Name: 3UTR -レポーターコンストラクトとマイクロRNAを使用してLightSwitchルシフェラーゼアッセイシステムによるヒトマイクロRNAの識別対象は付着細胞へのミミック (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 学ぶLightSwitchルシフェラーゼアッセイシステムを用いて、3'UTRレポーターコンストラクトとマイクロRNAミミックを共トランスフェクションすることで、ヒト細胞におけるマイクロRNA標的を検証する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+microRNA+sequences%2C+targets+and+gene+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+cancer+connection%3A+the+beginning+of+a+new+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale.</a> Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).</li>
<li>Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+Dicer+in+the+heart+leads+to+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).</li>
<li>Baek, D., Villen, J., Shin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455, 64-71 (2008).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+mRNAs+recruited+to+argonaute+2+by+specific+microRNAs+and+corresponding+changes+in+transcript+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance.</a> PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li>
<li>Lall, S., Krek, A., Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+map+of+conserved+microRNA+targets+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A genome-wide map of conserved microRNA targets in.</a> 16, 460-471 (2006).</li>
<li>Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-tiered+approach+identifies+a+network+of+cancer+and+liver+disease-related+genes+regulated+by+miR-122%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122.</a> J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433, 769-773 (2005).</li>
<li>Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+changes+in+protein+synthesis+induced+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs.</a> Nature. 455, 58-63 (2008).</li>
<li>Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+inhibition+of+small+RNA+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific inhibition of small RNA function.</a> PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).</li>
<li>Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+inhibition+of+microRNA-+and+siRNA-induced+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing.</a> RNA. 10, 544-5450 (2004).</li>
<li>Liao, J. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auto-regulatory+suppression+of+c-Myc+by+miR-185-3p%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem.+Epub%22%5BJournal%5D)">Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p.</a> J. Biol. Chem. Epub. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

著者はこの記事に登場するツールと試薬を作る開閉ゲノムの従業員です。この記事の生産は、開閉装置のゲノミクスによって後援されています。

私たちは、生きた細胞でのmiRNA - 3&#39;UTRの相互作用の研究を可能にするプリクローニングされたヒト3&#39;UTR -レポーターコンストラクトのゲノムワイドなコレクションを作成している。ここでは、ルシフェラーゼレポーターシステムを用いて3&#39;UTR -記者との共同トランスフェクトするmiRNAを模倣するための再現性とハイスループット法を示している。 このメソッドは、高transfectable細胞株を使用し、過剰発現技術でmiRNA活性を乱す研究者に依存しています。悪いtransfectable細胞株を用いて研究者は、シグマ（ミッション3&#39;UTRレンティGoClones）と連携して作成された私たちのコンパニオンレンチウイルス3&#39;UTR -レポーターのコレクションの使用を検討することができます。 miRNAの細胞を扱うことは過剰発現型の実験で結果を模倣し、そしてそのような研究で、研究者は、これがまたは実際の生理的条件を表していない場合がありますことを考慮する必要があります。過剰発現の懸念に対処するために、研究者は、摂動12-14つの異なるタイプの相互作用を研究するために、模倣に加えて、miRNAの阻害剤を使用することができます。 一回性のmiRNA標的が同定され、研究者は、サイトが機能的な相互作用のために必要であるかどうかを判断するために推定されるmiRNAの結合部位を突然変異を起こさせるためかもしれません。また、さまざまな潜在的なターゲットUTRs（Boutz）数百のテストにスケールアップすることもできます。研究者はmiRNAが転写の安定性や翻訳効率に影響を与えているかどうかは興味があればさらに、、ルシフェラーゼレポーターのデータは、定常状態の転写レベルの対策と比較することができる。転写レベルでの比例変化に関連付けられていないルシフェラーゼシグナルの変化は、翻訳効率に影響をポイントします。最後に、研究者は、レポーターベクターはmiRNAの濃度14の変化に異なるUTRsの相対感度を比較するために用量応答曲線を作成し使用することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> ベンダ </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>白色組織培養プレート（96ウェル固体底） </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td>ふたが付いている透明な組織培養プレート（96ウェル） </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> LightSwitchルシフェラーゼアッセイ試薬</td><td>開閉装置</td><td> LS010 </td></tr><tr><td> DharmaFECTデュオトランスフェクション試薬（0.75mL） </td><td> Dharmacon </td><td> T - 2010から02 </td></tr><tr><td>箔のプレートシーリングテープ</td><td> E＆Kサイエンティフィック</td><td> T592100 </td></tr><tr><td>通気性のプレートシーリングテープ</td><td> E＆Kサイエンティフィック</td><td> T896100 - S </td></tr><tr><td>プレートルミノメーター</td><td>分子デバイス</td><td> SpectraMax L </td></tr></tbody></table>

3&#39;utr -レポーターコンストラクトとマイクロrnaを使用してlightswitchルシフェラーゼアッセイシステムによるヒトマイクロrnaの識別対象は付着細胞へのミミック

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

マイクロRNA（miRNA）は遺伝子発現の重要な調節因子であり、多くの生物学的プロセスにおいて役割を果たす。 700以上のヒトmiRNAは、それぞれがユニークな標的mRNAの数百にまでなると、これまでに同定されている。計算ツール、表現およびプロテオミクスアッセイ、およびクロマチン免疫沈降法に基づく技術は、特定のmiRNAの直接の標的であるmRNAを同定するための重要な手がかりを提供しています。彼らはのための機能的な証拠を提供し、セルベースの​​システム内の特定のmiRNA - 3&#39;UTRの相互作用の効果を定量化するために加えて、3&#39;UTR -レポーターアッセイでは、徹底したmiRNAのターゲットの研究の重要な要素となっている。活用3&#39;UTR -レポーターアッセイにより多くの研究者を有効にして、スケールアップ高スループットのレベルにこのようなアッセイのをサポートするために、我々は高度に最適化されたLightSwitchのルシフェラーゼでは人間の3&#39;UTRルシフェラーゼレポーターのゲノムワイドなコレクションを作成しているアッセイシステム。システムはまた、ポジティブコントロール、様々な内因性の3&#39;UTRのレポーターコンストラクト、および標準化された実験的な一連のプロトコルとして使用するための合成miRNAのターゲットのレポーターコンストラクトを含みます。 ここでは、miRNA、効率的で再現性、およびハイスループット解析に従順であることを模倣するとともに、個々の3&#39;UTR -レポーターコンストラクトのコトランスフェクションのための方法を説明します。

マイクロRNA（miRNA）は遺伝子発現の重要な調節因子であり、多くの生物学的プロセスにおいて役割を果たすことが示されている。より良いmiRNAの- UTRの相互作用を理解するために、我々は新たなルシフェラーゼ遺伝子およびアッセイ試薬、LightSwitchのシステムと対になって3 UTRルシフェラーゼレポーターのゲノムワイドなコレクションを作成している。

3&#39;UTR -レポーターコンストラクトとマイクロRNAを使用してLightSwitchルシフェラーゼアッセイシステムによるヒトマイクロRNAの識別対象は付着細胞へのミミック

マイクロRNA（miRNA）は遺伝子発現の重要な調節因子であり、多くの生物学的プロセスにおいて役割を果たしています。700種類以上のヒトmiRNAが...

この手順の全般的な目的は、レポーター構築物とマイクロRNAミミックを共導入し、ヒト3' UTRにおける予測されたマイクロRNAターゲットを検証することです。まず、細胞株の選択、マイクロRNAミミックの選定、および実験用および対照用の3' UTR GoCloneレポーター構築物の選択を含む実験デザインを策定します。次に、導入の約24時間前に接着性細胞を播種します。手順の次のステップとして、各実験用または対照用の3' UTR GoCloneレポーター構築物を、マイクロRNAミミックまたは非ターゲット対照と共導入し、24〜48時間インキュベートします。最終ステップとして、LightSwitchルシフェラーゼアッセイ試薬を細胞および培地に直接添加し、プレートルミノメーターでルミネッセンス信号を読み取ります。最終的に、レポーターアッセイ技術を用いてルシフェラーゼ信号のノックダウンを測定することで、どのヒト3' UTRが特定のmicroRNAの標的であるかを示す結果を得ることができます。この手法は、生細胞内における予測されたmicroRNAと3' UTR標的の相互作用を検証するための機能的アッセイを提供するため、microRNA研究者にとって重要な疑問を解決するのに役立ちます。実験設計は、適切な、 transfection効率の高い接着性細胞株の選択から始まります。microRNA mimicを用いたアッセイは、そのmicroRNAの内因性発現レベルが低い細胞株で最も効果的に機能します。次に、マイクロRNAミミックと非標的コントロールのペアを選択してください。プラスミドと小型RNAオリゴを共導入すると、プラスミドのみを導入した場合よりもシグナルが低下するため、非標的コントロールを含めることが極めて重要です。続いて、Switchgear社のゲノムワイドコレクションから、クローン済みの3' UTR Go Cloneリポーターコンストラクトを選択します。オンラインカタログにアクセスし、「UTR search」ボタンをクリックしてください。遺伝子名、遺伝子シンボル、またはアクセッション番号のリストを入力すると、検索結果にベクターおよび配列情報とともに在庫状況が表示されます。次に、コントロールレポーター構築物を選択します。マイクロRNAの過剰発現が細胞全体の健康状態やアッセイ信号に及ぼす非特異的な影響を制御するため、ハウスキーピング遺伝子、urs、またはランダム断片など、選択したmicro RNAによって標的にされる可能性が低い3' UTRを持つコントロール構築物を選択してください。また、ミミック活性のポジティブコントロールとして合成マイクロRNAターゲットレポーターの使用も検討してください。1日目に低継代の接着性細胞を播種し、24時間後のトランスフェクション時に細胞密度が80〜100%コンフルエントになるようにします。良好な結果を得るためには、細胞を高密度にコンフルエントにすることが重要です。細胞は、白色の96ウェル組織培養プレートに、総量100 µLで播種します。並行して、細胞播種から24時間後の2日目に、クリアプレート内の細胞数が急激にコンフルエント（飽和状態）になっていないかを確認してください。その後、トランスフェクションのための解凍準備を行います。レポーター構築物とmicroRNAを室温で解凍します。解凍後、よく混ぜ合わせ、microRNAをRNaseフリー水で2 µMのワーキング濃度に希釈します。gonioplasma DNAは30 ng/µLの濃度で提供されており、さらなる希釈は不要です。トランスフェクション混合液を調製する際は、各DNA-RNAの組み合わせを3連（triplicate）でトランスフェクションすること、および実施するアッセイ数に合わせて容量を調整することを考慮してください。1回あたりのトランスフェクションにつき、9.85 µLの無血清培地と0.15 µLのDharma effect DUOを混合し、トランスフェクション試薬混合液を作成します。この混合液を室温で5分間インキュベートします。次に、各アッセイについて、3.33 µLのgo cloneレポーター構築物と、目的の最終濃度となる十分量のmicroRNA mimicを混合し、DNA-RNA混合液を作成します。無血清培地を加えて、液量を10 µLにします。次に、10 µLのトランスフェクション試薬混合液と、10 µLの各D-N-A-R-N-A混合液を合わせ、十分に混合します。これにより、各アッセイの最終容量は20 µLとなります。ウェルに蓋をして、室温で20分間インキュベートします。インキュベーション後、あらかじめ温めておいた抗生物質不含の完全培地を80 µL加え、1ウェルあたりの総量を100 µLにします。これにより、アッセイにおける最終的なmimic濃度は10から15 nMとなります。最終ステップとして、播種した細胞の各ウェルから培地を注意深く除去し、適切な最終トランスフェクション混合液 100 µL に置き換えます。プレートをインキュベーターに戻し、24～48時間インキュベートします。ほとんどの混合液では、24時間以内に有意な結果が得られます。48時間のインキュベーションを行うと、ウェル間のシグナルのばらつきが大きくなります。トランスフェクションから24時間後の3日目に、light switchルシフェラーゼアッセイ試薬を用いてルシフェラーゼアッセイを行います。細胞はすぐにアッセイするか、-80°Cで凍結して後でアッセイしてください。凍結融解サイクルを加えることで、細胞溶解が促進され、レポーターシグナルが高まります。トランスフェクションした細胞のプレートを室温に戻します。次に、キットの指示に従ってライトスイッチルシフェラーゼアッセイ溶液を調製し、滅菌済みのリザーバーに注ぎます。マルチチャンネルピペットを使用して、ライトスイッチアッセイ溶液100 µLを、白色96ウェルプレートの各サンプルウェルに直接加えます。プレートに蓋をして遮光し、室温で30分間インキュベートします。プレートルミノメーターを用いて、各ウェルを2秒間測定します。HT-1080細胞において、let-7aによる3' UTRルシフェラーゼレポーター活性のノックダウンを、各レポーター構築物とlet-7aミミックまたは非標的コントロールを共導入して測定しました。結果を分析する際は、各構築物の非標的コントロールからの信号を100%として考えます。特定のmicro RNAミミックからのシグナルを非標的コントロールのシグナルで除することで、ノックダウン率（%）を算出します。任意のmicro RNAミミックが細胞生存率全体やアッセイシグナルに非特異的な影響を及ぼす可能性があるため、これらの非特異的影響を補正します。ここに示されているように、実験的なUTR標的で観察されたノックダウンを、ハウスキーピング遺伝子またはランダムコントロールTで観察されたノックダウンと比較してください。PONCおよびarid 3Bのヒト3' UTRは、let-7a microRNAの標的です。let-7a microRNAミミックが存在すると、PONCおよびarid 3B遺伝子のヒト3' UTRリポーターからのシグナルは有意にノックダウンされます。一方で、ハウスキーピング遺伝子およびランダム配列のUTRのシグナルはノックダウンされません。このビデオを視聴することで、生細胞におけるmicroRNAミミックと3' UTRリポーター構築物の共導入（コトランスフェクション）を成功させるためのセットアップ方法と、ルミノメーターを用いてシグナルのノックダウンを測定し、その結果を読み取る方法について十分に理解できるはずです。

identifying-targets-human-micrornas-with-lightswitch-luciferase-assay

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ターゲットIDのライブラリは、miRNAのターゲットを識別するために使用されるクローニングされたcDNAのプラスミドベースのゲノムワイドなコレクションです。ここでは、その使用してアプリケーションを示しています。...

ミッションターゲットIDのライブラリを使用してmiRNAのターゲットのゲノムワイドスクリーン

概日時計は、個々の細胞内で機能する、すなわち、それらは細胞自律的である。ここでは、非侵襲的、ルシフェラーゼベースのリアルタイム生物発光技術を用いた細胞自律的なクロックモデルを生成するための方法を説明します。レポーター細胞は、概日生物学を研究するのに扱いやすい、機能的なモデル系を提供する。...

ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

ここでは、低酸素にHIF1A媒介細胞応答の新規ユビキチンおよびユビキチン様レギュレータを識別するための画面」ubiquitome」を標的としたsiRNAを実行するための方法論を説明します。これはレポーター活性のうち、堅牢な読み取りが可能な任意の生物学的経路に適合させることができる。...

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

分化したヒト神経幹細胞(hNSC)上のmiRNAの変化を特徴づける目的で、3次元システム上でのhNSC分化、miRNA...

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

ここでは、細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイを、3'...

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

3'非翻訳領域(3'UTRs)(3'LIFE)の機能的要素の発光同定は、miRNAまたは他の調節因子による3'UTRの機能調節を特定する技術です。このプロトコルは、96ウェルトランスフェクションやルシフェラーゼアッセイなどのハイスループット手法を利用して、機能的抑制のための数百の推定相互作用をスクリーニングします。...

3&#39;LIFEアッセイを用いた高スループットにおけるmiRNA標的の検出

このレポートでは、高速かつ信頼性の高い携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの検証方法について説明します。合成ビオチン化核酸 LNA のロックを用いた miRNA を模倣をキャプチャする使用していた方法は、mRNA をターゲットします。プルダウンにストレプトアビジン コートした磁気ビーズを採用するその後、ターゲット mRNA qPCR...

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

このプロトコルは、プローブベースのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、スルフォルホダミンB(SRB)アッセイ、3'未翻訳領域(3'UTR)クローニング、および目的のmiRNAの標的遺伝子を検証し、miRNAの機能を理解するためにルシフェラーゼアッセイを使用します。...

腫瘍細胞におけるマイクロRNAレベル、機能、および関連する標的遺伝子を評価するためのインビトロプロトコル

転写因子の新しい調節因子を同定するために、我々は、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイを用いて、配列レンチウイルスまたはレトロウイルスRNAiライブラリをスクリーニングするアプローチを開発した。このアプローチは、1回の実験で数百人の候補者をスクリーニングするための迅速かつ比較的安価な方法を提供します。...

アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定

イントロマイクロRNA生合成レポーターアッセイを開発し、イン ビトロ の細胞で、イントロニックmiRNAの1つ、ターゲットの1つ、調節タンパク質を過剰発現させるプラスミド、ウミシイタケの4種類のプラスミドを用いました。miRNAをプロセシングし、標的配列に結合することによってルシフェラーゼ発現を制御することができた。...

哺乳類細胞におけるイントロニックマイクロRNA成熟を解析するためのレポーターアッセイ

学ぶLightSwitchルシフェラーゼアッセイシステムを用いて、3'UTRレポーターコンストラクトとマイクロRNAミミックを共トランスフェクションすることで、ヒト細胞におけるマイクロRNA標的を検証する方法です。

3'UTR -レポーターコンストラクトとマイクロRNAを使用してLightSwitchルシフェラーゼアッセイシステムによるヒトマイクロRNAの識別対象は付着細胞へのミミック

さらに動画を探す