マウス胎児の血管系を標識する方法

本実験の目的は、特定の遺伝子変異が血管の発達および構造に及ぼす影響を明らかにすることです。まず、胚と胚外組織をまとめて解剖し、注入に適したサンプルを準備します。次に、顔面静脈に蛍光色素を注入し、完全な血管系を標識します。

次に、胚を解析に備えて調製します。最後に、ラベル化された血管のホールマウントまたは切片を作成し、免疫蛍光顕微鏡法によるホールマウントまたは組織切片の観察に基づき、正常な血管の三次元構造を示す画像を得ます。私がこの手法を考案したのは、末梢血管が血管新生を介して胸腺に接続する発生上の時点を特定することに関心を持ったときでした。

まず、1.5 mLのエッペンドルフチューブにFXI dextranまたはGS L one I selectin B four in PBSを調製します。FXI dextranには100 µLの1.25 mM fast green PBSストック溶液を、GS L one I select B fourには180 µLを加え、溶液が目視で青色になるようにします。次に、チューブを37 °Cに加温します。

E 14.5からE 18.5の胚と卵黄嚢を、アレン組織（Allen Toic stalk）を保持したまま同時に解剖します。胚を新しいシャーレに移し、室温のPBSに浸します。次に、胚を配置して顔面の正中矢状面からのビューを得ます。

次に、マイクロ解剖鉗子を使用して、胚の頭部をそっと掴みます。30ゲージの針を用い、針先を後頭部に向けて、FXI dextranまたはGS L one I selectin B fourを50 µL顔面静脈に注入します。染料が臍静脈に見えたら、針を抜き、胚を卵から分離します。

胚を室温のPBSに2〜3分間浸し、染料を胚全体に行き渡らせます。染料が胚全体に循環した後、肢、背部、および腹部の領域から皮膚サンプルを採取します。

皮膚サンプルを冷PBSで洗浄し、4%パラアルデヒドPBSで2時間固定します。その後、2 mLの冷PBSを入れた4 mLのクリアバイアルを用いて、10分間の洗浄を3回行います。皮膚サンプルを顕微鏡スライドに載せ、各スライドに100 µLのマウンティング液を加え、カバーガラスを被せます。

スライドを暗所で乾燥させます。その後、BABBによる透明化処理を行い、続いて共焦点顕微鏡観察を行うことで、皮膚血管系のより高解像度な画像を得ることができます。凍結切片作成用に組織を準備するには、胚全体を液体窒素で急速冷凍します。セクションブロックにOCTを塗布し、胚をマウントします。

凍結組織を10 micronの厚さに切断し、スライドガラス上に回収します。切片をアセトンで5〜10分間固定し、次いで湿潤箱内で冷TBSを用いて3回洗浄した後、TBSに10%Donkey serumを添加した溶液でブロッキングします。室温にて、各切片に100 microlitersの一次抗体を添加します。

この例では、内皮細胞を標識するためにラット抗US CD 31を、血管周囲細胞を標識するためにヤギ抗US P-D-G-F-R betaを使用し、抗体が切片全体に均一に広がるようにします。個別に切ったパラフィルムのストリップでスライドを覆います。スライドを湿度チャンバーに入れ、4 °Cで1時間から一晩インキュベートします。

次に、切片を冷TBSで3回洗浄します。適切な二次抗体100 µLと共に、最低30分間インキュベートします。最後に、冷TBSで3回洗浄し、各スライドに封入剤100 µLとカバーガラスを加えます。

スライドを暗所で乾燥させます。振動切片（vibram sectioning）を行う場合は、胚から胸腺葉を摘出し、冷PBSで洗浄します。組織を4%パラアルデヒドPBSを用い、室温で2時間固定します。

サンプルをPBS Triton Xで洗浄した後、4% low melt agarose PBSを小型プラスチックカートリッジに満たします。サンプルをagarose PBSに浸し、組織がカートリッジの底に接していることを確認してください。氷上でagaroseを凝固させます。

次に、カミソリで余分なアガロースを切り落とします。VIBRAMブロックに接着剤を塗り、サンプルをブロックに接着させます。サンプルとブレードが浸るまで、Vibramウォーターバスに冷えたPBSを注ぎます。

速度と振幅を設定します。振幅は低く設定してください。過剰な撹拌により切片が崩れる場合は、組織を50枚切り出してください。

次にピンセットを用いて、切片を24ウェルマイクロプレート内の冷PBSに移します。PBS Triton Xで希釈した10% donkey serum 500 µLで切片を30分間ブロッキングします。その後、anti CD 31やanti P-D-G-F-R betaなどの一次抗体を加え、カバーをしたマイクロプレートを用いて4 °Cで8時間から一晩インキュベートします。次に、PBS Triton Xで3回洗浄します。なお、一連の工程は4 °Cで合計8時間かけて行います。

切片を再度ブロッキングし、二次抗体でインキュベートした後、4°Cで計8時間かけて、PBS Triton Xでサンプルを3回洗浄します。次に、氷上で4%パラアルデヒドPBSを用いてサンプルを30分間再固定し、さらに氷上で30分かけてPBS Triton Xで3回洗浄します。段階的なメタノールPBS Triton X系列を用いて、各ステップ10分間ずつサンプルの脱水を行います。

次に、100% methanolを新鮮なmethanolに置換し、室温で1時間インキュベートします。試料を凹型ガラススライドに載せ、BABBとmethanolの1:1溶液で試料を覆います。試料を10〜15分間インキュベートします。

次に、溶液を100% BABBに交換し、室温で10〜15分間、または透明になるまでインキュベートします。カバーガラスを載せ、マニキュアを2〜3回塗りして密封します。室温の暗所でマニキュアを硬化させます。

サンプルは4 °Cで保存可能ですが、12〜24時間以内に撮影を行う必要があります。Plan-Apochromat 20x 0.8 対物レンズを用い、633 nm、488 nm、543 nmのレーザーラインを使用して、10 µmの凍結切片を共焦点顕微鏡で撮影します。Plan-Apochromat 10x 0.4 対物レンズを用い、488 nm、543 nm、633 nmのレーザーラインを使用して、50 µmのアガロース包埋切片的切片の1 µm共焦点Zスタック画像を撮影します。Zeiss AIA vision 4.6またはその他の画像解析ソフトウェアを使用して、連続Zセクションを再構成します。胚マウスの血管欠損を評価するには、胚血管の効率的な標識が不可欠です。これらの図は、E16.5の胸腺血管の特異的標識および、GS L1とI-selectinの共標識を示しています。

CD31を用いたB4注入胚および左右心室の染色の様子。これらの実験では、凍結切片用のGSL-1セレクチンB4プロトコルを使用した。本手順に従った、E16.5マウスの皮膚血管ネットワークのホールマウント標識がここに示されている。

間質細胞と血球細胞を血管系とともに共ラベルするなどの他の手法を用いることで、「正常時および病理的条件下において、マウス胚の血球細胞と間質細胞は血管系とどのように相互作用しているのか」といった追加の疑問を解決することが可能です。