Name: 小型二重特異性アフィニティタグによって容易に直交するタンパク質の精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぼう、小型二重特異性アフィニティタグを用いた直交タンパク質精製法。E. coliで発現した融合タンパク質をHSAとZドメインカラムで二段階精製し、高純度タンパク質を効率的に得る手法です。

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このプロジェクトは、クヌートとアリスバレンベリー財団とスウェーデンの研究評議会によって資金を供給された。

1。ターゲットのクローニングは、融合構築物をgene/ABDz1-tagged <ol><li>発現プラスミドに目的遺伝子（プラスミド含むABDz1は材料移転契約を通じて自由に利用可能である）のN末端ライゲーションのための適当な制限部位に隣接ABDz1遺伝子のPCR断片を準備する。 </li><li>適切な反応バッファーで選択した制限酵素による開裂精製発現ベクターとPCR断片。ライゲーションの前に製品を精製する。 </li><li>目的の遺伝子を含む発現ベクターに制限されたABDz1断片をライゲーションし、E.にライゲーション産物を変換大腸菌 （元のメソッドでRR1ΔM15ひずみが8を使用していた）。選択のための適切な抗生物質を補充した寒天プレート上で形質転換細胞を広げる。 </li><li> PCR画面少数のコロニーとシーケンスは、DNAシーケンシングにより得られた発現カセットを確認してください。 </li><li>シーケンスverifの一晩培養液からプラスミド準備IEDコロニーと好ましい発現株（ヒト遺伝子がコードするタンパク質の産生を向上させるためにプラスミドpRAREをホスティングしているロゼッタ元のメソッド大腸菌 （DE3）、で、使用された）に変換。 </li></ol> 2。タンパク質発現<ol><li> 5g / lの酵母エキスと適切な抗生物質を補充したトリプシン大豆ブロス10mlに単一の細菌コロニーを接種。 37℃で一晩150rpmでインキュベートする。 </li><li> 100ミリリットルの新鮮な培地で一晩培養液1mlを接種し、細胞が対数増殖期に達するとタンパク質発現（lacオペロンを利用したイソプロピル-β- D -チオガラクトシド本来の1mM）を誘導する。 </li><li>遠心分離で25℃一晩と収穫細胞で150rpmでインキュベートする。 </li></ol> 3。直交アフィニティー精製<ol><li> 25ミリリットルランニングバッファー（25mMのトリス- HCl、200 mMのNaCl、1mMのEDTA、0.05％（w / v）のTween 20を、pH8.0）にペレットを再懸濁し、目を混乱させる60％の振幅と3分間1.0/1.0パルスで超音波処理によってEが細胞。サンプルを遠心し、さらに精製する前に、上清を（0.45μM）を含む標的タンパク質をフィルタリング。 </li><li>適切なタンパク質精製システムで、1ml /分でバッファを実行しているの10カラム体積（CV）を使用して、以前に販売業者の勧告によるとHSAとの結合のどちらか1ミリリットルHSAセファロースカラムまたはNHS -活性化カラムを、平衡化させます。 0.5ml /分で細菌のライセートをロードして、流速は1ml /分にリセットされます。 </li><li>洗浄バッファーの5 CV（5 mMのNH 4 AC、pH5.5）に続いて実行されているバッファの5 CVでカラムを洗浄。 </li><li> 1ml /分で溶出バッファー（0.5 M HAC、pHは2.5）でサンプルを溶出し、さらに精製するための溶出ピークからの画分を選択するには280nmで、モニターの吸収を画分を集めた。 </li><li>プール最高タンパク質濃度と分画は、確かにランニングバッファー（20mMリン酸、150mMのNaCl、pH7.2）中で2回希釈し、pHが中性付近であることを確認してください。 pHは必要に応じて増加させる1 Mトリス塩酸pHが8を追加します。 </li><li> 1ml /分で確かにランニングバッファーの10 CVで平衡化した1mlのハイトラップのMabSelect確かカラムに0.5ml /分でサンプルをロードします。ローディング後1 ml / minの流量をリセットします。 </li><li>確かにランニングバッファーの5 CV（ステップ5）でカラムを洗浄し、0.2 M HAC、pHは2.7でタンパク質を溶出させる。敏感な標的タンパク質の場合は溶出液は、トリス- HClの添加によっては採取後、直接中和することができる。 </li></ol>クロマトグラフィー工程はMabSelectの溶出液を逆にしている場合は確かにカラムを緩衝液（ステップ3.1）実行中に希釈し、pHは1 Mトリス- HClを加えて約8に増加することができます。確かに行列は第二段階で採用されている場合、一般的に、狭いピークが観察される。 4。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS - PAGE）により純度の評価<ol><li>で精製した画分をロードするSDS - PAGEを削減し、必要に応じて、質量分析法により精製物の分子量を分析する。 ABDz1の遊離システインは、非還元条件下での製品の二量体化を引き起こす可能性があるので、それはサンプルを完全に削減することが重要です。 </li></ol> 5。代表的な結果： 原理の証明として、ABDz1タグによって促進された直交アフィニティー精製は、異なる溶解性クラス、分子量および等電点（表1）を表す3つのヒト標的タンパク質を評価した。 ABDz1遺伝子が遺伝的に標的遺伝子に融合され、構造が大腸菌で発現され、図2は、連続してメソッド内のすべてのステップのためのフローチャートを示しています。直交プロトコルによる精製の後、異なる時点で採取した試料は、SDS - PAGE（図3）により分析した。結果は明らかに二重のタグが二高度に特異的な精製段階の有用性を示す。合理的な純度はACであるにもかかわらず、としてゲルから見た初期精製ステップの後にhieved、連続的なステップはよく非常に要求の厳しいアプリケーションに最適な非常に純粋な生成物が得られる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1二重特異性ABDz1タグの選択に使用するコンビナトリアルライブラリーのデザイン。 46アミノ酸アルブミン結合ドメインの安定threeヘリックス束に折り目と、それは主に第2ヘリックスに位置するヒト血清アルブミンに対する結合部位が含まれています。遺伝的にファーストとサードヘリックスに位置eleven表面露出アミノ酸をランダム化することにより、新規の結合面が設計されました。 elevenの位置は図に示され、Kraulisらによれば、番号が付けられています。9。ファージ上に発現するコンビナトリアルライブラリとブドウ球菌蛋白質のZ -ドメインの二量体に対するバイオパニングに続いて、二重特異性ABDz1分子が同定された。 <img alt='"図2"SRC' files> 図2。直交アフィニティー精製プロトコールの簡易フローチャート。 ABDz1配列を含むPCRフラグメントを適当な発現ベクターに目的の遺伝子で（N末端）連結されている。ライゲーション産物を大腸菌に形質転換されるシーケンスの検証とプラスミド調製用の大腸菌 。発現宿主に形質転換後、組換えタンパク質発現のための大量培養は、最初の一晩培養から設定されています。細菌を遠心分離により回収し、標的タンパク質を含む細菌溶解物を生成するために超音波処理によって溶解されています。残留固体粒子を除去する濾過工程の後、ライセートは、連続する二つの精製工程を経ることにより、液体ハンドリングシステム上で直交するアフィニティー精製に供される。両方の精製工程からの溶出ピークをサンプリングし、評価をSDS - PAGEにより純度を評価するとtを比較し彼は、精製前にライセート。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> ABDz1と融合して発現し、精製した標的タンパク質の図3。SDS - PAGE分析。 異なる特性を表すABDz1、、とABDz1タグ自体に融合で表現三つのタンパク質の細菌溶解物から採取したサンプルは、確実なカラムMabSelect続いてHSA -カラム上で精製から対応するピークからのサンプルと一緒に採取された（） 。レーン1-4 9-12 MabSelect確かに精製（第二段階）から精製、HSA -精製からレーン5-8（第一段階）と車線の前に溶解液からサンプルを表します。 ABDz1 - 141377、ABDz1 - HT875、ABDz1 - HT2375とABDz1：サンプルは次の順序で読み込まれます。さらに、同じ列に逆の順序で精製した同じ溶解物から取得したサンプルを分析した（B）。 1から3レーンは、精製前にライセートからレーン4-6 fをサンプルを表してHSA -精製（第二段階）からROM MabSelect確実な精製（第一段階）とレーン7-9サンプルは、（A）が、タグ自体が含まれていないのと同じ順序でロードされた。これらの結果から、この二段階方式に関係なく手順が適用される順序の高度に精製したタンパク質をもたらすことは明らかである。 <table border="1"><tbody><tr><td> 名前B </td><td> 標的タンパク質 UNIPROT C </td><td> 分子 重量（分子量） </td><td> 溶解度 クラスD </td><td> 分子 融合産物（分子量）の </td><td> 等電点 融合産物の </td></tr><tr><td> 141377 </td><td> B7Z315 </td><td> 17.4 </td><td> 4 </td><td> 23.7 </td><td> 8.5 </td></tr><tr><td> HT875 </td><td> P01040 </td><td> 10.8 </td><td> 3 </td><td> 17.1 </td><td> 4.9 </td></tr><tr><td> HT2375 </td><td> P00740 </td><td> 8.9 </td><td> 5 </td><td> 15.2 </td><td> 6.8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha"><li>単独でABDz1タグの分子量は6.3 kDaの、等電点6.7です。 </li><li>標的タンパク質は、UniProtのタンパク質の一部を表します。 </li><li> <a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a> 。 </li><li> N -末端His 6 ABP 10のタンパク質断片の溶解度クラス。 </li></ol>表1。 ABDz1タグと標的タンパク質との融合製品は、原理の研究の証拠で評価。 異なる分子量、溶解性及び等電点を持つ3つのユニークな人間のタンパク質は、直交する親和性のアプローチによって発現および精製のために選ばれた。

<ol><li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+most+of+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22CET%22%5BJournal%5D)">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li>
<li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelate+affinity+chromatography%2C+a+new+approach+to+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li>
<li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li>
<li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li>
<li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li>
<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+affinity+domains+for+the+detection%2C+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li>
<li>Rüther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li>
<li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle%3A+a+heteronuclear+NMR+study%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li>
<li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sympos.+Ser%22%5BJournal%5D)">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PEDS%22%5BJournal%5D)">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li>
<li>Gräslund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介する直交アフィニティー精製プロトコールは、標的タンパク質の広い範囲の効率的な精製が可能になります。新規の結合面とアルブミン結合ドメインの固有の結合部位を組み合わせることで、小さな二重特異性タンパク質のタグが開発されました。それは単に好みの発現ベクターへの関心の任意のタンパク質にクローニングし、融合で表現できるので、タグを利用することは非常に簡単です。ほとんどの研究室で利用できる標準的な装置は、2段階のタンパク質精製に用いることができる。 ABDz1タグの機能を効率的にその二つの結合面を公開するドメインの正しいフォールディングに依存しているので、方法は、可溶性形態で発現されるタンパク質に制限され、変性条件下で精製には適していません。彼らはMabSelect確かマトリックス上にZ -ドメインへABDz1の結合を妨害するので、還元剤も避けるべきである。 直交親和性精製用るには、非常に多くの要求の厳しいアプリケーションでのタンパク質の精製の要件を満たすために、従来の方法に有用な代替手段を提供します。同時に、この方法は、別の精製戦略を連続して使用されているコンビナトリアルタグ付けする必要がなくなります。ネイティブターゲットのタンパク質を必要とするアプリケーションには、プロテアーゼの切断部位は、可能な限りABDz1タグ11の酵素的除去をレンダリングするために導入される可能性があります。さらに、ABDz1タグは、日付に説明した最初の二重特異性小と折り畳まれたタンパク質のドメインです。は、2つのターゲット特異的親和性の相互作用に依存する精製戦略を提供するので、それはユニークです。将来的には、容易に入手可能で安価なクロマトグラフィー樹脂と互換性のある新たな結合面を運ぶ新たな二重特異性タグを開発することにより、この概念を拡張するために興味深いものになるだろう。例えば、塩基性残基とアルブミン結合に関与するアミノ酸を置き換えることにより、私との互換性タグ交換クロマトグラフィーで得られる場合があります。同様の概念はそれぞれ、Z 酸 12と陰イオンと陽イオン交換と互換性のあるZ 基本的な 13として知られているタグを生成するためにZ -ドメインの電荷のエンジニアリングによって効果が証明されています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> 大腸菌 RR1ΔM15 </td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td> 35102 </td></tr><tr><td>ロゼッタ大腸菌 （DE3） </td><td> Novagen社</td><td> 70954 </td></tr><tr><td>トリプシン大豆ブイヨン</td><td>ディフコ</td><td> 211822 </td></tr><tr><td>酵母の抽出</td><td>ディフコ</td><td> 212720 </td></tr><tr><td>振動の細胞の音波処理</td><td>ソニックスと材料</td><td> - </td></tr><tr><td> HSAセファロース</td><td>ファルマシアバイオテク</td><td>旧製品</td></tr><tr><td>確かにハイトラップMabSelect </td><td> GEヘルスケア</td><td> 11-0034-93 </td></tr><tr><td>ハイトラップNHS -活性化HPカラム</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-0716-01 </td></tr></tbody></table>

小型二重特異性アフィニティタグによって容易に直交するタンパク質の精製

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

プロトコルは、合理化する必要がある組換えタンパク質の精製に伴う高コストのために。ハイスループットな努力のために、標的タンパク質の特定の最適化1を必要としない一般的な方法が求められている。これを達成するために、遺伝的に関心の遺伝子に融合させることができる精製タグは、一般的に2を使用されています。最も広く使用されている親和性のハンドルは、ネイティブと変性条件3の両方での精製に適しているヘキサ-ヒスチジンタグ、です。タグを生成するための代謝負担は低いですが、競合するアフィニティークロマトグラフィーベースの戦略の1,2のような高特異性としては提供されません。 ここでは、46アミノ酸の異なる2つの結合部位を有する二重特異精製タグは、小さなタンパク質ドメインが開発されている。アルブミン結合ドメインは、連鎖球菌プロテインGに由来し、ヒト血清アルブミンへの強力な固有の親和性を有している（HSA）。アルブミン結合4に関与していない十一面に露出したアミノ酸は、コンビナトリアルライブラリーを生成するために遺伝的に無作為に割り付けられた。小説で蛋白質のライブラリをランダムに配置された結合面（図1）は、ファージディスプレイ技術によるバインダーの選択を容易にするために、ファージ粒子上に発現していた。ブドウ球菌性タンパク質5から派生した二量体のZ -ドメインに対するバイオパニングのいくつかのラウンドを通じ、HSAおよび新規ターゲットの両方に対して親和性を有する小、二重特異性分子は、6を同定された。 ABDz1と呼ばれる新規な蛋白質ドメインは、異なる分子量、溶解性及び等電点を持つ標的タンパク質の選択のための精製タグとして評価した。 3つのターゲットタンパク質は、それらのN -末端およびその後アフィニティー精製に融合させた斬新なタグでEscherishia大腸菌で発現させた。固定化HSAまたはZ -ドメインのいずれかで列で初期精製はrelatiをもたらしたvely純粋な製品。二重特異性タグと二段階のアフィニティー精製は、タンパク質の純度の大幅な改善が得られた。固定化Z -ドメインとのクロマトグラフ媒体は、確かに例のMabSelectのために、容易に化学的に第二のマトリックスを提供するためにメディアに結合することができる抗体とHSAの精製のために容易に入手可能である。 回収された標的タンパク質の純度の高需要がある場合は、この方法が特に有利である。発現宿主の代謝負担がタグの小さなサイズのために制限されている間にタグの二機能性は、2つの異なるクロマトグラフィー工程を使用することができます。それは複数のタグを組み合わせて1,7で使用されている、いわゆるコンビナトリアルタギングに競争力のある代替手段を提供します。

小説や高効率二段アフィニティークロマトグラフィーのプロトコルが開発され、詳細に説明されている。方法は2つの固有の親和性を持つ小型の精製タグに基づいており、異なるプロパティを持つ標的タンパク質の広い範囲に適用可能です。

組換えタンパク質の精製に伴うコストが高いため、プロトコルの合理化が必要です。ハイスループットな取り組みにおいては、...

本実験の目的は、2段階のアフィニティー精製の手順を用いて、極めて純度の高い組換えタンパク質を調製することです。この目的を達成するため、アルブミン結合ドメインに基づいた二特異性精製タグを目的遺伝子を含む発現ベクターにクローニングし、続いて大腸菌（e coli）で融合タンパク質を発現させます。第2段階として、標的タンパク質を含む細菌溶解液を、ヒト血清アルブミン（HSA）が固定化されたクロマトグラフィーカラムで精製します。続いて、ブドウ球菌プロテインA由来のZドメインを固定化したMAB select superior resistanceまたはsureカラムを用いて、追加の精製を行います。これにより、高度な要求がなされるアプリケーションに適した高純度の産物が得られます。次に、目的タンパク質が均一に精製されたことを確認するため、SDS-PAGE、および必要に応じて質量分析により純度を評価します。その結果、本プロトコルで利用した新規の二特異性精製タグを用いた2段階の連続的な精製は、単一ステップの精製と比較して効率的な精製であることが示されます。1ステップのアフィニティー精製などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、標的タンパク質の特性にかかわらず、単一のアフィニティーハンドルのみを用いたシンプルなプロトコルで純粋なタンパク質を得られることです。この手法は、非常に多様な特性を持つタンパク質に適用可能です。また、タグが非常に小さいため、細菌ホストによる生産が容易です。一般的に、この精製手順に不慣れな方にとっても、非常にシンプルで分かりやすいと感じられるでしょう。重要なステップとして、2番目のカラムにロードする前にサンプルのpHを調整します。ストレプトコッカスProtein G由来の既存のアルブミン結合ドメインに、追加の結合部位を組み込むことで、2つの固有の親和性を持つ小型の精製タグが開発されました。46アミノ酸からなるアルブミン結合ドメインは、安定した3本ヘリックス束に折りたたまれており、主に2番目のヘリックスにヒト血清アルブミン（HSA）の結合部位を有しています。1番目と3番目のヘリックスに位置する表面露出アミノ酸11個を遺伝的にランダム化することで、新しい結合表面が設計されました。ファージで発現させたコンビナトリアルライブラリを用いて、スタフィロコッカスProtein A由来のZドメインに対する数回のバイオパンニングを行った結果、HSAとZドメインの両方に親和性を持つA BDZ1と呼ばれる二特異性分子が得られました。二特異性融合タグ発現プラスミドを調製するには、まず、適切な制限酵素部位で挟まれたA BDZ1遺伝子のPCRフラグメントを調製します。次に、適切な反応バッファー中で、選択した制限酵素を用いてA BDZ1 PCRフラグメントと、目的遺伝子を含む精製済み発現ベクターを消化します。ライゲーションの前に、これらの産物を精製してください。次に、制限酵素処理したA BDZ oneフラグメントを目的遺伝子を含む発現ベクターにライゲーションし、そのライゲーション産物を大腸菌に形質転換します。形質転換した細胞を、選択に適した抗生物質を添加したアガープレートに塗布します。いくつかのコロニーをPCRでスクリーニングし、DNAシーケンシングによって得られた発現カセットの配列を確認します。最後に、配列を確認したコロニーを好みの発現株に形質転換し、一晩培養してプラスミドを調製し、標的タンパク質を発現させます。末端に新規タグを融合させた状態で、まず単一の細菌コロニーを、5 g/Lの酵母エキスと適切な抗生物質を添加した10 mLのトリプチカソイブロスに接種し、150 RPM、37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、一晩培養した培養液1 mLを100 mLの新鮮な培地に接種し、タンパク質発現を誘導します。細胞が対数増殖期に達したとき、タンパク質誘導後、細胞を150 RPM、25 °Cで一晩インキュベートし、翌日、遠心分離により細胞を回収します。A BDZ 1融合タンパク質の直交アフィニティ精製は、まず、HSAまたはzomaを固定化したカラムを用いて初期精製を行うことで達成されます。その後、二特異性タグの2番目のアフィニティを利用して、連続的な精製ステップを実施します。抗体の精製には、MA select sureなどのZドメインが固定化されたクロマトグラフィー担体が容易に入手可能です。一方、HSAを担体に化学的に結合させることで、直交アフィニティー精製を進めるための2つ目のマトリックスを用意できます。ペレットを25 mLのランニングバッファーに再懸濁させます。次に、振幅60%で1秒間のパルスと1秒間の休止を繰り返し、計3分間超音波処理を行い、細胞を破砕します。サンプルの遠心分離後、さらなる精製を行う前に、標的タンパク質を含む上清を0.45 micronフィルターでろ過します。次に、適切なタンパク質精製システムを用い、1 mLのHSA spherosカラムまたはHSAを結合させたNHS活性化カラムを、1 mL/minの流速でランニングバッファー10カラム分を用いて平衡化します。平衡化後、細菌溶解物を0.5 mL/minでロードし、流速を1 mL/minに戻して、ランニングバッファー5カラム分でカラムを洗浄し、続いて洗浄バッファー5カラム分で洗浄します。1 mL/minの流速で溶出バッファーを用いてサンプルを溶出し、分画を回収します。280 nmでの吸光度をモニタリングし、溶出ピークから分画を選択します。さらに精製を行う場合は、タンパク質濃度が最も高い分画を合わせて回収し、2倍に希釈します。ランニングバッファーを準備し、pHが中性付近であることを確認してください。このステップは、Zドメインへのタンパク質の結合において極めて重要です。必要に応じて、pHを上げるために1 M Tris-HCl (pH 8) を添加してください。次に、サンプルを0.5 mL/minで1 mLの高トラップMAにロードし、Sureランニングバッファーで平衡化したSureカラムを選択します。流量を1 mL/minにリセットした後、カラムを5カラムボリュームのSureランニングバッファーで洗浄します。その後、感度の高い標的タンパク質に対しては、0.2 M 酢酸（pH 2.7）でタンパク質を溶出させます。EITは、採取直後にT trisを添加することで直接中和できます。タンパク質の純度評価には、H-C-L-S-D-Sページを用いることができます。A BDZ oneの遊離システインが非還元条件下で産物の二量体化を引き起こす可能性があるため、サンプルを完全に還元することが重要です。最終ステップとして、HSAカラムおよびそれに続くMA select sureカラムを用いた直交プロトコルによる精製後、精製物の分子量を質量分析法で解析することができます。複数の精製段階で回収した異なるサンプルをSDS-PAGEで解析しました。サンプルには、A BDZ oneタグ単体、および異なる溶解度クラス、分子量、等電点を代表する、A BDZ oneを融合させた3種類のヒト標的タンパク質が含まれています。レーン1から4は、3種類の異なるAB DZ 1融合タンパク質およびAB DZ 1タグ自体の精製前のタンパク質溶解物を示しています。レーン5から8は、これらのタンパク質のHSA精製ステップの結果を示しています。最後に、レーン9から12は、最終的なmAbs select Sure精製ステップの結果を示しています。さらに、同一のカラムを用いて逆の手順で精製した同一ライセートから得られたサンプルをここで分析しました。レーン1から3は精製前のライセートを示し、レーン4から6はMAB Select Sureカラムによる最初の精製ステップ後のサンプルです。レーン7から9に見られる高純度の産物は、最終的なHSA精製によるものです。これらの結果は、デュアルタグの使用と2段階の極めて特異的な精製ステップの有用性を明確に示しています。ゲル画像からわかるように、最初の精製ステップ後でもある程度の純度は得られますが、それに続くステップにより、非常に要求水準の高いアプリケーションに適した極めて純度の高い産物が得られます。この手法の中核となる精製ステップを習得すれば、1人でも数時間で完了することができ、多種多様なアプリケーションに適した高純度の組換えタンパク質を得ることが可能です。例えば、本手順に従って精製された生体分子は、複合体の結合強度などの疑問を解消するための相互作用解析など、他のアプリケーションに利用できます。このビデオを視聴することで、このデュアルアフィニティータグを利用して、極めて純度の高いタンパク質産物を得る方法を十分に理解できるはずです。

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