Name: マウス胎児の血管系を標識する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶマウス胎児の血管系蛍光標識法。顔面静脈への蛍光色素注入と免疫蛍光顕微鏡を用いて、三次元血管構造を可視化し、遺伝子変異が血管発生に与える影響を解析する技術です。

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この作品は、NIAIDからNRMとJLBにSREBの博士論文フェローシップ賞への助成金番号R01AI055001とR01AI082127によってサポートされていました。

1。フルオレセインデキストランとGSL I -イソレクチンB 4顔面静脈注射は胎児の血管系にラベルを付けるラベルが付い<ol><li>生理食塩水（PBS）またはGSL 1リン酸緩衝FITC -デキストランを（50ug/mL）の準備- 1.5mlのエッペンドルフチューブにPBSでイソレクチンB 4（20ug/200uL）と37℃くらいまで温めC. FITC -デキストラン溶液（総体積1mLの）と株式1.25ファストグリーンの180uL / PBSにGSL 1株1.25ファストグリーン/ PBSの100uL追加-ソリューションが小さくなるようにイソレクチンB 4（合計ボリューム200uL）を、目に見えて青。 </li><li>尿膜茎（臍動脈と静脈が）そのままにして、一緒にE14.5 - E18.5胚と卵黄嚢を解剖。 </li><li>新しいペトリ皿（60 × 15 mm）に胚を移し、室温でPBSでそれらを浸す。 </li><li>頭/顔の矢ビューを提供するために胚を置きます。優しく頭で胚を把握するためにマイクロ解剖ピンセットを使用してください。 </li><li> 30Gの針を使用して、50UL FITC -デキストラン（50ug/mL）またはGSL 1を注入する-イソレクチンB 4（200uLのPBS中20ug）を頭の後ろに向かって針を指す顔面静脈に。 </li><li>染料は、臍静脈に表示されているときに、針を除去し、尿膜茎（臍動脈と静脈）から胚を分離。 </li><li>注射後、胚は、色素が胚全体に循環するように2〜3分間室温でPBS中に残さないように。 </li></ol> 2。皮膚の血管系のホールマウントの解析<ol><li>色素が胚全体に循環させた後、バック、手足の地域から皮膚サンプルを削除し、胃、など8,9。 </li><li>冷PBSで皮膚のサンプルを洗浄し、2時間8,9を4％PFA / PBSで固定してください。 2mLの冷PBSで4mlの透明なバイアルで10分間ずつ3回洗浄する。 </li><li>顕微鏡スライド上に皮膚のサンプルを配置し、各スライドとカバーガラスにマウントメディアの100μlを加える。 </li><li>スライドは暗い記憶領域に乾燥することができます。 </li><li> 2'イメージの取得"セクションに進みます。 </li></ol> 3。凍結切片のための胸腺お​​よび心臓血管系と血管周囲細胞のマルチカラーラベル（セクション1、手順7から続行） <ol><li>液体窒素で"フラッシュフリーズ"全胚。胚は、分析するまでになると-80℃で保存できます。 </li><li>また、、胸腺をばらばらにする4℃のPBSですすぎ、そして2時間2mLの4％パラホルムアルデヒド（PFA）/ PBSで固定してください。冷PBS、OCTでの場所thymusの複数形、および-80℃で使用するまで凍結保存℃で10分間3回洗浄</li><li> cryosectioningの場合は、セクション"ブロック"にOCTを広げ、セクショニングの胚や解剖の臓器/組織をマウントします。 </li><li>厚さ10μmのセクションに凍結組織を切り取り、スライド上に収集する。 </li><li> 5〜10分間アセトンでセクションを修正。冷たいTBSで3回洗浄する。 </li><li>室温で湿度チャンバ内の10％ロバ血清/ TBSでブロックする。 </li><li> 4℃湿度チャンバ内の一次抗体を100μlで1時間、一晩のためのセクションをインキュベート° C：この例では、我々は、ラット抗マウスCD31（1:100）ラベルの内皮へ、そしてヤギ抗マウスPDGFR -βを使用してください（1:100）血管周囲細胞を標識する。それは抗体が均一にセクションにまたがっていることを保証するために個別にカットパラフィルムストリップではスライドをカバーするために有用です。 </li><li>一次抗体とのインキュベーション後、切片を冷たいTBSで3回洗浄する。最短で30分のための適切な二次抗体を100μlとインキュベートする。 </li><li>冷たいTBSで3回洗浄する。各スライドとカバーガラスにマウントメディアの100μlを追加します。 </li><li>スライドは暗い記憶領域に乾燥することができます。 </li><li> "画像取り込み"セクションに進んでください。 </li></ol> 4。ビブラトームセクションの胸腺血管と血管周囲細胞のマルチカラーラベル（セクション1、手順7から続行） <ol><li>胚から胸腺葉を摘出し、冷PBSでリンス。 </li><li> 2時間、室温で4％PFA / PBSで胸腺を修正。 </li><li>アガロース/ PBS（〜4℃）溶融低い4％の小さなプラスチック製のカートリッジと水没のPBS -トリトンX（0.15％）3回、10分および場所のthymusの複数形で洗う。胸腺は、カートリッジの底部に接触している必要があります。 </li><li>アガロースが氷（3〜5分）で固化することができます。余分なアガロースを遮断するカミソリの刃を使用。ビブラトームブロックに接着剤を追加し、ブロックするためにサンプルを付着する。 </li><li>サンプルとブレードが浸されるまでビブラトームの水浴に冷PBSを追加。 </li><li>速度を設定し、振幅（高振幅、低中程度の速度はソフト胸腺のセクションに理想的です）。のセクションでは、過剰な攪拌による解散場合振幅が低減されるべきである。 </li><li> 50人のUMセクションをカット。 </li><li>絵筆を使って、冷PBSで24ウェルマイクロプレートのセクションを収集する。 </li><li> 30分間PBS -トリトンX（0.15％）の10％ロバ血清を500μlのブロックのセクション。 </li><li>などの一次抗体と一晩に8時間、切片をインキュベート抗CD31および抗PDGFR -β、覆われた24ウェルマイクロプレートインチ</li><li> 4℃8時間の合計℃以上PBS -トリトンX（0.15％）で3回洗浄する</li><li> 30分間PBS -トリトンX（0.15％）の10％ロバ血清中のブロックのセクションを参照してください。 </li><li> 4℃との適切な二次抗体で一晩に8時間のためのセクションをインキュベートする。 </li><li> 4℃8時間の合計℃以上PBS -トリトンX（0.15％）で3回洗浄する</li><li> 4％PFA / PBSで再修正のサンプルを氷上で30分間。 </li><li>氷上で30分間にわたってPBS -トリトンX（0.15％）で3回洗浄する。 </li><li> 25パーセントメタノール、50％メタノール、75％メタノール、および各ステップのための10分で100％のメタノール：等級メタノール/ PBS -トリトンXシリーズを通して試料を脱水する。 10分後に新鮮なメタノールと100％のメタノールを交換し、室温で1時間インキュベートします。 </li><li> 1:2の比率で：ガラス容器、ミックスBABB（安息香酸ベンジルベンジルアルコール）で。 50％のBABBと50％のメタノールの最終濃度MeOHでBABBを組み合わせる。 10〜15分のMeOH：BABBのサンプルをインキュベートする。 </li><li>室温で、10〜15分間またはクリアされるまで100パーセントBABBとインキュベートしたガラス容器にサンプルを移す。 </li><li>新鮮な100％BABBでうつ病のスライド（0.7ミリメートルの深さ）を記入し、側にサンプルを移す。マニキュアの2-3コートとガラス（第1.5）とシールをカバーに追加します。室温で暗所で固めるにマニキュア爪を許可し、4でサンプルが格納℃に 注：スライドが完全に共焦点画像の取得前に封印されている必要があります。蛍光色素はBABBでフェードインできるように画像は、12〜24時間以内に取得しておく必要があります。 </li><li> "画像取り込み"セクションに進んでください。 </li></ol> 5。画像の取得<ol><li>画像10μmの488プラン-アポクロマート20X/0.8目標（512 × 512ピクセル）を使用して共焦点顕微鏡で凍結切片- （FITC-dextran/GSL 1 -イソレクチンB 4）、543 - 、、633 nmのレーザーラインが。 </li><li>共焦点取得全体のマウントの皮膚と50μmの488プラン-アポクロマート10X/0.4目的を（512 × 512ピクセル）を使用してアガロース包埋切片のzセクション- （FITC-dextran/GSL 1 - B 4イソレクチン）、543 - 、 、633 nmのレーザーライン。シリアルZ -セクションは、それぞれのチャネルに対して1ミクロンで連続して収集する必要があります。 </li><li>ツァイスAxioVisionの4.6または他の画像解析ソフトウェアを使用してシリアルZ -セクションを再構築。 </li></ol> 6。代表的な結果： 胚の血管系の効率のよいラベリングには、マウス胎児の血管の欠陥を評価するために重要です。図1は、それぞれ、右と左心室（1E - F）の染色に加えて、CD31（1B）で特定のE16.5胸腺の血管（1A - B）のラベルとの共同ラベルを示しています。 GSL I -イソレクチンBなどのセクション1,3、および5に記載された凍結切片のための4プロトコルは、これらの実験で使用されていた。ホールマウントのE16.5マウスの皮膚の血管のネットワークのラベル、セクション1、2に記載されているプロトコルを使用して、そして5は図1C - Dに示されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3267/3267fig1.jpg"> 1凡例を示しています。 FITC GSL I - E16.5マウス胚にイソレクチンB 4顔面静脈注射。胎児の皮膚の血管系は、次の注射の注射後の胚の胸腺のA.の凍結切片。イソレクチンB 4とCD31の共ラベルのB.マージします。c.及び d.ホールマウント。E.と胎児心eのfの凍結切片（右心室）F.（左心室）、次の注入。

<ol><li>Cuddihy, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-mediated+cross-talk+within+the+neonatal+murine+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus.</a> Blood. 113, 2723-2731 (2009).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+of+VEGF-A+in+thymus+epithelium+disrupts+thymus+blood+vessel+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+origin+of+perivascular+mesenchyme+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).</li>
<li>Foster, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neural+crest-derived+cells+in+the+embryonic+and+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+CCR7-+and+CCR9-mediated+chemokine+signals+in+prevascular+fetal+thymus+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization.</a> Blood. 108, 2531-2539 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+critical+for+maintenance+of+the+adult+coronary+vasculature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice.</a> J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

セクションの全体のマウントおよびPECAM - 1（CD31）染色は、マウス胎児の血管系を標識するための従来の方法です。これらのメソッドは、直接および/または間接免疫蛍光法、およびマウスの組織を透過性に洗剤を使用する必要があります。これはかなりタイムリーなプロセスであることが分かる。ここで、我々はそれによって抗体のラベリング手順の必要性を取り除きました、B 4顔面静脈注射は直接胚の血管系にラベルを付けるためにFITC -デキストランまたはイソレクチンを採用している。 &quot;漏れ&quot;表現型がこのメソッドではなく、従来の抗体染色法によって明らかにされるとさらに、この方法は、血管系の機能状態を評価することができます。 我々は、胚の胸腺のセクションを分析し、心臓だけでなく、まもなく顔面静脈注射後の皮膚の血管系の全体のマウントでは、この手法の効率性を検証しています。さらに、我々はCD31以下FITC -デキストランまたはそのFITCは特に胚の血管構造を標識する実証するためにイソレクチンB 4注射のためのステンド胸腺セクションがあります...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> FITC -デキストラン</td><td>シグマ</td><td> FD150S - 1G </td></tr><tr><td> GSL 1のラベルフルオレセイン-イソレクチンB 4 </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> FL - 1201 </td></tr><tr><td>速いグリーン</td><td> MPのバイオメディカル</td><td> 195178 </td></tr><tr><td> PFA </td><td>フルカ</td><td> 76240 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S11550 </td></tr><tr><td>最適な切削温度化合物（OCT </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td>アセトン</td><td> JTベーカー</td><td> 9006〜33 </td></tr><tr><td>ロバ血清</td><td>ジャクソン</td><td> 017-000-121 </td></tr><tr><td>ラット抗マウスCD31、 </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 558736 </td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスPDGFR -β </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> AF1042 </td></tr><tr><td>ロバ抗ラットCD31アレクサ647（Invitrogen社） </td><td> Biolegend </td><td> 102516 </td></tr><tr><td>ロバ抗ヤギアレクサ594（Invitrogen社） </td><td>インビトロジェン</td><td> A11058 </td></tr><tr><td>トリトンX -100 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> X - 100 </td></tr><tr><td>低融点アガロース/ PBS </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A9414 - 25G </td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> A413 - 4 </td></tr><tr><td>ベンジルアルコール</td><td>アクロスサイエンティフィック</td><td> 148390010 </td></tr><tr><td>安息香酸ベンジル</td><td>アクロスサイエンティフィック</td><td> 105860010 </td></tr><tr><td>うつ病のスライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> S175201 </td></tr><tr><td> Fluorogel </td><td>電子顕微鏡学</td><td> 17985〜10 </td></tr><tr><td>カバーガラス（22X22）-1.5 </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 152222 </td></tr><tr><td>ツァイスLSM 510メタ共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td></tr><tr><td>ミクロ解剖鉗子</td><td> Roboz </td><td> RS - 5135 </td></tr><tr><td>パラフィルム番号OM992 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 13-374-16 </td></tr><tr><td> 12および24ウェルマイクロプレート</td><td>エバーグリーンサイエンティフィック</td><td> 222 - 8044 - 01F </td></tr><tr><td> Superfrost /プラス顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> 4mlの透明バイアル</td><td>国立科学</td><td> B7800 - 2 </td></tr></tbody></table>

マウス胎児の血管系を標識する方法

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

機能的な血管のネットワークの設立は、器官形成の本質的な部分であり、そして最適な臓器の機能に必要です。例えば、胸腺適切な血管の形成とパターニングに臓器と周辺への成熟T細胞の出口への胸腺細胞のエントリには不可欠です。胸腺の血管の空間的な配置は、局所微小環境からの信号、すなわち胸腺上皮細胞（TEC）に依存します。いくつかの最近の報告では、胸腺血管の欠陥の1,2にこれらの信号の結果のその中断を示唆している。これまでの研究では、新生児と成人の胸腺の血管系の1,2にラベルを付けるために使用されるテクニックを説明してきました。ここでは、胎児胸腺内の血管を標識するためのテクニックを示しています。このメソッドは、FITC -デキストランまたはGriffonia（Bandeiraea）SimplicifoliaレクチンI（GSL 1 -イソレクチンB 4）の使用を組み合わせて顔の静脈注射とCD31抗体染色胸腺血管構造と胸腺の血管周囲の間充織3-5をラベル付けするためにPDGFR -βを識別する。凍結切片またはビブラトームセクションを使用するオプションも用意されています。このプロトコルは、胸腺血管形成にTEC -由来分子の役割を定義するために重要な胸腺血管の欠陥を、識別するために使用することができます。メソッドが全体の血管をラベルとして、それはまた、皮膚や心臓60から10を含む胚全体の複数の臓器や組織に血管のネットワークを分析するために使用することができます。

この記事では、胚性皮膚や胸腺、血管を標識する方法を説明します。

機能的な血管ネットワークの構築は、器官形成における不可欠な要素であり、最適な器官機能の維持に必要です。例えば、...

本実験の目的は、特定の遺伝子変異が血管の発達および構造に及ぼす影響を明らかにすることです。まず、胚と胚外組織をまとめて解剖し、注入に適したサンプルを準備します。次に、顔面静脈に蛍光色素を注入し、完全な血管系を標識します。次に、胚を解析に備えて調製します。最後に、ラベル化された血管のホールマウントまたは切片を作成し、免疫蛍光顕微鏡法によるホールマウントまたは組織切片の観察に基づき、正常な血管の三次元構造を示す画像を得ます。私がこの手法を考案したのは、末梢血管が血管新生を介して胸腺に接続する発生上の時点を特定することに関心を持ったときでした。まず、1.5 mLのエッペンドルフチューブにFXI dextranまたはGS L one I selectin B four in PBSを調製します。FXI dextranには100 µLの1.25 mM fast green PBSストック溶液を、GS L one I select B fourには180 µLを加え、溶液が目視で青色になるようにします。次に、チューブを37 °Cに加温します。E 14.5からE 18.5の胚と卵黄嚢を、アレン組織（Allen Toic stalk）を保持したまま同時に解剖します。胚を新しいシャーレに移し、室温のPBSに浸します。次に、胚を配置して顔面の正中矢状面からのビューを得ます。次に、マイクロ解剖鉗子を使用して、胚の頭部をそっと掴みます。30ゲージの針を用い、針先を後頭部に向けて、FXI dextranまたはGS L one I selectin B fourを50 µL顔面静脈に注入します。染料が臍静脈に見えたら、針を抜き、胚を卵から分離します。胚を室温のPBSに2〜3分間浸し、染料を胚全体に行き渡らせます。染料が胚全体に循環した後、肢、背部、および腹部の領域から皮膚サンプルを採取します。皮膚サンプルを冷PBSで洗浄し、4%パラアルデヒドPBSで2時間固定します。その後、2 mLの冷PBSを入れた4 mLのクリアバイアルを用いて、10分間の洗浄を3回行います。皮膚サンプルを顕微鏡スライドに載せ、各スライドに100 µLのマウンティング液を加え、カバーガラスを被せます。スライドを暗所で乾燥させます。その後、BABBによる透明化処理を行い、続いて共焦点顕微鏡観察を行うことで、皮膚血管系のより高解像度な画像を得ることができます。凍結切片作成用に組織を準備するには、胚全体を液体窒素で急速冷凍します。セクションブロックにOCTを塗布し、胚をマウントします。凍結組織を10 micronの厚さに切断し、スライドガラス上に回収します。切片をアセトンで5〜10分間固定し、次いで湿潤箱内で冷TBSを用いて3回洗浄した後、TBSに10%Donkey serumを添加した溶液でブロッキングします。室温にて、各切片に100 microlitersの一次抗体を添加します。この例では、内皮細胞を標識するためにラット抗US CD 31を、血管周囲細胞を標識するためにヤギ抗US P-D-G-F-R betaを使用し、抗体が切片全体に均一に広がるようにします。個別に切ったパラフィルムのストリップでスライドを覆います。スライドを湿度チャンバーに入れ、4 °Cで1時間から一晩インキュベートします。次に、切片を冷TBSで3回洗浄します。適切な二次抗体100 µLと共に、最低30分間インキュベートします。最後に、冷TBSで3回洗浄し、各スライドに封入剤100 µLとカバーガラスを加えます。スライドを暗所で乾燥させます。振動切片（vibram sectioning）を行う場合は、胚から胸腺葉を摘出し、冷PBSで洗浄します。組織を4%パラアルデヒドPBSを用い、室温で2時間固定します。サンプルをPBS Triton Xで洗浄した後、4% low melt agarose PBSを小型プラスチックカートリッジに満たします。サンプルをagarose PBSに浸し、組織がカートリッジの底に接していることを確認してください。氷上でagaroseを凝固させます。次に、カミソリで余分なアガロースを切り落とします。VIBRAMブロックに接着剤を塗り、サンプルをブロックに接着させます。サンプルとブレードが浸るまで、Vibramウォーターバスに冷えたPBSを注ぎます。速度と振幅を設定します。振幅は低く設定してください。過剰な撹拌により切片が崩れる場合は、組織を50枚切り出してください。次にピンセットを用いて、切片を24ウェルマイクロプレート内の冷PBSに移します。PBS Triton Xで希釈した10% donkey serum 500 µLで切片を30分間ブロッキングします。その後、anti CD 31やanti P-D-G-F-R betaなどの一次抗体を加え、カバーをしたマイクロプレートを用いて4 °Cで8時間から一晩インキュベートします。次に、PBS Triton Xで3回洗浄します。なお、一連の工程は4 °Cで合計8時間かけて行います。切片を再度ブロッキングし、二次抗体でインキュベートした後、4°Cで計8時間かけて、PBS Triton Xでサンプルを3回洗浄します。次に、氷上で4%パラアルデヒドPBSを用いてサンプルを30分間再固定し、さらに氷上で30分かけてPBS Triton Xで3回洗浄します。段階的なメタノールPBS Triton X系列を用いて、各ステップ10分間ずつサンプルの脱水を行います。次に、100% methanolを新鮮なmethanolに置換し、室温で1時間インキュベートします。試料を凹型ガラススライドに載せ、BABBとmethanolの1:1溶液で試料を覆います。試料を10〜15分間インキュベートします。次に、溶液を100% BABBに交換し、室温で10〜15分間、または透明になるまでインキュベートします。カバーガラスを載せ、マニキュアを2〜3回塗りして密封します。室温の暗所でマニキュアを硬化させます。サンプルは4 °Cで保存可能ですが、12〜24時間以内に撮影を行う必要があります。Plan-Apochromat 20x 0.8 対物レンズを用い、633 nm、488 nm、543 nmのレーザーラインを使用して、10 µmの凍結切片を共焦点顕微鏡で撮影します。Plan-Apochromat 10x 0.4 対物レンズを用い、488 nm、543 nm、633 nmのレーザーラインを使用して、50 µmのアガロース包埋切片的切片の1 µm共焦点Zスタック画像を撮影します。Zeiss AIA vision 4.6またはその他の画像解析ソフトウェアを使用して、連続Zセクションを再構成します。胚マウスの血管欠損を評価するには、胚血管の効率的な標識が不可欠です。これらの図は、E16.5の胸腺血管の特異的標識および、GS L1とI-selectinの共標識を示しています。CD31を用いたB4注入胚および左右心室の染色の様子。これらの実験では、凍結切片用のGSL-1セレクチンB4プロトコルを使用した。本手順に従った、E16.5マウスの皮膚血管ネットワークのホールマウント標識がここに示されている。間質細胞と血球細胞を血管系とともに共ラベルするなどの他の手法を用いることで、「正常時および病理的条件下において、マウス胚の血球細胞と間質細胞は血管系とどのように相互作用しているのか」といった追加の疑問を解決することが可能です。

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Research

JoVE Journal

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このプロトコルは、脈管構造を視覚化し、 Xenopus tropicalisにおけるその複雑性を定量化する蛍光ベースの方法を実証する。インビボでの心臓血管発達を研究するために、遺伝的および/または薬理学的操作の後、胚の拍動する心臓に蛍光色素を注入した後、数分後に血管を撮像することができる。...

の胚性血管新生の可視化と定量分析<em&gt;ツメガエル</em

この研究は、顕微鏡観察のための全マウント組織調製に続く、乳房脂肪パッド移植による血管内皮幹細胞（VESC）の増殖、分化および血管形成能を評価するための新規アプローチを実証する。 インビボでのVESCの挙動を調べる系統的な追跡戦略も提示される。...

血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術

心エコー検査は、マウスで多用されます。高価な高分解能超音波デバイスは、この目的のために開発されています。このプロトコルでは、心臓形態を決定する組織学的形態計測学的解析と組み合わせて現実的な心エコー手順について説明します。...

マウスの心臓形態の心エコー検査・組織学的検討

心室固有 MLC 2 v tdTomato レポーター ノックアウトのマウスから解剖マウス胚全体のマウント epifluorescent...

落射蛍光マウント全体を用いたマウス胚発生中に心臓商工会議所発展の分析

本稿は、DiI の心臓灌流を固定で希釈し、メダカ (Oryzias latipes) をモデルとして使用し、脳と下垂体組織に焦点を当てて、teleost...

DiI による心灌流を用いた Teleost 脳および下垂体の血管の標識

脳血管機能障害のモデルとして、マウスに大血管拡張を化学的に誘導することを実証し、血管性認知症やアルツハイマー病のモデリングに用いることができます。また、シリコーンゴムコンパウンドを注入して血管系を可視化し、血管サイズの変化を測定するための明確な視覚的ガイダンスを提供する方法も示しています。...

マウスのドリコ拡張症を誘発するための視覚的アプローチによる大血管媒介性脳血管機能障害のモデル化

このプロトコルは、ライトシート蛍光顕微鏡を使用した定量的なホールマウント3次元血管イメージングの迅速な方法を導入します。この方法の有効性は、ニワトリ胚モデルの咽頭アーチ動脈系を使用して実証され、血行動態の力は計算流体力学 によって...

定量的研究のための小動物血管系の迅速なホールマウント高分解能イメージング

学ぶマウス胎児の血管系蛍光標識法。顔面静脈への蛍光色素注入と免疫蛍光顕微鏡を用いて、三次元血管構造を可視化し、遺伝子変異が血管発生に与える影響を解析する技術です。

マウス胎児の血管系を標識する方法

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