小型二重特異性アフィニティタグによって容易に直交するタンパク質の精製

本実験の目的は、2段階のアフィニティー精製の手順を用いて、極めて純度の高い組換えタンパク質を調製することです。この目的を達成するため、アルブミン結合ドメインに基づいた二特異性精製タグを目的遺伝子を含む発現ベクターにクローニングし、続いて大腸菌（e coli）で融合タンパク質を発現させます。第2段階として、標的タンパク質を含む細菌溶解液を、ヒト血清アルブミン（HSA）が固定化されたクロマトグラフィーカラムで精製します。

続いて、ブドウ球菌プロテインA由来のZドメインを固定化したMAB select superior resistanceまたはsureカラムを用いて、追加の精製を行います。これにより、高度な要求がなされるアプリケーションに適した高純度の産物が得られます。次に、目的タンパク質が均一に精製されたことを確認するため、SDS-PAGE、および必要に応じて質量分析により純度を評価します。その結果、本プロトコルで利用した新規の二特異性精製タグを用いた2段階の連続的な精製は、単一ステップの精製と比較して効率的な精製であることが示されます。1ステップのアフィニティー精製などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、標的タンパク質の特性にかかわらず、単一のアフィニティーハンドルのみを用いたシンプルなプロトコルで純粋なタンパク質を得られることです。

この手法は、非常に多様な特性を持つタンパク質に適用可能です。また、タグが非常に小さいため、細菌ホストによる生産が容易です。一般的に、この精製手順に不慣れな方にとっても、非常にシンプルで分かりやすいと感じられるでしょう。

重要なステップとして、2番目のカラムにロードする前にサンプルのpHを調整します。ストレプトコッカスProtein G由来の既存のアルブミン結合ドメインに、追加の結合部位を組み込むことで、2つの固有の親和性を持つ小型の精製タグが開発されました。46アミノ酸からなるアルブミン結合ドメインは、安定した3本ヘリックス束に折りたたまれており、主に2番目のヘリックスにヒト血清アルブミン（HSA）の結合部位を有しています。1番目と3番目のヘリックスに位置する表面露出アミノ酸11個を遺伝的にランダム化することで、新しい結合表面が設計されました。ファージで発現させたコンビナトリアルライブラリを用いて、スタフィロコッカスProtein A由来のZドメインに対する数回のバイオパンニングを行った結果、HSAとZドメインの両方に親和性を持つA BDZ1と呼ばれる二特異性分子が得られました。二特異性融合タグ発現プラスミドを調製するには、まず、適切な制限酵素部位で挟まれたA BDZ1遺伝子のPCRフラグメントを調製します。次に、適切な反応バッファー中で、選択した制限酵素を用いてA BDZ1 PCRフラグメントと、目的遺伝子を含む精製済み発現ベクターを消化します。ライゲーションの前に、これらの産物を精製してください。

次に、制限酵素処理したA BDZ oneフラグメントを目的遺伝子を含む発現ベクターにライゲーションし、そのライゲーション産物を大腸菌に形質転換します。形質転換した細胞を、選択に適した抗生物質を添加したアガープレートに塗布します。いくつかのコロニーをPCRでスクリーニングし、DNAシーケンシングによって得られた発現カセットの配列を確認します。

最後に、配列を確認したコロニーを好みの発現株に形質転換し、一晩培養してプラスミドを調製し、標的タンパク質を発現させます。末端に新規タグを融合させた状態で、まず単一の細菌コロニーを、5 g/Lの酵母エキスと適切な抗生物質を添加した10 mLのトリプチカソイブロスに接種し、150 RPM、37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、一晩培養した培養液1 mLを100 mLの新鮮な培地に接種し、タンパク質発現を誘導します。

細胞が対数増殖期に達したとき、タンパク質誘導後、細胞を150 RPM、25 °Cで一晩インキュベートし、翌日、遠心分離により細胞を回収します。A BDZ 1融合タンパク質の直交アフィニティ精製は、まず、HSAまたはzomaを固定化したカラムを用いて初期精製を行うことで達成されます。その後、二特異性タグの2番目のアフィニティを利用して、連続的な精製ステップを実施します。

抗体の精製には、MA select sureなどのZドメインが固定化されたクロマトグラフィー担体が容易に入手可能です。一方、HSAを担体に化学的に結合させることで、直交アフィニティー精製を進めるための2つ目のマトリックスを用意できます。ペレットを25 mLのランニングバッファーに再懸濁させます。次に、振幅60%で1秒間のパルスと1秒間の休止を繰り返し、計3分間超音波処理を行い、細胞を破砕します。

サンプルの遠心分離後、さらなる精製を行う前に、標的タンパク質を含む上清を0.45 micronフィルターでろ過します。次に、適切なタンパク質精製システムを用い、1 mLのHSA spherosカラムまたはHSAを結合させたNHS活性化カラムを、1 mL/minの流速でランニングバッファー10カラム分を用いて平衡化します。平衡化後、細菌溶解物を0.5 mL/minでロードし、流速を1 mL/minに戻して、ランニングバッファー5カラム分でカラムを洗浄し、続いて洗浄バッファー5カラム分で洗浄します。

1 mL/minの流速で溶出バッファーを用いてサンプルを溶出し、分画を回収します。280 nmでの吸光度をモニタリングし、溶出ピークから分画を選択します。さらに精製を行う場合は、タンパク質濃度が最も高い分画を合わせて回収し、2倍に希釈します。

ランニングバッファーを準備し、pHが中性付近であることを確認してください。このステップは、Zドメインへのタンパク質の結合において極めて重要です。必要に応じて、pHを上げるために1 M Tris-HCl (pH 8) を添加してください。

次に、サンプルを0.5 mL/minで1 mLの高トラップMAにロードし、Sureランニングバッファーで平衡化したSureカラムを選択します。流量を1 mL/minにリセットした後、カラムを5カラムボリュームのSureランニングバッファーで洗浄します。その後、感度の高い標的タンパク質に対しては、0.2 M 酢酸（pH 2.7）でタンパク質を溶出させます。

EITは、採取直後にT trisを添加することで直接中和できます。タンパク質の純度評価には、H-C-L-S-D-Sページを用いることができます。A BDZ oneの遊離システインが非還元条件下で産物の二量体化を引き起こす可能性があるため、サンプルを完全に還元することが重要です。

最終ステップとして、HSAカラムおよびそれに続くMA select sureカラムを用いた直交プロトコルによる精製後、精製物の分子量を質量分析法で解析することができます。複数の精製段階で回収した異なるサンプルをSDS-PAGEで解析しました。サンプルには、A BDZ oneタグ単体、および異なる溶解度クラス、分子量、等電点を代表する、A BDZ oneを融合させた3種類のヒト標的タンパク質が含まれています。

レーン1から4は、3種類の異なるAB DZ 1融合タンパク質およびAB DZ 1タグ自体の精製前のタンパク質溶解物を示しています。レーン5から8は、これらのタンパク質のHSA精製ステップの結果を示しています。最後に、レーン9から12は、最終的なmAbs select Sure精製ステップの結果を示しています。

さらに、同一のカラムを用いて逆の手順で精製した同一ライセートから得られたサンプルをここで分析しました。レーン1から3は精製前のライセートを示し、レーン4から6はMAB Select Sureカラムによる最初の精製ステップ後のサンプルです。レーン7から9に見られる高純度の産物は、最終的なHSA精製によるものです。

これらの結果は、デュアルタグの使用と2段階の極めて特異的な精製ステップの有用性を明確に示しています。ゲル画像からわかるように、最初の精製ステップ後でもある程度の純度は得られますが、それに続くステップにより、非常に要求水準の高いアプリケーションに適した極めて純度の高い産物が得られます。この手法の中核となる精製ステップを習得すれば、1人でも数時間で完了することができ、多種多様なアプリケーションに適した高純度の組換えタンパク質を得ることが可能です。

例えば、本手順に従って精製された生体分子は、複合体の結合強度などの疑問を解消するための相互作用解析など、他のアプリケーションに利用できます。このビデオを視聴することで、このデュアルアフィニティータグを利用して、極めて純度の高いタンパク質産物を得る方法を十分に理解できるはずです。