の寄生蜂の紹介ショウジョウバエと抗寄生虫免疫応答

本手順の全体的な目的は、ショウジョウバエをホストとした寄生蜂の飼育方法、およびリンパ腺と脂肪体の解剖方法を示すことです。まず、ショウジョウバエの幼虫を用いてハチを飼育します。その後、個体を解剖して幼虫のリンパ腺を単離します。この工程には、クチクラを剥がし、脂肪体やその他の微細構造を除去してリンパ腺を単離する操作が含まれます。

同様に、免疫細胞化学および蛍光顕微鏡を用いた同様の手順で、脂肪体自体を単離することができます。免疫組織における遺伝子発現および細胞特異的な変化を可視化します。蜂による寄生後、ショウジョウバエのホストとその寄生蜂を利用した、感染と免疫のユニークなシステムについて研究します。

当研究室は、ショウジョウバエ寄生蜂の生きた培養物を維持している数少ない研究室の一つです。そのため、私たちはしばしば手法の共有を求められます。寄生蜂は多くの昆虫にとっての天敵です。

我々が研究している種は、多くのショウジョウバエ種の幼虫期に攻撃を仕掛けます。研究室では、寄生蜂の攻撃によって昆虫の免疫系がどのような影響を受けるかを理解するために、drosophila melan gastroを使用しています。さらに、寄生蜂が宿主の防御を克服するために用いる戦略を明らかにしたいと考えています。

一般的に、脂肪体やリンパ腺の解剖に不慣れな方は苦労することが多いです。なぜなら、oph幼虫は飼育しやすい一方でサイズがかなり小さく、これらの幼虫組織を日常的に容易に解剖するには、かなりの習熟が必要だからです。NF kappa Bシグナルの構成的活性化が、細胞組織の自己免疫様カプセル化を誘導することを発見した後、私たちはこの反応がoph fla変異体でどのように起こるかに興味を持ちました。そこで、誘導されたカプセル化がその自然な対応関係にあると仮定し、本日実演する標準プロトコルを開発しました。それでは、ハチの培養方法と維持方法について説明します。

まず、新しく調製した酵母ペーストを少量塗布した、新鮮なショウジョウバエ用餌 vial を準備します。50から60匹の若い野生型フライを vial に移し、24°C で48時間卵を産ませます。2日間の産卵後、vial からフライを取り除き、バズプラグに蜂蜜を1滴加えます。

最後に、バイアルのキャップを締めます。ハチはショウジョウバエよりもガスに敏感であるため、麻酔をかける前に二酸化炭素の流量を下げてください。ハチに麻酔をかける準備ができたら、雌6〜8匹と雄6〜8匹を選別し、バイアルに入れます。

ショウジョウバエの卵および幼虫と共に。寄生蜂が目覚めるまで、バイアルをそっと横にして置きます。その後、バイアルを24 degrees Celsiusのインキュベーターに入れます。

影響を受けていないgiloホストおよび自己防衛に成功したホストは、通常の発生時点で蛹化します。これらは、寄生蜂が羽化する前に除去することが可能です。寄生蜂は通常25〜30日頃に羽化するため、同一の発育段階にある寄生蜂を準備してください。

免疫組織または寄生虫の解剖のために感染幼虫を回収する場合、寄生蜂を、48時間ではなく2〜6時間の期間に産卵させたホスト卵を用いて飼育します。フライバイアルの内容物を、小さなガラス製またはプラスチック製のペトリ皿に移します。次に、実体顕微鏡と微細ピンセットを用いて、6〜10匹の幼虫を慎重にピックアップします。

まず、幼虫を1XPBSが入ったウェルに入れ、次に水、70%エタノール水、そして再び1XPBSへと順次移します。これらの手順の目的は、動物からフライフードを取り除き、表面を徹底的に洗浄および滅菌することです。Zes 1000解剖顕微鏡の解剖ステージ上に、サンプルに透過光を照射できるライトボックスを設置します。

精密ピンセットを用いて、PBSから洗浄済みの3齢放浪幼虫を選択します。幼虫を顕微鏡スライドガラスの上に置きます。ピンセットを使用して、動物の腹側が上になるように配置します。

生物体が透明に見え、内部器官が観察できるように、光源を試料から傾けます。幼虫をスライドガラスに移動させる際は、PBSが過剰に付着していないことを確認してください。PBSが多いと、切断操作が困難になる場合があります。2組のピンセットを用い、後端の両側で個体を保持し、クチクラをゆっくりと引っ張って、クチクラ表面に小さな裂け目を作ります。

血球、腸、脂肪体を含む血リンパが体腔から流出し始めます。必要に応じて塗抹標本を作成する場合、10 µL ピペットマンで血リンパを採取します。その際、2本のピンセットを動物の口鉤のすぐ下の左側に慎重に配置してください。その後、クチクラを軽く切り裂きます。

2本のピンセットを動物の口鉤のすぐ下の右側に移動させ、慎重にもう一度小さな切り込みを入れます。次に、動物の口鉤を保持しながら、クチクラを動物の後端に向かってゆっくりと剥がします。クチクラを剥がすと、脳、脂肪体、成虫盤、唾液腺、および前気管が露出します。

後端で切り離された角皮には、リンパ腺が付着した背血管があります。リンパ腺は脳の下に位置しています。確認された心室を切り取り、リンパ腺領域から遠ざけます。

リンパ腺から脂肪、体壁、腸、唾液腺、およびその他の組織を慎重に除き、剥離させます。この際、リンパ腺が、脳の後方に位置する環状腺および背血管から切り離されないように注意してください。リンパ腺を顕微鏡スライドの上に平らに置き、前葉から最後の心膜細胞群まで腺全体が完全に展開するまで、付着しているすべての不要な組織を慎重に除去します。

腺を固定し、Zes 1000実体顕微鏡の解剖ステージ上で染色する準備が整いました。サンプルに透過光が当たるようにライトボックスを配置します。洗浄済みの3齢幼虫を顕微鏡上に置きます。

1X PBS 200 µLを滴下します。生物体が透明に見え、内臓が確認できるよう、光源をサンプルから遠ざけます。ピンセットを使用して、動物の前端が自分から遠くなるように配置します。

次のステップでは、内部器官に触れることなく角皮のみを切り裂くために、ピンセットを配置する位置に注意することが重要です。1組のピンセットで口の左側の幼虫の角皮を固定し、もう1組のピンセットで引っ掛けます。反対側の角皮を後端まで慎重に切り裂いてください。

後端で角皮を体から完全に剥がさないように止め、非常に慎重に腸を片側に除けて除去し始めます。次に、背脈を貫いているリンパ腺とともに、脳成虫盤と環状腺をそっと除去します。最後に、脂肪体の両側にある角皮をそっと除去します。

唾液腺の両側に脂肪体が存在するため、唾液腺は除去しないでください。組織の固定および染色に進む前に、必ずPBSを除去してください。適切に解剖された脂肪体サンプルは、正常な細胞接触が維持されており、解剖されたサンプルの周囲に脂肪球が最小限である必要があります。

寄生蜂の感染が遺伝子発現に及ぼす影響をin vivoで可視化します。非感染の対照個体において、Theso Mycinプロモーターに連結したGFPレポーターを用いたところ、GFPの発現は検出されませんでした。一方、l Victoriaに感染した個体から摘出した脂肪体の細胞質では、GFPシグナルが明確に検出されました。

El Victoria感染後に前葉で誘導される細胞変化を可視化するため、リンパ腺を解剖した。misshapenエンハンサーによって駆動されるGFPで標識された新しく分化した細胞が、葉の周辺部に認められる。通常、腺は葉を連続的に囲んでいる。

しかしながら、これらの解剖結果から、ハチの感染後には基底膜に不連続性が認められたため、これらの腺における前葉の完全性は損なわれていました。血リンパ中の細胞は塗抹標本で可視化されました。一部のリンパ球は、betzelの発現を検出するために、寄生虫の成長を阻止するカプセル形成に関与していました。

摘出されたリンパ腺。リンパ腺をポリクローナル抗schpeil抗体でin vivo染色した。未感染の対照群と比較して、ハチの感染後にリンパ腺細胞内のschpeilレベルが上昇した。

本手順を実施する際は、目的とする生物学的年齢の食道培養物を準備することが重要です。手作業による操作が免疫反応を誘発しないよう、慎重に取り扱ってください。本手順の後、解剖した器官、脂肪体、およびリンパ腺を用いて、抽出したRNAまたはタンパク質を用いてRNAおよびタンパク質を抽出することができます。

遺伝子およびタンパク質の発現を調べるために、PCRまたはウェスタンブロット分析を行うことができます。このビデオを視聴することで、ショウジョウバエ宿主における寄生虫の育成方法と、免疫組織を採取して免疫組織化学染色やその他のアプリケーションに供するための解剖手順について、十分に理解できるはずです。