マウス鋤鼻急性組織スライス標本のイメージングフェロモンセンシング

この手順の全体的な目的は、生体組織内の神経細胞サブポピュレーションまたは個々の神経細胞に対してカルシウムイメージング実験を行うため、マウスのRO鼻器官またはVNOの急性組織切片標本を作成することです。まず、マウスの鼻からVNOを摘出し、次に解剖顕微鏡下で、冷たいA CSF中で軟骨カプセルから微細解剖によって分離します。次に、単離したVNOをアガロースブロックに垂直に配置し、ミクロトームを用いて急性冠状断組織切片を作成し、組織の完全性を確認します。

免疫組織化学染色後、共焦点顕微鏡を用いて数枚のスライスを観察します。他のスライスにはカルシウム感受性色素を導入し、その後、フェロモン候補リガンドを灌流させ、カルシウムイメージングを用いて神経活性化を観察します。この手法は、嗅覚研究における重要な課題の解決に寄与します。

例えば、ロモ鼻器には数百種類のフェロモン受容体が発現していますが、そのリガンドが同定されているものはごくわずかです。フェロモン受容体は異種発現系での発現が非常に困難です。そのため、特定のフェロモンを特定の受容体に割り当てるための効率的なin vivoアッセイを開発する必要がありました。

特定のニューロン亜集団が未知の受容体を発現し、GFPの発現によって同定可能なTACTマウスを使用できます。また、このアッセイを用いて、Fairmont変換カスケードに関与するイオンチャネルや酵素を薬理学的に調査し、本手順を実証することが可能です。本日は、解剖を開始する前に、私の研究室の研究者であるJulianとFabianの2名を紹介します。

塩化カルシウム以外のすべての成分を混合し、新鮮で冷却された人工脳脊髄液（oxy carb飽和A CSF）を調製します。oxy carbを直接バブリングして溶液を飽和させます。その後、塩化カルシウムを加え、二回蒸留水で目的の容量まで調整します。

A CSF溶液は使用時まで氷上で保持してください。成マウスを安楽死させ、斬首した後、冷やして継続的に酸素および二酸化炭素を供給したA CSFを入れたペトリ皿を準備します。下顎を除去した後、マウスの頭部をペトリ皿に入れます。

解剖顕微鏡の下にマウスの頭部を配置し、口蓋を可視化します。次に、マイクロ剪刀を用いて口蓋の上部を水平に切開し、マイクロ解剖ピンセットで口蓋膜を除去します。露出した空洞をA CSFで加湿し、洗浄します。

鼻中隔の上部と下部を切除します。次に、VNOを含む鼻中隔を慎重に摘出し、直ちにクリーンなA CSFの中に垂直に配置します。マイクロ解剖ピンセットを用いて、VNOの2つの部分を分離します。

VNOの軟骨被膜を特定し、すべての軟骨片が取り除かれるように注意しながら、慎重に除去します。ここで、単離されたVNO、除去された軟骨片、および解剖前のVNOを示します。まず、3%低融点アガロースを調製し、必要な器具を揃えてワークスペースを準備します。包埋型にアガロースを満たし、温度が41 °C以下であることを確認してから、解剖したVNOを浸します。冠状断（コロナ断面）を得るために、組織を垂直に配置します。

埋込型を氷上に1分間置き、アガーが凝固するまで待ちます。1分後、アガーブロックを取り出してパラメタル形状に切り出し、ミクロトームサポートに接着します。冷えたCSF中で、速度0.5 millimeters per second、振幅0.7 millimeters、厚さ100 micrometersの条件で、VNOの冠状断スライスをミクロトームで切削します。

ブラシで組織切片を回収し、冷えたA CSFを満たした組織培養プレートに移します。これにより、回収した組織切片の構造的完全性を検証でき、その後、固定して細胞骨格成分やその他の目的タンパク質を免疫染色することが可能です。ここでは、アセチル化チューブリンに対する紫色の免疫染色により、組織切片の構造的完全性が示されています。さらに、特定のフェロモン受容体をGFPでタグ付けした特定の神経細胞集団を観察することで、保存された神経形態が確認できます。暗室で観察すると、小さな楕円形の細胞体と、管腔表面まで伸びて微絨毛で終わる長い樹状突起を持つ神経細胞が観察されます。

冷たいA CSFに7 µMのURA 2:00 AMおよび0.1%onicを含むローディング溶液に入れ、VNOスライスを37 °Cで1時間インキュベートします。1時間後、ローディング済みのスライスを、使用時まで酸素炭酸ガスを用いて氷上で保持します。絵筆を用いて、ローディング済みのスライスをA CSFを含む灌流チャンバー内に配置し、組織スライスアンカーでスライスを固定します。

灌流チャンバーをカルシウムイメージング装置の顕微鏡ステージ上に設置し、室温で酸素飽和させたA CSFを連続的に灌流させます。染料に対応する蛍光波長（4O 2:00 AMの場合は340〜380 nm）を用いて、標識したVNOスライスを観察します。適切なソフトウェアを使用して、細胞内カルシウム比の変化を記録してください。化学刺激を誘導するためには、灌流システムが必要です。

ここでは、V1rb2フェロモン受容体を発現するニューロンのサブポピュレーションがGFPも共発現しているマウスのvno組織の冠状切片を用い、アセチル化チューブリンタンパク質を紫色で免疫染色しています。切片を高倍率で観察すると、組織の完全性が保持されていることがわかります。長い樹状突起を持つニューロンが管腔の表面に達している様子が示されており、カルシウムイメージングのための樹状突起結節および微絨毛において構造タンパク質の発現が確認できます。

FUを負荷した組織切片をまずホフマン位相差顕微鏡で観察し、血管（1番目の白い矢印）から始めて目的の視野を特定します。観察者はゆっくりと管腔（2番目の白い矢印）および神経上皮領域へと進みます。RO鼻神経ニューロンの楕円形の細胞体は、長く細い樹状突起によって識別でき（3番目の白い矢印）、特定することが可能です。

管腔内に伸びる4番目の白い矢印は、神経細胞の樹状突起結節を示しています。5番目の白い矢印は、フェロモンRAを負荷した細胞（ここでは380 nmで示されています）に接触している微絨毛を示しており、その後、340 nmおよび380 nmで順次照射されます。この蛍光波長比は、選択された神経細胞（黒、赤、青の円）における細胞内カルシウム変化に対応してグラフ化されます。神経細胞の生存率を判定するためにATPが使用されます。

選択した3つのニューロンで示されたカルシウム応答の範囲と、赤丸で囲まれた2番目のニューロンがTPに反応せず、そのため以降の解析から除外される点に注目してください。次に、尿とマウスフェロモン混合液の両方を用いて化学刺激を行い、組織切片の深部を観察します。GFPとV1RRB2受容体の両方を発現しているニューロンのサブポピュレーションを特定することが可能です。

ここでは、GFPとV1RB2受容体の両方を発現しているニューロンと、V1RB2を発現していないニューロンが並べて示されています。両細胞にURA-2 AMをロードさせると、V1RB2発現ニューロンは受容体のリガンドである2-heptanoneの灌流に反応してカルシウムスパイクを示します。興味深いことに、V1RB2非発現ニューロンも2-heptanoneに反応しており、VNOにおけるフェロモンコーディングの複雑さが示されています。

このビデオを視聴することで、急性組織スライス標本作製のために、マウスから髄膜細胞（mar cell）器官を抽出およびマイクロダイセクションする方法を十分に理解できるはずです。このプロトコルは、別のカルシウム指示薬や顕微鏡セットアップを用いた生理学的研究にも応用可能です。実験の成功をお祈りします。