のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で研究

この手順の全体的な目標は、環状圧力に対する大動脈弁組織または細胞の生物学的応答を決定することです。これは、最初に不良徴候の心臓から弁組織を分離し、それらを組織培養培地で一晩インキュベートすることによって達成されます。手順の2番目のステップは、圧力システムが校正されていることを確認することです。次に。

弁組織または細胞は圧力システムに配置されます。チャンバーは摂氏37度のインキュベーターに入れられ、周期的な圧力レジームは、所望の大きさと周波数で所望の期間開始されます。最後に、組織は生物学的分析のためにシステムから除去されます。

最終的には、圧力の上昇が遺伝子やタンパク質の発現にどのように影響するかを示す結果を、リアルタイムPCR、ウェスタンブロッティング、または顕微鏡法で得ることができます。この技術の主な利点は、機械的圧力の影響を他の機械的力や生化学的刺激物から分離できることです。これは、動物モデルなどの他の手法よりも優れていますが、機械的な力が生物学や心臓弁の病因にどのように影響を与えたかを理解するために使用できます。

また、組織工学コンストラクトの開発にも使用できます。今、私たちがこの手順を実証するのは、おもちゃの運命です。私の研究室の大学院生 圧力のための組織を準備するため。

研究では、死亡直後の体重が120ポンド以下の成体の雌ブタから大動脈弁を収集しています。滅菌PBSでバルブを2回洗浄し、氷の上に置いて実験室に輸送します。その後のすべてのステップは、滅菌条件下で実行する必要があります。

リーフレットに変性、裂け目、石灰化の兆候が見られないことを確認してください。輪からの距離の3分の1を切り取ることにより、大動脈基部から弁尖を取り除きます。リーフレットを6ウェルプレートの個々のウェルに置き、1%抗生物質抗真菌溶液と10%ウシ胎児血清を添加した3ミリリットルのDMEMと37°C、5%二酸化炭素で一晩インキュベー

この圧力システムはカスタムメイドで、大動脈弁組織に対する周期的圧力の機械的生物学的影響を研究するように設計されています。システムを使用するには、コンピューターにログオンし、ラボビュープログラムを開きます。圧縮空気がシステムに接続されていることを確認し、空気供給を全速で開きます。

信号アンプの電源を入れます。巻を確認してくださいtage読み取り値は0.00です。必要に応じて調整します。

ラボ ビュー インターフェイスには、test に設定されたスイッチが test レコードとマークされたスイッチがあります。「Air Supply」とマークされたボタンをクリックして、インレットソレノイドバルブを開きます。ガス圧力調整器を使用して、チャンバーを圧縮空気で1PSで加圧します。チャンバー内の圧力は、チャンバーの後部プレートにあるデジタル圧力計を使用して読み取ります。

圧力が平衡化したら、電圧を記録しますtag信号増幅器からの読み取り値。2、3、4、および 5 PSI についても繰り返します。次に、圧力と電圧の検量線を作成します。

圧力をPSIから水銀柱ミリメートルに変換します。グラフの方程式をラボビュープログラムのコードに配置します。圧力チャンバーからアルミニウム製のフロントプレートを取り外し、チャンバーに70%エタノールをスプレーします。

リーフレットサンプルが入った6ウェルプレートをチャンバーに入れ、フロントエンドプレートを交換します。シールが気密であることを確認するには、4本のネジ付きロッドにあるナットを手で締めます。圧力チャンバーを摂氏37度のインキュベーターに入れます。

システムが圧縮空気の入力と出力の間を循環する時間を入力します。これらは、1ヘルツの周波数で拡張期と収縮期の状態をそれぞれ模倣するために、0.6秒と0.4秒に設定する必要があります。次に、ラボビューにデータファイルパスを入力します。

[実行] をクリックし、テスト レコードのトグルを [レコード] に切り替えます。ラボビューインターフェースのグラフを使用して、圧力が目的のレベルにあることを確認します。必要に応じて、ガス圧力調整器を使用して圧力を調整します。

実験が完了したら、ラボビューで[停止]をクリックし、空気供給をオフにして、圧力チャンバーの排気バルブを開きます。最後に、インキュベーターから圧力システムを回収します。次に、フロントエンドプレートをチャンバーから取り外し、6ウェルプレートを取り出します。

サンプルは、遺伝子発現、タンパク質発現、組織学、および機械的特性が正常圧力と高圧の圧力波形を表すかどうかを分析できるようになりました。このシステムから得られた条件を、in vivo条件下でここに示しています。拡張期には左心室と上行大動脈との間に圧力差があり、正常な生理学的条件下で大動脈弁を閉じたままにすることができます。

この経弁圧は80ミリメートル水銀柱です。しかし、ステージ1とステージ2の高血圧では、経弁圧はそれぞれ90ミリメートルと100ミリメートルの水銀柱に上昇する可能性があります。この圧力システムは、ノルム10、ステージ1、ステージ2の高血圧条件下で観察される最大経弁圧をシミュレートすることができます。

ここでは、システムから得られる常圧条件と高圧条件の代表的な圧力波の形態を示します。したがって、この手順に従って、PCRやウェスタンブロッティング、およびリーフレット上の顕微鏡検査などの他の方法を行うことができます。これにより、遺伝子発現やタンパク質合成の変化などを理解し、心臓弁のメカニズム伝達を理解するのに役立ちます。

この技術は、機械生物学や疾患のメカニズムを理解するのに非常に役立ち、将来的には、生体内で圧力が変化する可能性のある他の組織に発生する変化を理解するのに役立ちました。