3'UTR -レポーターコンストラクトとマイクロRNAを使用してLightSwitchルシフェラーゼアッセイシステムによるヒトマイクロRNAの識別対象は付着細胞へのミミック

この手順の全般的な目的は、レポーター構築物とマイクロRNAミミックを共導入し、ヒト3' UTRにおける予測されたマイクロRNAターゲットを検証することです。まず、細胞株の選択、マイクロRNAミミックの選定、および実験用および対照用の3' UTR GoCloneレポーター構築物の選択を含む実験デザインを策定します。次に、導入の約24時間前に接着性細胞を播種します。手順の次のステップとして、各実験用または対照用の3' UTR GoCloneレポーター構築物を、マイクロRNAミミックまたは非ターゲット対照と共導入し、24〜48時間インキュベートします。最終ステップとして、LightSwitchルシフェラーゼアッセイ試薬を細胞および培地に直接添加し、プレートルミノメーターでルミネッセンス信号を読み取ります。

最終的に、レポーターアッセイ技術を用いてルシフェラーゼ信号のノックダウンを測定することで、どのヒト3' UTRが特定のmicroRNAの標的であるかを示す結果を得ることができます。この手法は、生細胞内における予測されたmicroRNAと3' UTR標的の相互作用を検証するための機能的アッセイを提供するため、microRNA研究者にとって重要な疑問を解決するのに役立ちます。実験設計は、適切な、 transfection効率の高い接着性細胞株の選択から始まります。microRNA mimicを用いたアッセイは、そのmicroRNAの内因性発現レベルが低い細胞株で最も効果的に機能します。

次に、マイクロRNAミミックと非標的コントロールのペアを選択してください。プラスミドと小型RNAオリゴを共導入すると、プラスミドのみを導入した場合よりもシグナルが低下するため、非標的コントロールを含めることが極めて重要です。続いて、Switchgear社のゲノムワイドコレクションから、クローン済みの3' UTR Go Cloneリポーターコンストラクトを選択します。オンラインカタログにアクセスし、「UTR search」ボタンをクリックしてください。

遺伝子名、遺伝子シンボル、またはアクセッション番号のリストを入力すると、検索結果にベクターおよび配列情報とともに在庫状況が表示されます。次に、コントロールレポーター構築物を選択します。マイクロRNAの過剰発現が細胞全体の健康状態やアッセイ信号に及ぼす非特異的な影響を制御するため、ハウスキーピング遺伝子、urs、またはランダム断片など、選択したmicro RNAによって標的にされる可能性が低い3' UTRを持つコントロール構築物を選択してください。

また、ミミック活性のポジティブコントロールとして合成マイクロRNAターゲットレポーターの使用も検討してください。1日目に低継代の接着性細胞を播種し、24時間後のトランスフェクション時に細胞密度が80〜100%コンフルエントになるようにします。良好な結果を得るためには、細胞を高密度にコンフルエントにすることが重要です。細胞は、白色の96ウェル組織培養プレートに、総量100 µLで播種します。

並行して、細胞播種から24時間後の2日目に、クリアプレート内の細胞数が急激にコンフルエント（飽和状態）になっていないかを確認してください。その後、トランスフェクションのための解凍準備を行います。

レポーター構築物とmicroRNAを室温で解凍します。解凍後、よく混ぜ合わせ、microRNAをRNaseフリー水で2 µMのワーキング濃度に希釈します。gonioplasma DNAは30 ng/µLの濃度で提供されており、さらなる希釈は不要です。トランスフェクション混合液を調製する際は、各DNA-RNAの組み合わせを3連（triplicate）でトランスフェクションすること、および実施するアッセイ数に合わせて容量を調整することを考慮してください。

1回あたりのトランスフェクションにつき、9.85 µLの無血清培地と0.15 µLのDharma effect DUOを混合し、トランスフェクション試薬混合液を作成します。この混合液を室温で5分間インキュベートします。次に、各アッセイについて、3.33 µLのgo cloneレポーター構築物と、目的の最終濃度となる十分量のmicroRNA mimicを混合し、DNA-RNA混合液を作成します。

無血清培地を加えて、液量を10 µLにします。次に、10 µLのトランスフェクション試薬混合液と、10 µLの各D-N-A-R-N-A混合液を合わせ、十分に混合します。これにより、各アッセイの最終容量は20 µLとなります。

ウェルに蓋をして、室温で20分間インキュベートします。インキュベーション後、あらかじめ温めておいた抗生物質不含の完全培地を80 µL加え、1ウェルあたりの総量を100 µLにします。これにより、アッセイにおける最終的なmimic濃度は10から15 nMとなります。

最終ステップとして、播種した細胞の各ウェルから培地を注意深く除去し、適切な最終トランスフェクション混合液 100 µL に置き換えます。プレートをインキュベーターに戻し、24～48時間インキュベートします。ほとんどの混合液では、24時間以内に有意な結果が得られます。

48時間のインキュベーションを行うと、ウェル間のシグナルのばらつきが大きくなります。トランスフェクションから24時間後の3日目に、light switchルシフェラーゼアッセイ試薬を用いてルシフェラーゼアッセイを行います。細胞はすぐにアッセイするか、-80°Cで凍結して後でアッセイしてください。凍結融解サイクルを加えることで、細胞溶解が促進され、レポーターシグナルが高まります。トランスフェクションした細胞のプレートを室温に戻します。

次に、キットの指示に従ってライトスイッチルシフェラーゼアッセイ溶液を調製し、滅菌済みのリザーバーに注ぎます。マルチチャンネルピペットを使用して、ライトスイッチアッセイ溶液100 µLを、白色96ウェルプレートの各サンプルウェルに直接加えます。プレートに蓋をして遮光し、室温で30分間インキュベートします。

プレートルミノメーターを用いて、各ウェルを2秒間測定します。HT-1080細胞において、let-7aによる3' UTRルシフェラーゼレポーター活性のノックダウンを、各レポーター構築物とlet-7aミミックまたは非標的コントロールを共導入して測定しました。結果を分析する際は、各構築物の非標的コントロールからの信号を100%として考えます。

特定のmicro RNAミミックからのシグナルを非標的コントロールのシグナルで除することで、ノックダウン率（%）を算出します。任意のmicro RNAミミックが細胞生存率全体やアッセイシグナルに非特異的な影響を及ぼす可能性があるため、これらの非特異的影響を補正します。ここに示されているように、実験的なUTR標的で観察されたノックダウンを、ハウスキーピング遺伝子またはランダムコントロールTで観察されたノックダウンと比較してください。

PONCおよびarid 3Bのヒト3' UTRは、let-7a microRNAの標的です。let-7a microRNAミミックが存在すると、PONCおよびarid 3B遺伝子のヒト3' UTRリポーターからのシグナルは有意にノックダウンされます。一方で、ハウスキーピング遺伝子およびランダム配列のUTRのシグナルはノックダウンされません。このビデオを視聴することで、生細胞におけるmicroRNAミミックと3' UTRリポーター構築物の共導入（コトランスフェクション）を成功させるためのセットアップ方法と、ルミノメーターを用いてシグナルのノックダウンを測定し、その結果を読み取る方法について十分に理解できるはずです。