抗体マイクロアレイと蛍光多重を用いた大腸癌の細胞表面タンパク質のプロファイリング

本実験の全体的な目的は、DOT scan抗体マイクロアレイを用いて、大腸がん組織上の表面抗原の分子プロファイリングを行うことです。さらに、蛍光マルチプレックス法を採用することで、混合集団内にある特定のプロファイルを持つ細胞種を識別します。分化クラスター（CD）抗原は、大腸がんにおける潜在的な予後因子または転移バイオマーカーとして同定されています。

これらの抗原は、腫瘍の進行や他の細胞型との相互作用に伴って発現が変化することが多いため、理想的なバイオマーカーとなります。本ビデオでは、DOT scan抗体マイクロアレイを用いて、発現している表面抗原を介して生細胞を捕捉します。DOT scan抗体マイクロアレイは、ニトロセルロース層を備えたガラススライドで構成されています。

DOT scan抗体マイクロアレイパネルは、CD 29およびCD 44で構成されるアライメントドットによって縁取られています。また、アレイの両側には重複したアレイが配置されています。最初のパネルは、DOT scan白血病マイクロアレイの元の82種類の抗体で構成されており、大腸がんサテライトマイクロアレイとして、予後予測の可能性に基づいてさらに40種類の抗体が選定されました。

最後のパネルは、アイソタイプコントロール抗体で構成されています。ここでは、大腸がん組織および正常な腸粘膜を消化し、ろ過することで、生存可能な単一細胞懸濁液を得ます。この懸濁液は、冷凍または保存して後で使用することができます。

細胞懸濁液は、DOTスキャン抗体マイクロアレイにおける細胞捕捉に使用され、異なる細胞サブタイプで発現している抗原が蛍光マルチプレックス法によってプロファイリングされます。得られた発現プロファイルは、大腸がん細胞と正常な腸粘膜の間で抗原発現に有意な変化があることを示しています。この差異は、腫瘍関連白血球集団にも反映されています。

複数の腫瘍プロファイルの階層的クラスタリングにより、疾患シグネチャーが大腸がんのステージごとにクラスター化することが示されています。こんにちは。私はシドニー大学（オーストラリア）分子バイオサイエンス学部から来ましたJerryです。本日は、大腸がん組織における表面抗原のプロファイリング実験をご紹介します。Dot scan抗体マイクロアレイと蛍光マルチプレクシングを用いることで、生存がん細胞およびそれに伴う炎症性白血球上の約140種類の表面抗原のプロファイリングが可能になります。

マイクロアレイ上に捕捉された細胞のサブセットは、目的の細胞に高度に発現しているマーカー抗原に結合する蛍光標識抗体を用いて区別することができます。3種類の異なる特異性を持つ抗体に適切な蛍光標識を施すことで、1枚のマイクロアレイ上で最大3種類の異なる細胞サブセットをプロファイリングすることが可能です。DOTスキャンマイクロアレイアッセイは比較的簡便な手法であり、すでにいくつかの癌種の細胞表面プロファイリングに利用されています。

DOTスキャンの大きな特徴は、表面抗原を介して生細胞を捕捉できることであり、得られる結合パターンは細胞の表面プロファイルを反映しています。表面抗原は、腫瘍の発生や転移、および癌に対抗するための炎症反応において重要な役割を果たしています。広範な表面プロファイルや免疫表現型は、疾患のシグネチャーとして利用することで癌の分類を向上させ、術後の最適な治療を可能にします。

それでは、始めていきましょう。ここに示す実験では、グレードAからDまでの臨床大腸がん腫瘍サンプルをHank's緩衝液で回収します。まず、2本のメスを用いて、腫瘍を1 mmの厚さに注意深くスライスします。

切片を2% collagenase type fourおよび10% DNA溶液に入れ、消化させます。同一患者の原発腫瘍部位から10 cm離れた正常な腸粘膜の切片を採取します。これをコントロールとし、腫瘍サンプルと同一の手順で処理します。

腫瘍の消化を37 °Cで1時間行い、結合組織の分解を促進させます。DNaseが損傷細胞由来のDNAを分解します。インキュベーション後、組織懸濁液をワイヤーメッシュに通し、サンプルの上からHanksバッファーで洗浄しながら、10 mLシリンジのプランジャーを使用して細胞を押し出します。この工程を、ほとんどの細胞がワイヤーメッシュを通過するまで数回繰り返します。

メッシュを用いて、細胞を未消化の結合組織から分離します。次に、細胞懸濁液を10 Mシリンジで吸い上げ、fcon 200 µmフィルター、続いてfil con 50 µmフィルターでろ過し、さらにろ過を行います。これらのより微細なフィルターを使用することで、過剰な粘液やDNAが除去され、細胞凝集塊が解離し、生存率の高い単一細胞懸濁液を得ることができます。

正常粘膜に対しても同様の処理を行います。正常粘膜は結合組織をより多く含む傾向があり、その結果、メッシュを通す際により多くの洗浄回数が必要であることが分かりました。その後、410 G、20 °Cで5分間遠心分離し、細胞懸濁液を得ます。凍結保存の準備として、細胞ペレットを750 µLの胎児牛血清で懸濁し、続いて同量のDMS含有胎児牛血清を加えます。

このDMSに溶液を滴下し、絶えず混合します。上清を分注してクライオチューブに入れ、断熱容器に配置します。これらのサンプルは-80°Cで最大1年間保存可能です。

保温とDMSOにより、細胞が破裂することなくゆっくりと融解することが期待されます。保存による副作用として赤血球集団の溶血が起こりますが、本実験において赤血球は不要であるため問題ありません。

実験にあたり、保存していたサンプルを取り出し、速やかに処理します。37 °Cのウォーターバス内で、細胞懸濁液を10 mLのHank's bufferで再懸濁してください。このバッファーによって10% DMSOおよび胎児牛血清が希釈されます。その後、20 °Cで410 ×gにて5分間遠心分離を行います。

次に、上清を捨て、500 µLのHank'sバッファーで再懸濁します。凍結および融解の過程で一部の細胞が破壊され、懸濁液中にDNAが放出されることがあります。この問題に対処するため、サンプルを0.1% DNaseとともに室温でインキュベートします。この間に、細胞生存率のカウントを行うことができます。

トリパンブルーと細胞懸濁液を等量ずつ混合し、その混合液を10 µL分、細胞計数器にピペットで分注します。顕微鏡下で、健康的で生存している細胞は無色に観察されます。一方、細胞膜が破壊された死細胞は青色に染まって観察されます。

DOT scan抗体による細胞キャプチャーには、最低400万個の生存細胞が必要です。MICRORAYへの播種後、DNA処理を行い、10 mLのHank's緩衝液で細胞を2回洗浄し、20 °Cで410 G、5分間遠心分離します。

最終的な細胞ペレットを 200 µL の RPMI 培地で懸濁します。この培地は Hanks バッファーよりも栄養分を多く含んでおり、細胞の生存能を維持しながら抗体マイクロアレイへの細胞捕捉を促進するために使用されます。大腸がんドットスキャン抗体マイクロアレイは、ニトロセルロース上に複製された 140 種類の異なる抗体ドットで構成されています。

アレイ上の各ドットには、細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体が10 nanoliters含まれています。抗体マイクロアレイを準備するために、PBSを満たしたトレイに浸してニトロセルロースを湿らせ、Kim wipesでアレイのガラス端を拭き取ります。ニトロセルロース部分に触れないよう注意しながら、マイクロアレイをトレイに置き、ニトロセルロース上に細胞懸濁液をピペットで分注します。

細胞懸濁液を均一に広げることで、すべての抗体が細胞を捕捉できる状態になります。マイクロアレイを37 °Cで1時間インキュベートします。インキュベーション中に、さまざまな細胞が沈降し、アレイ上の抗体と接触します。

抗体に対応する表面抗原を提示している細胞は、インキュベーション後に結合して捕捉されます。アレイを新鮮なPPSに3回優しく浸し、未結合の細胞を洗浄します。外側高さ10%およびPPS溶液中で、捕捉された細胞を固定します。

ニトロセルロース膜のロード部分が十分に浸る量で、固定液を穏やかにピペッティングします。室温で20分間インキュベートします。次に、マイクロアレイを新鮮なPBSに3回浸します。

過剰なフォーマーの高さは蛍光マルチプレックス解析を妨げる可能性があるため、各洗浄ステップでアレイをPBSに30秒間浸してください。次に、マイクロアレイを光にかざして細胞の結合を確認しますが、より精密な解析を行うには、DOTスキャンスキャナーと解析ソフトウェアを使用して結合パターンをスキャンし、混合細胞集団における抗原発現の定量結果を算出します。

本ソフトウェアは、8ビットのグレースケールを用いて、細胞結合の強度を背景ノイズと比較します。強度単位は最大値256に正規化されます。アレイ間の比較を容易にするため、ポジティブアイソタイプコントロールの結合は、対応するIgアイソタイプの抗体から差し引かれます。

200 µLのブロッキングバッファーをマイクロアレイに加え、室温で20分間インキュベートします。蛍光マルチプレックス法に備え、118 µLのブロッキングバッファーに10 µLのFiery結合CD3および20 µLのAlexa結合EPAMを加えます。さらに、非特異的結合を防ぐため、2 µLの熱不活化血清も混合液に添加します。

ブロッキング完了後、ブロッキングバッファーをマルチプレックス溶液に交換し、暗所で30分間インキュベートします。室温でのインキュベーション中に、CD3結合抗体がアレイに結合したCD3発現T細胞に結合し、一方でEPAM結合抗体がアレイ上の上皮細胞または大腸がん細胞に結合します。次に、マイクロアレイを新鮮なPBSで3回洗浄し、暗所で乾燥させた後、蛍光スキャンを行います。

蛍光はTyphoon FLA 9,000スキャナーで検出します。FICOeryプロファイルは532nmレーザーと580BP30エミッションフィルターを用いてスキャンし、Alexa 647は633nmレーザーと670BP30エミッションフィルターを用いてスキャンします。得られた蛍光画像は、解析のためにTIF形式に変換されます。

DOTスキャンソフトウェアを使用します。蛍光マルチプレックス法を用いることで、同一の組織サンプル内にある異なる細胞集団の抗原プロファイルを区別することが可能になります。ここに示されている画像は、大腸がんサンプルのものです。

これら3枚の画像は、光学スキャン、CD3発現細胞の蛍光スキャン、およびEPAM発現細胞の蛍光スキャンです。DOTスキャンマイクロアレイの結果では、2枚の重複スライド間で一貫した細胞結合パターンが示されるはずです。スライドの端に沿って強いアライメントドット結合が見られることは、十分な量の細胞が捕捉されたことを示しています。

細胞結合を定量化するためにPDFレポートを作成できます。棒グラフによって、正常粘膜と腫瘍サンプルの間の抗原発現の差が示されます。

光学的な結果はサンプル内のすべての細胞タイプにおける抗原発現の全体的な表現を示しましたが、AAMマルチプレックスの結果は、正常上皮細胞とがん細胞の間の抗原発現の差をより明確に示しています。差発現している抗原の多くは、グループとして既知の大腸がんバイオマーカーですが、これらを組み合わせることで、単一のバイオマーカーでは決して達成できない、層別化のためのより正確な疾患シグネチャーを提供します。CD3マルチプレックスの結果では、正常サンプルと比較してがんサンプルに多くのT細胞が存在することが示されました。

多くの場合、がんT細胞は活性化マーカーを発現しており、これらのT細胞が腫瘍浸潤リンパ球または炎症関連T細胞である可能性が考えられます。大規模な解析は、オープンソースのヒートマップおよびデータ解析ソフトウェアであるmulti experiment viewer version 4.4を用いて実施できます。大腸がんサンプルの階層的クラスタリングを用いることで、疾患ステージや患者の予後との相関性を解析することが可能です。

広範な疾患シグネチャーライブラリは、大腸がん患者の予後予測や術後治療の方針決定において非常に有用なツールとなります。本ビデオでは、DOT scan抗体マイクロアレイと蛍光マルチプレックス法を用いて、大腸がん組織の混合細胞集団における表面抗原発現をプロファイリングする手順をご紹介しました。この実験において留意すべき重要な点は、常に新鮮な組織を使用すること、および実験を成功させるためには少なくとも4 million個の生存細胞が必要であることです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。