電気パルスのアプリケーションの間に電界の方向と向きを変更すると、プラスミド遺伝子導入を向上 in vitroで
2011年9月12日
細胞の生存率には影響されていない間の電界の向きは、パルス印加中に変更されたときにエレクトロポレーションによる遺伝子導入は、約2倍に向上しています。遺伝子導入の増加は、細胞へのDNAのエントリのための有能な作られている膜面積の増加によって引き起こされる。
遺伝子電極転移（エレクトロポレーション）は、短時間で強力な電気パルスを印加することにより、細胞内に遺伝子を導入する物理的手法です。遺伝子電極転移が成功するためには、DNAと細胞膜の複合体形成、穿孔された膜を介したDNAの移行、細胞質から核へのDNAの移行、そして遺伝子発現という複数のステップが必要です。最大限の遺伝子導入効率を達成するために、さまざまな電気パルスプロトコルが用いられます。
その一つは、パルス印加中に電場方向を変更することです。本ビデオでは、すべてのパルスを同一方向に印加した場合と、電場方向を変更してパルスを印加した場合の遺伝子電極導入効率の違いを実演します。電場方向を変更した実験は、中国ハムスター卵巣細胞（CHO-K1）を用いて行われました。
以下の手順に従い、培養フラスコを用いてインキュベーター内で細胞を24時間培養します。実験当日、0.25%トリプシンEDTA溶液を用いてトリプシン処理を行い、細胞懸濁液を調製して細胞数をカウントします。細胞を4°C、1000 rpmで5分間遠心分離し、細胞ペレットをISO OSM Millerリン酸ナトリウム緩衝液で再懸濁し、細胞密度を5 million cells/mLに調整します。その後、サンプルを適切なディッシュに移します。細胞は、高電圧プロトタイプジェネレーターに接続された電極内蔵パイペットチップ内で電場にさらされます。
これらの電極により、異なる方向に比較的均一な電界を印加することが可能です。チップおよびジェネレーターは、ルアナ大学電気工学部バイオサイバネティクス研究室で開発されました。細胞懸濁液に、10 micrograms per milliliterの濃度のプラスミドE-G-F-P-N 1を添加します。
細胞とプラスミドDNAを十分に混合し、電気パルスを印加する前に、室温で2〜3分間インキュベートします。電極一体型ピペットチップに細胞懸濁液を100 µL分吸い上げます。本実験では、高電圧プロトタイプジェネレーターを用いて8回の矩形パルス列を印加し、最初のプロトコルでは異なる電場プロトコルが使用されます。
すべてのパルスは同一方向に印加されますが、2番目のプロトコルでは、電界の方向を変化させてパルスを印加します。2番目のプロトコルは、異なる方向への電気パルスの印加が可能な適切なパルスジェネレーターがある場合にのみ使用できます。パルス印加後、直ちに細胞をパイペットチップから6ウェルプレートに移し、胎児牛血清を添加してください。
サンプル容量の25%において、細胞を37 °Cで5分間インキュベートします。細胞膜の再封鎖を促すため、6ウェルプレートの各サンプルに2 mLのHAMF 12を加え、インキュベーター内の加湿5% CO2雰囲気下、37 °Cで24時間インキュベートします。遺伝子エレクトロトランスファーの効率は、パルス適用から24時間後にGFPを発現している細胞の割合として決定します。
取得ソフトウェアを用いて、蛍光顕微鏡で細胞を観察します。励起波長を488 nanometersに設定し、GFPを発現している細胞を検出するために、緑色蛍光画像に適したバンドパスフィルターを選択します。位相差像と緑色蛍光像を20倍で、少なくとも5枚ずつ取得します。
位相差像で細胞数をカウントし、緑色蛍光像でGFPを発現している細胞数をカウントします。各対応する像における全細胞数でGFP発現細胞数を除し、遺伝子エレクトロトランスフェクション効率の割合を算出します。すべてのパルスを同一方向に印加した場合と、電界方向を切り替えてパルスを印加した場合のGFP発現細胞の割合を示します。電界方向を切り替えることで、GFP発現細胞の割合が有意に増加します。
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概要
本研究では、エレクトロポレーションによる遺伝子導入について検討し、電場方向が導入効率に及ぼす影響を明らかにしています。その結果、パルス印加中に電場方向を変更することで、細胞生存率を損なうことなく、遺伝子導入率を2倍に高められることが示されました。
研究の主要構成要素
科学分野
- 遺伝子治療
- 細胞生物学
- エレクトロポレーション法
背景
- 遺伝子エレクトロポレーションは、細胞内に遺伝子を導入するための手法です。
- 短時間で強力な電気パルスを印加することで、DNAの進入を促進させます。
- トランスフェクションを成功させるには、DNAが細胞膜を通過し、核内に進入する必要があります。
- 電気パルスのプロトコルを変更することで、トランスフェクション効率を向上させることができます。
研究目的
- 電界の方向が遺伝子導入効率に及ぼす影響を評価すること。
- 方向の変化が細胞生存率に影響するかどうかを決定すること。
- チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を用いてそのプロセスを実証すること。
使用した手法
- CHO細胞への電気パルスの印加。
- 電界方向の違いによるトランスフェクション効率の比較。
- トランスフェクション後の細胞生存率の評価。
- 細胞内へのDNA導入およびその後の遺伝子発現の解析。
主要な結果
- 電界の方向を変更することで、遺伝子導入効率が約2倍に向上した。
- 細胞生存率への有意な影響は観察されなかった。
- 膜面積の増加がDNA導入の促進に寄与した。
- 異なる電気パルスプロトコルの有効性を実証した。
結論
- パルス印加中に電界の方向を変化させることで、遺伝子導入効率が大幅に向上します。
- この手法は、細胞の健全性を損なうことなく最適化することが可能です。
- 今後の研究において、遺伝子導入をさらに改善するための追加的なプロトコルの検討が期待されます。
よくある質問
業界における重要性
エレクトロポレーション中の電場方向を最適化することで、プラスミド遺伝子の導入効率を高めることができ、初期段階のターゲット検証およびリード化合物同定のワークフローにおいて、トランスフェクション効率を向上させる非ウイルス的な戦略となります。このアプローチは、細胞生存能を損なうことなく膜透過性を拡大してDNAの進入を増やすことで、メカニズム的なリスク低減を支援し、前臨床モデルにおける予測の信頼性を向上させます。本手法により、バイオ医薬品の研究開発におけるアッセイ開発やフェノタイプスクリーニングへのアプリケーションに向けた、再現性と拡張性のある遺伝子導入が可能になります。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： DNAが進入可能な膜面積を増加させることで、トランスフェクション効率を向上させ、組換えタンパク質発現研究における機能的な標的バリデーションを支援します。
- 運用の価値： 細胞集団全体にわたる一貫したプラスミド導入を可能にし、初期段階の仮説検証やパスウェイの解明におけるばらつきを低減します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： ハイコンテンツスクリーニングプラットフォームと互換性のある、遺伝子導入効率の定量的な蛍光ベースの読み取りを提供します。
- 運用の価値： 統合電極チップとプログラム可能なパルス発生器を用いてエレクトロポレーションのパラメータを標準化し、施設間でのアッセイの再現性を向上させます。
- 戦略的価値： 下流のターゲットエンゲージメントおよびバイオマーカーアッセイに向けた、形質導入細胞株のスケーラブルな調製をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： transfection後の細胞生存能を維持することで、疾患関連システムにおける遺伝子発現および表現型への影響の縦断的研究を可能にする。
- 実用的価値： バイオ医薬品の製造やパスウェイ解析に広く用いられるホスト細胞であるCHO細胞を使用し、安定または一過性にtransfectedされた前臨床モデルの構築を容易にする。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲットバリデーションからリード化合物の同定に至るディスカバリー・コンティニュアムに適合するものであり、細胞モデルにおいてターゲット機能を評価し、パスウェイを調節するために効率的な遺伝子導入が必要とされる場面で活用されます。
- 発見生物学：哺乳類細胞において目的遺伝子の確実な過剰発現またはノックダウンを可能にし、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：標準化された定量的なトランスフェクション結果を提供し、遺伝子構築物や調節要素の比較を可能にします。
- 分析：パーセンテージに基づく効率指標（GFP+細胞/全細胞数）を算出し、パルスプロトコル間の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：3Dモデルや共培養システムでのさらなる検証に適した、生存可能なトランスフェクト細胞を産出することで、前臨床への継続性を確保します。
- 組織内での再利用：付着細胞株または懸濁細胞株へのプラスミド導入を必要とする複数のプロジェクトに適用可能な、再利用可能なエレクトロポレーション能力を提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：パルスパラメータの生物物理学的最適化を通じてトランスフェクション効率を高めることで、遺伝子導入結果における予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値：定義されたパルス列と電界方向の制御により、遺伝子導入手順の再現性と標準化を改善します。
- 戦略的価値：表現型評価に十分な外来遺伝子発現を確保することで、ターゲット検証における生物学的リスクを軽減し、偽陰性を最小限に抑えます。
- ポートフォリオへの影響：細胞アッセイで達成可能な発現レベルに基づき、リスク調整済みの遺伝的ターゲットの優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- 形質導入効率を評価するため、哺乳類細胞培養、プラスミド調製、および蛍光顕微鏡観察の専門知識が必要です。
- 電場方向の変更がプログラム可能な高電圧パルス発生器および互換性のある電極一体型チップへのアクセスが不可欠です。
- 比較可能性を確保するため、実験間でパルスパラメータ（電圧、持続時間、回数）および細胞密度を標準化させる必要があります。
- 形質導入効率と細胞ストレスのバランスをとるため、DNA対細胞の比率およびインキュベーション時間の最適化が必要です。
- エレクトロポレーションに適した接着性または浮遊性細胞株に限定されており、初代細胞や感受性の高い細胞には別の導入方法が必要な場合があります。
