Name: マウス鋤鼻急性組織スライス標本のイメージングフェロモンセンシング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぶマウス鋤鼻器官の急性組織スライス調製法とカルシウムイメージングによるフェロモン応答観察。個々のニューロン活性を可視化し、フェロモン受容体とリガンドの同定に貢献する神経科学的手法です。

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我々は彼の科学的なアドバイスや顕微鏡装置のUNILのイメージングCIFのプラットフォームのために特にモニークNenniger彼女の優秀な技術サポートのためのトサトだけでなく、ジャン=イヴチャットンに感謝したいと思います。資金は、スイス国立科学財団によって提供されていました。

1。マウスVNOの解剖<ol><li>成体マウスを使用してください。フェロモンセンシングがmultimodalitiesに関与しているように、菌株、遺伝子型、性別と年齢の間に慎重に区別は重要であり、あなたの結果に影響を与えます。ここで、我々は以前にフェロモン受容体ペア（2 -ヘプタノン- V1rb2）31（ 図1A）の識別に使用される成人VGマウス30を選択します。 </li><li>塩化ナトリウム118 mMの、飽和NaHCO 3 25mMの、D -グルコース10 mMのは、KCl 2mMの、のMgCl 2 2mMの、のNaH 2 PO 4 1.2 mMの、CaCl 2の 2、解剖を開始する前に、新鮮な寒さの人工脳脊髄液を（ACSF準備mMの、oxycarbon（95％O 2で飽和pHは7.4）：5％CO 2）。そのためには、CaCl 2の場合を除き、すべてのACSFのコンポーネントを混在させること。直接oxycarbonでそれをバブリングすることにより解決策を飽和させる。最後に、CaCl 2を追加し、必要な量にのddH 2 0で調整してください。 Uまで氷上でACSFのソリューションを維持するSE。 </li><li>マウスの安楽死は、優先的にただの実験の前に頚椎脱臼によりまたはCO 2吸入により行われる必要があります。 </li><li>マウスの頭部をカット。継続的にoxycarbonated冷たいACSFで解剖顕微鏡の下に置きます。 </li><li> （ 図1B）口蓋を視覚化するために下顎との位置頭をカット。 </li><li>マイクロはさみによる口蓋の上部（ 図1B）に水平に切開を行い、ミクロ解剖ピンセットで口蓋の膜を取り除く。水和物とACSF（ 図1C）で公開された空洞をきれいに。 </li><li>上部を切り取り、鼻中隔（ 図1C）の下部。微妙にVNOを含む鼻中隔を抽出し、氷（ 図1D）にACSFに収めます。 </li><li>垂直にマイクロ解剖鉗子を使用してVNOの二つの部分を分離し、繊細なVNOの軟骨カプセルを削除（図。 1E）。すべての軟骨の部分が削除されていることを確認します。 </li></ol> 2。 VNOの組織のスライス標本このセクション2）で説明されているVNO組織のスライス標本では、主にカルシウムイメージングの調査のためです。 VNOのスライスは、組織の構造的完全性をプロトコルの（セクション3を参照してください）​​）を確認するためにフローティングされたスライス上のimmunohistostainingsに使用することができます。 <ol><li>低融点寒天（標準PBS中の3％）と作業場所を準備します。あなたは、精度のワイプ、ブラシ、組織培養プレート、cyanacrylat接着剤、氷と温度計をACSF、ミクロトームとサポートし、マイクロ切開鉗子、埋め込み型（22 × 22 × 20 ​​mm）を必要になります。 </li><li> 3パーセントの低融点寒天で埋め込み金型を埋める。温度が41よりも高いではないことを° C冠状スライスを得ることができるように垂直にすぐに一掃VNO（ 図2A）を配置する前に確認してください。 </li><li>氷の上で埋め込み金型を配置その後1凝固までの分とのために寒天のブロックからそれを分離する。ピラミッド型の形状で寒天ブロックをカットし、ミクロトームサポート（ 図2B）に接着剤でそれを置きます。 </li><li> 0.5ミリメートル/秒、0.7 mmの振幅と冷たいACSFで100μmの厚さの速度で、ミクロトームで冠状VNOスライスをカットし、寒さで満たされた組織培養プレートに置く前に、ブラシで組織切片を収集するACSF。 </li><li>あなたのスライスがGFPのような内因性の蛍光を（遺伝子標的ニューロンの）が含まれている場合には、蛍光実体顕微鏡（ 図2C）の下でそれらを選択することができます。 </li></ol> 3。 VNO浮動スライス上で免疫組織化学この手順の目的は、セクション2）で得られたVNOの組織切片の整合性を確認することです。アセチル化チューブリンは、VNO感覚ニューロンの樹状突起と微絨毛に発現し微小管/細胞骨格マーカーです。カルシウムイメージング実験のために、方向を行くtlyへのプロトコルのセクション4）。フローティングVNOスライス上で免疫組織染色法は、対象とする任意のタンパク質の発現の評価に適応することができます。この目的のために、我々は、4℃で1時間のためにVNOをする、解決することを° Cを固定液で（PBS、pHが7.6のパラホルムアルデヒド4％）ポイント1.7の後に）この時点PBSからプロトコルと使用のpHは7.6ではなく、お勧めACSFソリューション。 <ol><li>組織培養プレートでは、固定液に興味のあるスライス（PBS、pHが7.6のパラホルムアルデヒド4％）で4 1H℃を修正</li><li> 0.5％でNGS（血清正常ヤギ）10％、トリトンX - 100を含むPBS溶液で4℃一晩あなたの組織切片° Cをブロックする。 </li><li> 0.25パーセントでNGS 5％トリトンX - 100を含むPBS溶液で室温（RT）で16時間一次抗体とスライス（抗アセチル化チューブリン、マウス、1:2000）インキュベートする。 </li><li> NGS 2％を含むPBS溶液で5分間3回洗浄する。 </li><li>セコで暗所でインキュベートNGSの室温で1時間の2％を含むPBS溶液でndary抗体（Cy5標識ヤギ抗マウス、1:200）。 </li><li>のみNGSの2％、PBS NGS 1％を含むPBSとPBSで5分間3回洗浄する。 </li><li>疎水性の区切りゾーン（疎水性のペンを使用する）の中央に配置することにより、蛍光マウンティング培地（DAPIを含むかどうか）でスライスをマウントし、カバースリップを持つスライスをカバー。 </li><li>共焦点顕微鏡と3D再構成（ 図2D - F）を許可するソフトウェアを使用して観測し、買収を行う。 </li></ol> 4。 VNOのスライス上にカルシウムイメージング<ol><li>次の手順では、暗闇の中で行われます。 37 1時間インキュベートVNOスライス°フラ- 2AM（7μM、DMSO中の1mMのストック溶液）で冷たいACSFで構成されるローディング溶液中でCとプルロニック0.1％（w / vの;のddH 2で20％のストック溶液O）。 </li><li>使用するまでoxycarbonationと氷の上にロードされたスライスをしてください。ロードされたスライスを使用するために残しておくことができます3 - 4H。 </li><li> ACSFを含む灌流チャンバー内のブラシでロードされたスライスを置き、組織切片のアンカー（ 図3A）とスライスを維持する。 </li><li>カルシウムイメージング顕微鏡（ 図3B）のステージ上の灌流チャンバーを置き、継続的に室温でoxycarbonated ACSFを灌流。温度は、バイポーラの温度コントローラを用いて適応させることができる。 </li><li>ロードされたVNOスライス（ 図3C - E）の観測は、25倍または63x客観的かつクールSNAP - HQのカメラで、倒立蛍光顕微鏡で実行されます。照明は、ポリクロメータの楽器で（380分の340 nm）を連続して行われ、5Hzのの速度で記録されます。フィルタリングされた放射は510 nmで行われます。細胞内カルシウムの比率の変化（ΔF= 340 nm/380 nm）は適切なソフトウェアを使用して監視されます。 </li><li> Chemostimulationは、あなた自身の実験目的に応じて適宜選択されるべきである。ここでは、フェロモンMを含むACSFのperfusionsIX（イソブチルアミン、2 -ヘプタノン、4 -ヘプタノン、2 -ヘプタノール、pentylacetate、dimethylpyrazine、α/β-ファルネセン、10 -6 M）、2 -ヘプタノン（10 -6 M）またはたての（1オスとメス収集： 1）マウスの尿（1:100）が32を実行している。 ATP（125μM）の灌流は、実験の終了時に実行可能性のテストとして使用されます（ 図3F）と約80％生存ニューロンの割合を示す必要があります。これらの条件下で、スライスは2時間まで使用することができます。 </li><li>感覚ニューロンのGFPタグ亜集団は、特定の照明（ここV1rb2表現する神経細胞）によって可視化されると（ 図3G - I）を正確に分析することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果： 多形質導入マウスVNOで行われている、または新たなフェロモン受容体のペアを識別するための経路を調査する機能アッセイを確立するために、我々は、VGマウスライン（ 図1Aを活用する図1E）の抽出と解剖の後、我々は急性VNOスライス（ 図2C）を用意する。我々は、アセチル化チューブリン蛋白質（ 図2D - F）に対してimmunohistostainingsを実行することで、準備のtissular整合性をチェックし、検証するために、それらの一部を修正。スライスの他の画分をカルシウムイメージング実験に使用されます。そのためには、スライスはフラ- 2AM（ 図3C - E）によってロードされ、各ニューロンの細胞内カルシウムレベルは、ΔFの比（ 図3F）として監視されます。ニューロンの生存性は、ΔF比の迅速かつ一時的な増加が（ 図3F）期待される後、ATPの灌流（125μM）によって評価されます。フェロモンの主要な供給源である尿、新鮮なの灌流LY収集したマウスの尿（1:100）は、内在性コントロールとして使用されます。それは、記録されたニューロン（セル1と2、 図3F）の約50％のカルシウムトランジェントをトリガします。 GFP照明の下、V1Rb2陽性ニューロンは、2 -ヘプタノン、観察、およびその既知のフェロモンリガンドの灌流され、細胞の活性化を（セル1、 図3I）を開始します。興味深いことに、神経細胞のアクティベーションは、VNOでコーディングフェロモンの複雑さを示す、V1Rb2受容体（GFP陰性ニューロン）（セル2、 図3I）を発現していないニューロンの割合で観測されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1マウス鋤鼻器官の解剖。 VGのラインから（A）マウス。 （B）マウスの安楽死の後、完全な頭部は、双眼顕微鏡下に置かれており、下顎が口蓋を視覚化するために削除されます。小さな水平方向の切開が行われる（黒の破線）。 （C）口蓋を除去した後、VNOが並ぶ鼻中隔は、VNOの抽出を容易にするために上側と下側の部分（白点線）にカットされます。 （D）VNOは、ACSFのソリューション内に配​​置し、（挿入：二つの部分の高いパワービュー）分離されています。 （E）VNOの軟骨カプセルは微妙に削除され、その軟骨カプセルのないVNOは、実験の残りの部分に使用されます。スケールバーは以下のとおりです、1 mmに。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。マウスの鋤鼻急性スライス標本とtissular整合性。 （A）マウスVNOは垂直に寒天3％溶液に埋め込まれています。寒天の温度は41℃未満にする必要があります（B）寒天ブロックはピラミッド状の形状にカットされ、100μmのVNOのセクションは、（黒の破線）ACSFで生成されます。 （C）VNOのスライスは、特定のを可視化するために、蛍光実体顕微鏡下で選択することができます。タグ付けされた感覚ニューロンの人口。 （DF）Tissularの整合性は、アセチル化チューブリン蛋白質、準備の完璧な保護を実証V1rb2遺伝子標的ニューロンのより高い電力のビューに対してimmunohistostainingsによって評価することができる。内腔の表面（E）だけでなく、樹状ノブや微絨毛の構造タンパク質の発現に達した彼らの長い樹状突起を持つ神経細胞は、（F）を観察することができます。スケールバーは以下のとおりです。Bを5mm、C、60μmの、D、40μm以下、EF、20μmである。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。カルシウムイメージングと鋤鼻急性組織切片におけるフェロモンの検出。 （A）フラ- 2AMローディングフェーズの後、VNOのスライスは、灌流チャンバー内に配置され、適応アンカー（ハイパワービュー）で維持されます。 （B）実験が暗いとVNOスライスで実行される連続的に真空システムを用いてRTでACSFを灌流されています。温度はchosすることができますバイポーラペルティエ素子と熱プローブによって構成される温度制御装置のシステムを使用してエン。この特定の実験は室温で行った。 （CE）VNOのスライスは、（D）と神経細胞活性化（E、ここでATPを持つ）の間の前にホフマンの位相コントラスト（C、HV）やフラ380nmの照射下で観測されています。 （F）神経生存率は、ATP（125μM）の灌流で評価されます。ここで、chemostimulationは、尿（尿、1:100）、または165ミリリットル/ hの一定流量でマウスのフェロモンの混合（ミックスのpH。、10 -6 M）で行われます。細胞内カルシウム濃度（ΔF）（セル1〜3）各セルごとに個別に記録することができます。 （G）V1Rb2のニューロンがGFP照明（1）に基づく可視化です。 （H）このニューロン（1）と同様に非V1rb2表現するニューロン（2）の荷重が表示されます。 （I）V1rb2のニューロンは、細胞内カルシウムの増加とともに2 - ヘプタノンに対応することができます。この特定の非V1rb2表現するニューロンは、また、2 - ヘプタノン（セル2）に応答します。スケールバーは以下のとおりです。CE、20μm以下、GH、は15μm、ΔF= 340 nmの/ 380nmの。 （FおよびI）刺激のアプリケーションの持続時間は、各トレースの下のバーで示されます。任意のカラースケールは、蛍光強度を表します。

<ol><li>Karlson, P., Lüscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Pheromones%22+a+new+term+for+a+class+of+biologically+active+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">"Pheromones" a new term for a class of biologically active substances.</a> Nature. 183, 55-56 (1959).</li>
<li>Cavaggioni, A., Mucignat-Caretta, C., Redaelli, M., Zagotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scent+of+urine+spots+of+male+mice%2C+Mus+musculus%3A+Changes+in+chemical+composition+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">The scent of urine spots of male mice, Mus musculus: Changes in chemical composition over time.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3741-3746 (2006).</li>
<li>Novotny, M., Harvey, S., Jemiolo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+male+dominance+in+the+house+mouse%2C+Mus+domesticus%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Chemistry of male dominance in the house mouse, Mus domesticus.</a> Experientia. 46, 109-113 (1990).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li>
<li>Jemiolo, B., Xie, T. M., Novotny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Socio-sexual+olfactory+preference+in+female+mice%3A+attractiveness+of+synthetic+chemosignals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Socio-sexual olfactory preference in female mice: attractiveness of synthetic chemosignals.</a> Physiol. Behav. 50, 1119-1122 (1991).</li>
<li>Achiraman, S., Archunan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+urinary+volatiles+in+Swiss+male+mice+%28Mus+musculus%29%3A+bioassay+of+identified+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of urinary volatiles in Swiss male mice (Mus musculus): bioassay of identified compounds.</a> J. Biosci. 27, 679-686 (2002).</li>
<li>Dulac, C., Torello, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals%3A+from+genes+to+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li>
<li>Brennan, P. A., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromonal+communication+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pheromonal communication in vertebrates.</a> Nature. 444, 308-315 (2006).</li>
<li>Mondor, E. B., Roitberg, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusive+fitness+benefits+of+scent-marking+predators%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Inclusive fitness benefits of scent-marking predators.</a> Proc. Biol. Sci. 271, Suppl 5. 341-343 (2004).</li>
<li>Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li>
<li>Keverne, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vomeronasal+Organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Vomeronasal Organ.</a> Science. 286, 716-720 (1999).</li>
<li>Weiler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+development+of+the+rat+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Postnatal development of the rat vomeronasal organ.</a> Chem. Senses. 30, Suppl 1. 127-128 (2005).</li>
<li>Zufall, F., Kelliher, K. R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Microsc. Res. Tech. 58, 251-260 (2002).</li>
<li>Ciges, M., Labella, T., Gayoso, M., Sanchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+the+organ+of+Jacobson+and+comparative+study+with+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of the organ of Jacobson and comparative study with olfactory mucosa.</a> Acta. Otolaryngol. 83, 47-58 (1977).</li>
<li>Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsystem+organization+of+the+mammalian+sense+of+smell%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subsystem organization of the mammalian sense of smell.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).</li>
<li>Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multigene+family+of+putative+pheromone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A new multigene family of putative pheromone receptors.</a> Cell. 19, 371-379 (1997).</li>
<li>Matsunami, H., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigene+family+encoding+a+diverse+array+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 90, 775-784 (1997).</li>
<li>Herrada, G., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals+with+a+topographycally+organized+and+sexually+dimorphic+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographycally organized and sexually dimorphic distribution.</a> Cell. 90, 763-773 (1997).</li>
<li>Dulac, C., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+genes+encoding+putative+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 83, 195-206 (1995).</li>
<li>Young, J. M., Massa, H. F., Hsu, L., Trask, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+variability+among+mammalian+V1R+gene+families%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Res%22%5BJournal%5D)">Extreme variability among mammalian V1R gene families.</a> Genome. Res. 20, 10-18 (2009).</li>
<li>Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+evolution+of+the+V2r+vomeronasal+receptor+gene+repertoire+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats.</a> Genomics. 86, 306-315 (2005).</li>
<li>Levai, O., Feistel, T., Breer, H., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+the+vomeronasal+organ+express+odorant+receptors+but+project+to+the+accessory+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cells in the vomeronasal organ express odorant receptors but project to the accessory olfactory bulb.</a> J. Comp. Neurol. 498, 476-490 (2006).</li>
<li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li>
<li>Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formyl+peptide+receptors+are+candidate+chemosensory+receptors+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).</li>
<li>Liman, E. R., Corey, D. P., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP2%3A+A+candidate+transduction+channel+for+mammalian+pheromone+sensory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">TRP2: A candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5791-5796 (1999).</li>
<li>Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromonal+recognition+memory+induced+by+TRPC2-independent+vomeronasal+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).</li>
<li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li>
<li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li>
<li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介するカルシウムイメージング法は、急性スライス標本では、マウスVNOニューロンのフェロモン応答を記録することができます。このアプローチでは、鋤鼻ニューロンに動物の解剖は、いくつかの練習で、容易に達成可能であり、長期生体組織の準備を提供します。それは、薬理学的調査やフェロモンのコーディングの研究のように時間のかかる実験をすることができます。この生理学的手法では、大規模な集団だけでなく、正確な神経細胞集団は、特に分析することができます。さらに、この方法は簡単に他のカルシウム色素に基づいて、免疫組織化学的なアプローチや実験に適応することができます。これらを組み合わせた方法論を使用すると、確実にマウス鋤鼻器官に発現し、多くの孤児の化学受容体の新たなフェロモンリガンドの同定が可能になります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>アデノシン5&#39; -三リン酸二ナトリウム塩溶液（ATP） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A6559 - 25UMO </td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A7002 - 100G </td><td>優先的に免疫組織化学のための</td></tr><tr><td>寒天（低融点） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A0701 - 25G </td><td>優先的にカルシウムイメージングのための</td></tr><tr><td> CL - 100バイポーラ温度コントローラ</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> W64 - 0352 </td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5標識AffiniPureヤギ抗マウスIgG </td><td>ジャクソンイムノ</td><td> 115から175から071 </td><td>光から保護</td></tr><tr><td> DMSO（ジメチルスルホキシド） </td><td>メルク</td><td> 317275 - 100ML </td><td></td></tr><tr><td>埋め込み型、ピールウェイ</td><td> Polysciences </td><td> 18646A - 1 </td><td> 22 × 22 × 20ミリメートル</td></tr><tr><td>蛍光マウンティング培地（DAPIとVectashield、10 ml）を</td><td> Rectolab </td><td> H - 1200 </td><td></td></tr><tr><td>フラ- 2AM </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td>光から保護</td></tr><tr><td> Glisseal N（真空グリース、60g）を</td><td>ボーラーのChemie社</td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td>大浴場の録音室（RC - 26G） </td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> 64から0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor（カルシウムイメージングのためのソフトウェア、v.7.6.5.0） </td><td> Visitronシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル抗チューブリン、アセチル化Dマウス抗体</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T6793 - .2ML </td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清（NGS、10ml）を</td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td>チャンバー用のプラットフォーム（P - 1） </td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> 64から0277 </td><td></td></tr><tr><td>プルロニックF - 127、2gの</td><td>インビトロジェン</td><td> P - 6867 </td><td></td></tr><tr><td>ロティコル（投薬瓶、10g）を</td><td>カールロート</td><td> 0258.1 </td><td></td></tr><tr><td> SC - 20デュアルインラインソリューションのヒーター/クーラー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> W64 - 0353 </td><td></td></tr><tr><td>スライスのアンカー（SHD - 26GKIT） </td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> 64から0266 </td><td></td></tr><tr><td> Stereofluorescence顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td>スーパーPAPのPEN（疎水性ペン） </td><td> Pelcoの国際</td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX - 100 </td><td>フルカ</td><td> 93420 - 250ミリリットル</td><td></td></tr><tr><td>振動刃ミクロトームVT 1200S </td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome高速ポリクロメータ方式</td><td> Visitronシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3Dデータの可視化（Imaris; v.6.3.1） </td><td>ビットプレーン科学ソフトウェア</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス鋤鼻急性組織スライス標本のイメージングフェロモンセンシング

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

ピーターカールソンとマーティンルッシャーは、イントラ種の通信に使用される化学物質を記述するために1959年1で初めて長期的フェロモンを使用していました。フェロモンは揮発性または不揮発性の短命な分子である2分泌および/ ​​または尿など、フェロモン3の主な源であることが知られている液体のような生物学的流体3,4、に含まれている。フェロモンコミュニケーションは、親族間相互作用5,6、階層的な組織3、性的な相互作用7.8などの主要な動物のモダリティの多様に関与していると結果的に直接与えられた種9,10,11の生存と相関している。マウスでは、フェロモンを検出する能力は、主に鋤鼻器官（VNO）10,12、鼻腔の底部にある対になった構造によって媒介される、と軟骨カプセルに封入。各VNOは、外部との接触を可能にする内腔13,14と筒形状を有している化学の世界。感覚神経上皮は、主に鋤鼻バイポーラ感覚ニューロン（VSNを）15で構成されています。各VSNは、化学物質の検出16に関与する100絨毛まで付いた大きな樹のノブで終わる腔に単一の樹状突起を拡張します。 VSNの多数の亜集団が存在している。それらはおそらく彼らが17,18を認識するリガンド（s）でこのように表現し、化学受容器によって区別されます。二つの主要な鋤鼻受容体ファミリー、V1RsとV2Rs 19,20,21,22は 、240 23 120 24メンバーによってそれぞれ構成され、神経上皮の別々の層で表されます。嗅覚受容体（ORS）25とホルミルペプチド受容体（FPRの）26,27は、VSNをで表されます。 これらのニューロンの亜集団は、センシングフェロモンのために同じ下流のシグナル伝達経路を使用しているかどうかは不明です。カルシウム透過性チャネル（が果たす主要な役割にもかかわらず28 TRPC2独立した情報伝達のチャンネルが6,29を提案されている成熟した神経細胞の微絨毛に存在TRPC2）。神経細胞集団の数が多いとオルガンの独特な形態のために、VNOに存在するシグナル伝達要素の薬理学的および生理学的な調査は複雑です。 ここで、我々は、カルシウムイメージングの調査を行うためのマウスVNOの急性組織のスライス標本を提示する。この生理学的アプローチは、以前にフラ- 2AM、カルシウム色素でロードされたVSNの一般的なまたは個々の部分集団の生体組織の自然環境、で、観察することができます。このメソッドは、GFPタグ付きのフェロモン受容体を研究するにも便利ですし、他の蛍光カルシウムプローブの使用のための適応です。例として、我々はここにフェロモンV1rb2受容体の翻訳はポリシストロン戦略によるGFPの発現にリンクされているVGマウス30行目を 、使用してください。 </p&gt;

マウスでは、フェロモンを検出する能力は、主に鋤鼻器官（VNO）によって媒介される。ここでは、カルシウムイメージングを行うためのVNOの急性組織のスライス標本が記載されている。この生理学的アプローチは、生体組織に集団および/または個々の神経細胞の観察を可能にし、受容体 - リガンドの識別に便利です。

Peter KarlsonとMartin Lüscherは、種内コミュニケーションに用いられる化学物質を記述するために、1959年に初めて「フェロモン」という用語を使用した。...

本手順の全般的な目的は、生体組織内のサブポピュレーションまたは個々のニューロンでカルシウムイメージング実験を行うために、マウスのRO鼻器官またはVNOの急性組織切片標本を作成することである。まず、マウスの鼻からVNOを摘出し、次に解剖顕微鏡下で冷却したA CSF中で軟骨カプセルから微細解剖することでこれを達成する。次に、単離したVNOをアガロースブロックに垂直に配置し、ミクロトームを用いて急性冠状組織切片を作成し、組織の完全性を確認する。免疫組織化学染色後、共焦点顕微鏡を用いて数枚のスライスを観察します。その他のスライスにはカルシウム感受性色素を導入し、その後、フェロモン候補リガンドを灌流させ、カルシウムイメージングを用いて神経活性化を観察します。この手法は、嗅覚分野における重要な課題の解決に寄与します。例えば、ヤモリの鼻腔器官には数百種類のフェロモン受容体が発現していますが、そのリガンドが同定されているものはごくわずかです。フェロモン受容体は異種発現系での発現が非常に困難です。そのため、特定のフェロモンを特定の受容体に割り当てるための効率的なin vivoアッセイを開発する必要がありました。特定のニューロンサブポピュレーションが未知の受容体を発現し、GFPの発現によって同定可能なTACTマウスを使用することができます。また、このアッセイを用いて、本手順で示されるFairmontトランスダクションカスケードに関与するイオンチャネルや酵素を薬理学的に解析することも可能です。本日は、解剖を開始する前に、私の研究室の研究員であるJulianとFabianの2名を紹介します。塩化カルシウムを除くすべての成分を混合し、新鮮で冷たい人工脳脊髄液（oxy carb飽和A CSF）を調製します。oxy carbを直接バブリングして溶液を飽和させます。その後、塩化カルシウムを加え、二回蒸留水で目的の量まで調整します。A CSF溶液は使用するまで氷上で保持してください。成マウスの安楽死および断頭後、冷やして継続的に酸素および二酸化炭素を飽和させたA CSFを入れたペトリ皿を用意します。下顎を除去した後、マウスの頭部をペトリ皿に入れます。解剖顕微鏡の下にマウスの頭部を配置し、口蓋を可視化します。次に、マイクロシザーを用いて口蓋上部に水平に切開を加え、マイクロ解剖鉗子で口蓋膜を除去します。露出した空洞をA CSFで水和させ、洗浄します。鼻中隔の上部と下部を切断します。次に、VNOを含む鼻中隔を慎重に摘出し、そのまま清潔なA CSFに垂直に配置します。マイクロ解剖ピンセットを用いて、VNOの2つの部分を分離します。VNOの軟骨被包を特定し、すべての軟骨片が取り除かれるように注意しながら、慎重に除去します。ここで、単離されたVNO、除去された軟骨片、および解剖前のVNOを示します。まず、3%低融点アガロースを調製し、必要な器具を揃えてワークスペースを整えます。包埋モールドにアガロースを満たし、温度が41 °C以下であることを確認してから、解剖したVNOを浸します。冠状断（コロナ切片）を得るために、組織を垂直に配置します。埋め込み型モールドを氷上に1分間置き、アガーを凝固させます。1分後、アガーブロックを取り出し、アガーをパラメタル形状にカットし、ミクロトームのサポートに接着します。冷たいCSF中で、速度0.5 millimeters per second、振幅0.7 millimeters、厚さ100 micrometersで、VNOの冠状断面スライスをミクロトームで切断します。ブラシを用いて組織切片を回収し、冷えたA CSFを満たした組織培養プレートに配置します。これにより、回収した組織切片の構造的完全性を確認し、固定後に細胞骨格成分やその他の目的タンパク質に対する免疫染色を行うことが可能になります。ここでは、アセチル化チューブリンに対する免疫染色（紫色）により、組織切片の構造的完全性が示されています。さらに、特定のフェロモン受容体をGFPでタグ付けした特定のニューロン集団を観察することで、保存されたニューロン形態が確認できます。暗室での観察により、小さな卵形の細胞体と、管腔の表面まで伸びて微絨毛で終わる長い樹状突起を持つニューロンが観察されます。VNOスライスを、7 µMのURA 2:00 AMおよび0.1%onicを含む冷えたA CSFのローディング溶液中で、37 °Cで1時間インキュベートします。1時間後、ロードしたスライスを使用時まで oksy carbonation 状態で氷上に保持します。絵筆を使用して、ロードしたスライスをA CSFを含む灌流チャンバー内に配置し、組織スライスアンカーでスライスを固定します。灌流チャンバーをカルシウムイメージング装置の顕微鏡ステージに設置し、室温の酸素飽和人工脳脊髄液（A CSF）で連続的に灌流します。染料に対応する蛍光波長（Fluo-4の場合は340〜380 nm）を用いて、染料を導入したVNOスライスを観察します。適切なソフトウェアを使用して、細胞内カルシウム比の変化を記録してください。化学刺激を誘発させるには、灌流システムが必要です。ここでは、V1rb2フェロモン受容体を発現するニューロンのサブポピュレーションがGFPも発現しているマウスのvno組織の冠状切片において、アセチル化チューブリンタンパク質を紫色で免疫染色した様子を示しています。切片の高倍率像では、組織の完全性が維持されていることがわかります。長い樹状突起を持つニューロンが管腔の表面まで達している様子が示されており、カルシウムイメージングのための樹状突起のノブおよび微絨毛に構造タンパク質の発現が見られます。FUをロードした組織切片をまずホフマン位相差顕微鏡で観察し、血管（1番目の白い矢印）を起点として関心領域を特定します。観察者はゆっくりと管腔（2番目の白い矢印）および神経上皮領域へと進みます。RO鼻腔ニューロンの楕円形の細胞体は、その長く細い樹状突起によって識別でき、これは3番目の白い矢印で示されています。管腔内に伸びる4番目の白い矢印は、神経樹状突起のノブ（dendritic knob）を示しています。5番目の白い矢印は、フェロモンRAを負荷した細胞に接触している微絨毛を示しており、ここではまず380 nmで、次に340 nmおよび380 nmで順次光照射を行い、この蛍光波長比を算出することで、選択したニューロン（黒、赤、青の円）における細胞内カルシウム変化を測定します。ニューロンの生存率の判定にはATPを用います。選択した3つのニューロン全体で示されているカルシウム応答の範囲と、赤丸で囲まれた2番目のニューロンがTPに反応しておらず、そのため以降の解析から除外される点に注目してください。次に、尿およびマウスフェロモンの混合物の両方を用いて化学刺激を行い、組織スライスの深部を確認します。GFPとV1RRB2受容体の両方を発現しているニューロンのサブポピュレーションを特定できます。ここでは、GFPとV1RB2受容体の両方を発現しているニューロンと、V1RB2を発現していないニューロンを並べて示しています。両細胞にURA-2 AMをロードさせると、V1RB2発現ニューロンは受容体のリガンドである2-heptanoneの灌流に反応してカルシウムスパイクを示します。興味深いことに、V1RB2非発現ニューロンも2-heptanoneに反応しており、VNOにおけるフェロモンコーディングの複雑さが示されています。このビデオを視聴することで、急性組織切片作製のために、マウスからマール細胞器官を抽出および微小解剖する方法を十分に理解できるはずです。このプロトコルは、別のカルシウム指示薬や顕微鏡セットアップを用いた生理学的研究にも適用可能です。実験の成功をお祈りします。

imaging-pheromone-sensing-mouse-vomeronasal-acute-tissue-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

多電極アレイ（MEA）の録音は、神経細胞の大規模な集団の電気的活動を研究するための方法を提供する。同時に組織を刺激しながらここで、我々はマウス鋤鼻上皮からのレコードにMEAの準備の詳細を示す。...

鋤鼻上皮の多電極アレイ録音

鋤鼻器（VNO）は、社会的および生殖的情報を伝える種内化学信号を検出します。我々は、VNO組織にG-CaMP2を発現させた遺伝子組換えマウスを用いて、Ca2+イメージング実験を行いました。このアプローチにより、多数のフェロモン刺激に対する鋤鼻ニューロンの複雑な応答パターンの解析が可能になります。...

遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現する鋤鼻器のスライス標本のイメージング神経細胞応答

このビデオでは、マウスの鋤鼻器官(VNO)の単離とビブラトーム切片のための組織調製について概説しています。切片は、感覚ニューロンの特定のグループの生物物理学的および生理学的属性を特徴付けるために使用されます。...

ビブラトーム切片化のためのマウス鋤鼻器官の調製

このビデオは、穴あきパッチクランプ技術を使用して、マウスの嗅覚ニューロン(OSN)の電気生理学的記録を示しています。蛍光色素にタグされた匂い受容体を持つOSNを含む嗅上皮は、マウスから単離され、記録チャンバーに固定されます。記録ピペットはOSNの樹状突起ノブに固定され、ピペット内のナイスタチンがメンブレンを穿孔して細胞との電気的接続を形成します。最後に、別のピペットを使用して臭気刺激剤を送達し、パッチを当てた細胞の電気生理学的活性を記録する。...

マウスの嗅覚ニューロンの穿孔パッチクランプ記録

プロトコルビデオは、マウスの鋤鼻器官(VNO)の感覚ニューロンからの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立について説明しています。蛍光標識された感覚ニューロンを備えた冠状VNOスライスを記録セットアップに配置します。標識されたニューロンは、化学刺激に応答して電気生理学的記録のために、全細胞構成の記録ピペットでパッチされます。...

鋤鼻感覚ニューロンからの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立

プリザーブド解剖組織と無傷マウスの鼻腔組織を準備するための効果的なマニュアル脱骨方法

マウス副嗅球（AOB）は、感覚コーディングのコンテキストで勉強することは困難であった。ここでは、AOBニューロンは、マウスのフェロモンとカイロモンの情報処理の研究を容易にする、その周辺の入力に機能的に接続されたままでいるエクスビボ製剤を生成する解剖を示す。...

無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

嗅覚ニューロンの生理学的特性の分析には、まだ技術的な限界があります。ここでは、遺伝子標的マウスの嗅上皮の無傷の準備で穴あきパッチクランプを介してそれらを記録します。この技術により、特定の嗅覚受容体を発現するニューロンの特定のリガンドに対する膜特性と応答の特性評価が可能になります。...

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

ここでは、マウスの鋤鼻器官の急性冠組織切片における感覚ニューロンの定義された集団の同定と詳細な分析を可能にする生理学的アプローチについて説明します。...

マウス鋤鼻器官の急性組織スライスで定義された細胞集団の中で、深さ生理学的解析

この記事では、単核RNAシーケンシングを目的としたマウス嗅覚上皮の解剖と解離のための合理化されたプロトコルを提供します。...

単核懸濁液のためのマウス嗅覚上皮の迅速な解剖と解離

学ぶマウス鋤鼻器官の急性組織スライス調製法とカルシウムイメージングによるフェロモン応答観察。個々のニューロン活性を可視化し、フェロモン受容体とリガンドの同定に貢献する神経科学的手法です。

マウス鋤鼻急性組織スライス標本のイメージングフェロモンセンシング

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