Name: ミッションターゲットIDのライブラリを使用してmiRNAのターゲットのゲノムワイドスクリーン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぶ miRNAターゲットのゲノムワイドスクリーニング法。Target IDライブラリを用いたハイスループット解析により、安定細胞株の樹立とガンシクロビル選択を組み合わせ、特定のマイクロRNA標的を同定します。

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私たちは彼女のサポートと有益なトラブルシューティングの議論に参加するため、特に全体のシグマライフサイエンスミッションのターゲットIDライブラリの開発チームは、技術を発見し、ライセンス条件を交渉するためのケビンGutshallと、ヘザーHolemonに感謝します。我々はまた、自由にそれがクローニングされ得ることに大きなcDNAのバッチとその持続性を準備するために未発表の結果と提案、RxBiosciencesのQaziハミドを共有するためにロンドン大学キングスカレッジの博士ヨープGäkenに感謝します。我々は、cDNA配列とデータ解析を行うためのSAFCからナン·リンスコット·バハルに感謝します。 ミッションは、シグマアルドリッチバイオテクノロジーLPの登録商標です。

<ol><li>Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigma-aldrich.com">http://www.sigma-aldrich.com</a> (2012).</li>
<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li>
<li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li>
<li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperately+seeking+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li>
<li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li>
<li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li>
<li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li>
<li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-221+and+miR-222%2C+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas%2C+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noncoding+RNA%2C+miR-126%2C+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chrom.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li>
<li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li>
<li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.</li>
<li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620(2009).</li>
<li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8%2F200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li>
<li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP%5BTitle%5D)+AND+%22L.+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li>
<li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li>
</ol>

作者は、提出された作品に関心を持っている営利団体と金銭的関係を宣言します。

マイクロRNAは、mRNAの翻訳を阻害することにより転写後に遺伝子発現を調節すると、頻繁に、標的mRNAを（[6]日）不安定に20から24ヌクレオチドのRNAである。単一のmiRNAは、開発と環境シグナルに対する細胞の応答を制御するために数百のmRNAを調節することができます。標的mRNAを識別し、検証することで、これらの経路におけるmiRNAの役割と機能を決定する上で不可欠である。動物のmiRNAとその標的部位に完全に相補的ではありませんが、しかし、ターゲットの同定は簡単ではありません。 &quot;シード&quot;領域は、miRNAの5 &#39;末端から2〜7を基づいており、通常、そのターゲットに相補的である。しかし、そこに種子のルールには多くの例外があり、塩基対下流には、不完全種子の一致を補正することができます。コンピュータアルゴリズムの数は、シード·マッチングと下流の補償、ターゲット構造に基づいてmiRNAのターゲットを予測するために開発されているDポジション、シーケンスの保全、実験的に検証ターゲット（[7]で検討）のために観察されている他のさまざまなパラメータを設定します。インシリコ予測に便利であると識別多くの有効なmiRNAのターゲットを実行しながら、ほとんどの遺伝子は実験的な検証テストに失敗すると予測し、多くの実際の目標は、予測されていません。コンピュータのアルゴリズムは以前に決定され、ターゲットの機能に基づいているためさらに、彼らは既に知られているものから逸脱してターゲットの検出を許可しません。 実験的なシステムの数が生きている細胞内で機能的なmiRNAのターゲットを識別または発見するために首尾よく使用されています。これらのグローバルなスクリーニング法は、マイクロアレイとRNA配列、RNAの共免疫沈降法（RIP）、および細胞培養におけるアミノ酸と安定同位体標識（SILAC）、プロテオミクスの方法（[7]件）が含まれています。各メソッドには、長所と短所があります。標的miRNAはしばしばmRNAを不安定化し、その劣化、損失oにつながるので、それぞれのmiRNAを模倣または阻害剤を導入した後、mRNAレベルでのRゲインは、miRNAのターゲットを識別することができます。 mRNAのこの損失または利得を容易にマイクロアレイまたはディープシークエンシングにより検出されます。 mRNAの検出方法が簡素化され、タンパク質の検出法よりも高感度であるが、mRNAの検出が劣化しない任意のmiRNAのターゲットを欠場する。 SILACからのもの[8]またはリボソームプロファイリングでのRNA検出からmiRNAのターゲットの結果を比較するバーテルラボからの最近のレポート[9]は、哺乳動物のmiRNAが主にターゲットのmRNAレベルを減少させることによって行動することを示しています。ただし、個々のmiRNAのターゲットでの作業、他の多くのラボでは、蛋白質の変化がmRNAレベルの変化なしを検出した。検出可能なmRNAの損失と翻訳調節と思われるものの報告は、次のとおりです。のmiR-10bがPDCD4でHOXD10 [10]、p27kip1にmiR221/222 [11]、miR-21のp85β[13] [12]は、miR-126を、SIRT1上でのmiR-34 [14] PTEN [15]、のmiR - 中継台Arid4bの[16]は、miR-200C JAG1の[17]、およびmiR-299、297、567、上に、miR-21のVEGFA上のND 609 [18]。また、クランシーら[19]最近のlet - 7の標的部位を含む個々のmRNAアイソフォームが選択的に検出されたときにlet-7による翻訳調節にのみ検出されたことを報告した。すべてのmRNAアイソフォームが1つのmRNAとして検出されたときにそれがある - - として多くのマイクロアレイおよび塩基配列の解析で得られた後者は、少なくともいくつかのケースでは、並進規制が複合プロファイルに見落とされる可能性があることを示唆している。アルゴノート（通常は新生血管傷害）または他の関連タンパク質（RNA免疫沈降、またはRIP）を介してのmiRNA-mRNAの複合体の共免疫沈降に関係なく、調節機構のmiRNAターゲットを分離します。さらに、RIPは、相互作用を内在し、おそらく生物学的に関連が検出されます。しかし、それはすべてのmiRNA-mRNAの相互作用が機能的であり、RIPだけ一時的に関連付けたり、急速に劣化しているすべてのmRNAターゲットを逃すかどうかは知られていない。さらに、特異的なmiRNA-mRNAのパートナーはbioinformatiを推測する必要がありますすべてのmiRNA-mRNAのペアが一緒に共沈自動的ので。最後に、SILACは直接miRNAの調節、タンパク質自体の最終的な製品を識別しますが、小文字は区別されませんので、希少なタンパク質とタンパク質レベルの小さな倍の変化を蹴る。 現在のmiRNAのターゲット同定法の制限の光の中で、我々は別のメカニズムによって機能的なmiRNAのターゲットを識別するための追加のグローバルアッセイが必要になったと感じました。このニーズを満たすために、我々は、ヨープGakenとロンドン大学キングスカレッジのアジムMohamedaliによって発明された技術をライセンスされています。彼らの発明は、二重の選択融合タンパク質であり、具体的には、チミジンキナーゼゼオシン融合、その3&#39;UTRにおける潜在的なmiRNAの標的配列のcDNAライブラリーで規制。 図2に示すように安定TKzeo-cDNA構築物でトランスフェクトした細胞と発現しているが、ゼオシンで選択することができます。興味のあるmiRNAを発現した後、そのmiRNAのの目標は、wiを選択することができます図3に示すように、ガンシクロビル番目。ガンシクロビルは、任意の細胞が関心のmiRNAのターゲットを欠いているTKzeo-cDNAを発現しているチミジンキナーゼを発現する細胞を殺す。標的cDNAは脇腹cDNAおよびPCR産物はターゲットを識別するために配列決定することができますガンシクロビルを使用してプライマーを生き残る細胞からのDNAのPCR増幅により単離することができる。 ミッションのターゲットIDライブラリ - 我々は機能的なヒトmiRNAターゲットのグローバルな識別と発見のための新しいツールにキングス·カレッジ·テクノロジを開発しました。ターゲットIDのライブラリを使用すると、ユーザーは、哺乳動物細胞培養、トランスフェクションと薬剤選択の一連の手順によってmiRNAのターゲットを特定することができます。ライブラリは、包括的であり、ヒト遺伝子の66から79パーセントが含まれています。初期の結果は、両方の前に発見されたほか、新たな目標は、ミッションのターゲットIDライブラリから単離することができることを示しています。 プロトコルは、いくつかの長さですが、哺乳動物細胞培養、トランスフェクション、薬剤選択、PCRおよびシークエンシング - - ターゲットIDのライブラリの使用は標準的な分子生物学研究室の技術を必要とするため、ほとんどの生物学者の手段の範囲内でなければなりません。我々は十分な注意が培養条件を最適化し、適切な実験デザインに支払われ、そして最も重要なのは、ターゲットIDのライブラリと成功を確実にするための選択の手順を実行する（kill-曲線）に最適な薬物濃度を決定するために、各セルの新しいタイプを事前にテストされることを示唆している。 すべてのmiRNAのターゲットの識別方法と同様に、それは非常にターゲットIDのライブラリーをスクリーニングすることによって識別されるターゲットは、マイクロアレイ、定量RT-PCR、レポーターアッセイ（すなわち、ルシフェラーゼ）、またはウェスタン分析などの二番目の方法、使用して検証することをお勧めします。

<table border="1" ><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> JumpStartのREDTaq ReadyMix </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td>ガンシクロビル</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> TOPO TA </td><td>インビトロジェン</td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td>哺乳類のゲノムDNA MiniprepキットをGenElute </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td>細胞特異的ヌクレオのkそれ</td><td>ロンザ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>のNucleofector </td><td>ロンザ</td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td>ゼオシン</td><td>インビトロジェン</td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1">ターゲットidライブラリ</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

ミッションターゲットidのライブラリを使用してmirnaのターゲットのゲノムワイドスクリーン

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

ターゲットIDのライブラリは、マイクロRNA（miRNA）のターゲットの検出と識別を支援するために設計されています。ターゲットIDのライブラリは、デュアル選択融合タンパク質を、チミジンキナーゼ-ゼオシン（TKzeo）から3&#39;UTRの下流にクローニングしたプラスミドベースのゲノムワイドなcDNAライブラリーです。選択範囲の最初のラウンドは、安定な形質転換のために興味のあるmiRNAの導入に続いて、最後には、miRNAのターゲットを含むcDNAの選択です。選択されたcDNAは、シークエンシング（ターゲットIDライブラリワークフローと詳細については、図1-3を参照）によって識別されます。 人間のトランスクリプトームの広範なカバレッジを確保するために、ターゲットIDライブラリのcDNAは、複数のヒト組織および細胞株から調製したtotal RNAのプールを使用して、オリゴdTプライミングを経由して生成されました。 1.2キロバイトの平均サイズは、0.5〜4 kbまでのcDNAの範囲を、その結果と（プラスミドマップの図4を参照）p3TKzeoデュアル選択プラスミドにクローニングした。のLiで表される遺伝子標的braryはSigma-AldrichのWebページに記載されています。イルミナシーケンス（ 表3）、の結果から、ライブラリがUCSC RefGeneで21518ユニークな遺伝子の16922（79％）、10または読み出し以上（66％）と14,000の遺伝子が含まれていることを示しています。

ターゲットIDのライブラリは、miRNAのターゲットを識別するために使用されるクローニングされたcDNAのプラスミドベースのゲノムワイドなコレクションです。ここでは、その使用してアプリケーションを示しています。

ミッションターゲットIDのライブラリを使用してmiRNAのターゲットのゲノムワイドスクリーン

Target ID Libraryは、マイクロRNA（miRNA）ターゲットの探索および同定を支援するために設計されています。Target ID Libraryは、プラスミドベースの...

本実験の全体的な目的は、target IDライブラリを用いて、マイクロRNA標的のゲノムワイドなハイスループットスクリーニングを行うことです。これは、ライブラリプラスミドを細胞にトランスフェクションすることで達成されます。クローニングされたcDNAのゲノムワイドなコレクションをトランスフェクションした後、安定細胞株の選別を行います。次に、確立したライブラリー細胞にmicro RNA発現コンストラクトをトランスフェクションし、micro RNAターゲットとチミジンキナーゼを共発現させます。この時点で、ガンシクロビルを用いてチミジンキナーゼの発現を負に選択し、特定のmicro RNAターゲットを発現している細胞を選択します。その後、micro RNAターゲット部位を含むCD NAをターゲットID増幅プライマーを用いてPCR増幅し、micro RNAライブラリーターゲットの配列決定および同定を行います。最終的に、ディープシーケンシング解析に基づき、細胞内の特定のmicro RNAターゲットを同定する結果が得られます。ミッショターゲットIDライブラリは、micro RNAの遺伝子ターゲットの探索および同定を支援するように設計されています。ここでは、その使用方法と応用例について説明します。本プロトコルの開始前に、目的のIRAを発現していない、または低レベルで発現している細胞株を選択して培養し、コンフルエンシー80%で約2×10⁷個の細胞が得られるまで拡大培養します。トリプシン処理後、細胞を15 mLの滅菌スクリューキャップチューブに移し、200 ×gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。培地を除去した後、細胞ペレットを再懸濁して洗浄し、再度遠心分離を行います。この洗浄操作を2回繰り返します。その間に、各チューブに2 µgのターゲットIDライブラリーを加えることで、トランスフェクション数分の0.5 mLチューブを準備します。次に、1回のトランスフェクションにつき600 µLのmaxim Nucle affection solutionを用い、15 mLチューブ内の細胞ペレットを再懸濁します。この操作は、1反応ずつ行います。分注液に100 µLの細胞と2 µgのプラスミドを加え、ピペットチップで混合します。各混合液を核エフェクター用ベタに転送します。核エフェクター装置にベタを1つ挿入し、使用する細胞株に適した最適化プログラムを実行します。次に、移送用ピペットに予熱した培地を満たします。同じピペットを用いて形質導入した細胞を吸い上げ、あらかじめ準備しておいた6ウェルプレートの1つのウェルに移します。この操作を、各NU核アフェクションに対して繰り返します。細胞を成長チャンバーに戻し、翌日まで一晩インキュベートします。培地を交換し、3〜5日間細胞を回復させます。細胞が回復したら、培地を除去し、TKZO融合タンパク質の安定した組み込みと発現を選択するために、適切な濃度のエオシンを含む完全培地を加えます。エオシン濃度は、本文に記載されている方法で事前に決定することができます。細胞生存率を通じて、エオシンによる選択状態をモニタリングしてください。2〜3日ごとに、新鮮なエオシン含有培地で培地を交換します。6ウェルプレートで細胞がコンフルエントになったら、継代してより大きなフラスコへ細胞を拡大培養します。本研究で使用する選択試薬の最小致死量を決定するため、キルカーブ解析を行います。意図しない表現型反応を避けるため、キルカーブを行う前に、まず細胞を120 µLの新鮮な培地を含む96ウェルプレートの各ウェルに播種し、翌日に解析に移行します。選択したウェルに薬剤を添加します。miRNA発現コンストラクトの組み込みを選択するためには、Antibiotics G four 18またはpure mycinを使用します。また、チミジンキナーゼ発現を排除するためには、アシクロビルを使用します。インキュベーション期間中、各薬剤濃度における細胞生存率を2日ごとに確認してください。選択試薬を含む培地は3日ごとに交換します。薬剤濃度を決定した後、その細胞種および実験において、所定の時間経過後に完全な細胞死を誘導する選択試薬の最小濃度を使用してください。MIに向けて、標的IDライブラリ細胞を培養・拡大させ、2×10⁷個の細胞を得ることでトランスフェクションの準備を行います。細胞のコンフルエンシーが80%を超えた時点でトリプシン処理を行ってください。細胞を15 mLの滅菌スクリューキャップチューブに移し、200 ×gで5分間遠心してペレット化します。培地を除去し、前述と同様に細胞ペレットを2回洗浄します。次に、各トランスフェクションにつき、2 µgのMIRA発現プラスミドを0.5 mLチューブに加えます。ターゲットIDライブラリのトランスフェクションに使用した方法と同様の手法を用いて、ライブラリ細胞にmRNAのNU核導入を行います。細胞を3〜5日間回復させた後、キルカーブ試験で決定した適切な濃度の抗生物質を含む完全培地に交換します。抗生物質による選択のため細胞をモニターし、2〜3日ごとに抗生物質を含む培地に交換してください。6ウェルプレート内でコンフルエントになったら、プールを継代し、より大きなフラスコで細胞を拡大培養します。前述と同様に、適切な濃度のGCVおよび抗生物質を含む新鮮な培地に交換してください。細胞生存率を通じてチミジンキナーゼの発現およびmRNA発現をモニタリングし、GCVおよび抗生物質存在下で生存細胞を拡大培養します。次に、GCVで選択された細胞からゲノムDNAを調製します。キットのプライマーを用いて選択されたライブラリインサートをPCR増幅し、書面プロトコルに記載されている手順に従ってサブクローニングします。次に、増幅プライマーを用いてシーケンシング反応を行います。最終ステップとして、既知の転写物についてはヒトトランスクリプトームと、新規の転写物についてはヒトゲノムとシーケンスをBLASTアライメントし、標的遺伝子を同定します。mere 3 73発現コンストラクトをMC7ライブラリーに安定的にトランスフェクションし、ガンシクロビル含有培地で選択することで、mere 3 73標的を発現している細胞を濃縮しました。ライブラリを導入していないMCF seven細胞はチミジンキナーゼを発現していないため、GCVの影響を受けません。一方、C sevenライブラリ細胞はチミジンキナーゼを発現していますが、ブリリアントブルーを取り込んでいる生存細胞が確認されることから、8または16 µMのガンシクロビルでは完全に死滅しません。しかし、培地中のフェノールレッドの色から明らかなように、ライブラリ細胞はGCVによって増殖が停止します。停止した細胞は培地を酸性化せず、色は赤色のままとなります。オレンジ色に変化する代わりに、生存細胞から黄色標的配列を単離しました。その後、PCRで増幅し、シーケンシングを行いました。約1,200万本のcDNAリードが得られ、それらは約12,000個の一意な遺伝子にマッピングされました。これらの一意な遺伝子のうち、ヒット頻度に基づき、234個が信頼性の高いヒットとしてみなされ、mere 3 73に特異的でした。初期の比較により、ターゲットIDライブラリで同定された一意な遺伝子のうち10個が、TarBaseにおいて以前に同定されたmere 3 73ターゲットのリストにも含まれていることが判明しました。したがって、これら10個のターゲットはmere 3 73の有効なターゲットである可能性が高く、選択されたヒットを実験的に検証するために現在特性解析が行われています。このビデオを視聴することで、micro RNA遺伝子ターゲットの高スループット・ゲノムワイドスクリーンを実施するためのmission target IDライブラリの使用方法について、十分な理解を得られるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、細胞分裂に関与する遺伝子のハイスループットスクリーニングに人間esiRNAライブラリを使用してください。我々は、セットアップとesiRNA画面だけでなく、どのように結果を分析し、検証するために実施する方法を示します。...

哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA

マイクロRNA（miRNA）は遺伝子発現の重要な調節因子であり、多くの生物学的プロセスにおいて役割を果たすことが示されている。より良いmiRNAの- UTRの相互作用を理解するために、我々は新たなルシフェラーゼ遺伝子およびアッセイ試薬、LightSwitchのシステムと対になって3...

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3'非翻訳領域(3'UTRs)(3'LIFE)の機能的要素の発光同定は、miRNAまたは他の調節因子による3'UTRの機能調節を特定する技術です。このプロトコルは、96ウェルトランスフェクションやルシフェラーゼアッセイなどのハイスループット手法を利用して、機能的抑制のための数百の推定相互作用をスクリーニングします。...

3&#39;LIFEアッセイを用いた高スループットにおけるmiRNA標的の検出

前臨床試験からヒト試験に移行する新規薬物標的を特定することは、科学的な優先事項です。そのために、ここでは、遺伝子の枯渇ががん細胞株スフェロイドに与える影響を調べるための機能ゲノミクスアプローチについて説明します。これは、in...

癌細胞スフェロイド培養における潜在的に新規薬剤標的を同定するためのスクリーニング機能ゲノミクスを利用

このレポートでは、高速かつ信頼性の高い携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの検証方法について説明します。合成ビオチン化核酸 LNA のロックを用いた miRNA を模倣をキャプチャする使用していた方法は、mRNA をターゲットします。プルダウンにストレプトアビジン コートした磁気ビーズを採用するその後、ターゲット mRNA qPCR...

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

ここで説明する、生物学的に相乗的なmiRNAとその組み立てモジュールを短いトランス遺伝子に特徴付けるプロトコルであり、遺伝子治療用途に対する同時過剰発現を可能にする。...

神経膠芽腫における機能的関連miRNAの特徴付けと遺伝子治療のための人工クラスターへの工学

ここでは、1)既知および新規のmiRNAをより正確に同定でき、2)完全に自動化され、自由に利用できる新しい完全に自動化されたmiRNAパイプラインmirMachineを紹介します。ユーザーは、短い送信スクリプトを実行して、完全に自動化された mirMachine...

mirMachine:植物miRNAアノテーションのワンストップショップ

このプロトコルは、マイクロRNAクラスターネットワーク解析のための、規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)遺伝子編集ワークフローをクラスター化したハイスループットのクラスター化を記述しており、1回の実験で35...

マイクロRNAクラスターネットワーク解析のためのCRISPR遺伝子編集ツール

私たちは、遺伝子改変マウスモデルで発生した腫瘍の治療標的と対応するヒト腫瘍の種類を同定および比較するために、ゲノム解析と機能的ゲノムスクリーニングを利用した種間比較腫瘍ゲノミクスアプローチを開発しました。...

悪性末梢神経鞘腫瘍のマウスモデルにおける治療標的を特定するための遺伝子プロファイリングおよびゲノムスケールドロップアウトスクリーニング

このプロトコルは、マイクロRNAおよびマルチプレックスタンパク質を同時に検出および定量するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いたタンデム免疫蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを記述している。...

新しい検出および定量法としてのロック核酸 in situ ハイブリダイゼーションによるマイクロRNA増幅と認識

学ぶ miRNAターゲットのゲノムワイドスクリーニング法。Target IDライブラリを用いたハイスループット解析により、安定細胞株の樹立とガンシクロビル選択を組み合わせ、特定のマイクロRNA標的を同定します。

ミッションターゲットIDのライブラリを使用してmiRNAのターゲットのゲノムワイドスクリーン

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