を測定します。最終的に、この手法を用いることで、生菌数に基づいた組織内におけるNTHI生存の菌株特異的な経時的特性を評価することが可能です。この手法は、非型化インフルエンザ菌による長期感染に関する知見を提供することができます。本手法は、Moraxella Alisなどの他のヒト病原体の研究にも利用可能です。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士研究員であるDr.Doinが行いました。輸送プレートをパッケージから取り出し、実験の準備をします。輸送プレートに70% ethanolをスプレーし、プレートをバイオセーフティキャビネット内に設置します。6ウェルプレートの各ウェルに、4 °Cに冷却したEpiAirway維持培地を1 mLずつ分注します。次に、テープを剥がしてプレートを開き、EpiAirwayインサートを覆っているガーゼを取り除きます。ピンセットを用いて、ひねるようにしてインサートをArosから取り出します。必要に応じて、インサートを6ウェルプレートのいずれかのウェルに配置します。滅菌綿棒を使用して、メンブレンに触れないように注意しながら、インサートからエアロスを慎重に取り除いてください。インサートの下に気泡が閉じ込められていないことを確認します。その後、6ウェルプレートをインキュベーターに入れます。インサートの洗浄を毎日次のように行います。カルシウムおよびマグネシウムを含むDPBSを予熱し、チップにDPBSを吸い上げます。次に、滅菌済みのピンセットでインサートをそっと持ち上げ、組織上に予熱したDPBSを200 µLピペッティングします。次に、組織に触れないようにインサートを揺らし、DPBSを均一に分散させます。続いて、インサートを傾け、インサート底部のメンブレンを保持しているプラスチックリングにP 1000ピペットチップを当てます。その後、緩衝液を慎重に吸引し、後で解析するためにクライオチューブに移します。最後に、底層の維持培地を吸引し、1 mLの新鮮な培地と交換します。カルシウムおよびマグネシウム含有DPBSをさらに予熱しておきます。予熱したDPBS 3 mLを15 mLチューブに加え、チョコレート寒天培地で一晩培養したnon-typeable influenza（非型インフルエンザ菌）またはNTHIの単一コロニーをそのチューブ内で再懸濁します。チューブを10秒以上激しくボルテックスし、光学的密度を測定します。細菌濃度がOD 600 nmで約0.7に達するまで、NTHIの単一コロニーを追加し続けます。次に、前述と同様に各EPI気道インサートをあらかじめ温めておいたDPBSで洗浄し、各インサートの頂端面に細菌懸濁液を28 µL添加します。基礎維持培地への接種を避けます。その後、プレートをインキュベーターに戻してNTHIを定量します。まずチョコ agarプレートを予熱し、次に表面を乾燥させます。次に、0.1%ゼラチン含有滅菌PBSまたはPBSGを用いて、NTHI接種液を段階希釈します。接種液を10 µLずつプレートに滴下し、5% CO2条件下、37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、各滴下に15～30個の独立したコロニーが形成されている希釈段をカウントし、NTHIの実際の生存接種量に換算して1 mLあたりのCFUを算出し、細胞結合細菌の総数を回収します。エピエアウェイの頂端面を、カルシウムおよびマグネシウム不含のDPBS 200 µLで3回洗浄します。次に、インサートを傾け、基底膜に残っているメンテナンス培地を洗い流します。洗浄したインサートを新しい6ウェルプレートに移し、各組織の頂端面に滅菌済みの1%サポニン溶液を250 µL加えます。プレートをインキュベーターに戻し、10分間インキュベートします。連続希釈用のチューブを準備し、各希釈チューブに 900 µL の PBSG を充填します。次に、P 1000 ピペットチップを用いて、組織を往復運動でメンブレンから擦り取り、続いて円を描くように動かしてインサートの端から組織を除去します。その後、滅菌済みの大口径 P 1000 ピペットチップを使用して、懸濁液を空の 1.5 mL エッペンドルフチューブに移します。次に、インサートの頂端面に250 µLのDPBSを加え、倒立位相差顕微鏡でインサートを観察して、回収すべき組織が残っていないか確認します。懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、500 µLのDPBSを加えて激しく混合します。細胞懸濁液を1分間ボルテックスします。次に、26ゲージの針を装着した滅菌済みの1 mLシリンジを使用します。針を通して懸濁液をシリンジ内に吸引します。気泡が入らないように注意しながら、懸濁液をゆっくりと3回針に通します。その後、懸濁液をさらに1分間激しくボルテックスします。次に、大口径のピペットチップを使用して、懸濁液 100 µL を最初の希釈チューブに移します。チューブを5秒間激しくボルテックスし、10倍段階希釈を行い、希釈液をチョコレート寒天培地に滴下します。その後、内部に取り込まれた細菌を回収するため、プレートを37 °C、5% carbon dioxideの条件下で一晩インキュベートし、生菌数を測定します。各インサートを200 µLのDPBSで3回洗浄します。底面の維持培地を100 µg/mLのゲンタマイシン硫酸塩を含む培地に交換し、さらに300 µLのゲンタマイシン含有維持培地を頂端面に添加します。インサートをインキュベーターに戻して1時間静置し、その間にDPBSを予熱しておきます。次に、頂端面からゲンタマイシン含有維持培地を除去します。その後、インサートの頂端面と基底膜を予熱したDPBSで十分に洗浄します。最後に、本図で示す内部移行した細菌の段階希釈および平板培養を行う前に、先ほど実演した洗浄および回収の手順を繰り返します。左側の非感染気道上皮組織と、右側のNTHI感染5日後の気道上皮組織の走査電子顕微鏡画像を比較します。NTHIとの長期共培養では、頂端組織に重大な損傷が生じないことが確認でき、気道上皮モデルの有用性が強調されています。ここでは、上皮気道共培養中の時間経過に伴うNTHIの細胞内取り込み数を示すグラフを示します。R 2 8 6 6株を、1インサートあたり約1×10⁷ CFUで接種しました。その後、各指定の時間において細胞内にとり込まれた細菌を回収し、計数しました。このビデオを視聴することで、A PREモデルを用いて、NTHIと初代ホルモン呼吸器組織の長期共培養を行う方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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学ぶEpiAirwayモデルを用いた長期宿主-病原体相互作用の特徴付け方法。NTHIとヒト気道上皮組織の共培養により、細菌の生存と挙動を評価し、呼吸器感染症の治療開発に有用な知見を得ることができます。

長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用

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