顔面間葉のエレクトロポレーション

この手順の全体的な目標は、荷電した高分子を頭蓋顔面間葉に電気操作することです。これは、最初に麻酔をかけたステージ28の胚をエレクトロポレーションチャンバー内に配置することによって達成されます。次のステップは、荷電した高分子を含む溶液をC頭蓋顔面間葉にマイクロインジェクトすることです。

これに続いてすぐに電流が印加され、それによって電荷ヌクレオチドが他の細胞に導入されます。手順の最後のステップは、蛍光顕微鏡法によってエレクトロポレーションされた組織を視覚化することです。最終的には、頭蓋顔面組織の変化を示す結果を得ることができます。

これらの結果は、in vivoまたは固定組織で蛍光、顕微鏡、または免疫組織化学を用いて分析できます。マイクロインジェクションや突然変異などの既存の方法に対するエレクトロポレーションの主な利点は、分子ツールの組織および時間制御であり、今日の私たちの手順を示すのは、私の研究室のポスドクであるJackie Tablerです。この手順に必要なL字型電極のペアは、高純度の0.4ミリメートルタングステンワイヤーから作られており、各電極は最初にワイヤーの8センチメートルを切断します。

次に、ブルータックなどのパテを使用すると、タングステンワイヤーの中間点にある1ミリリットルのシリンジに影響を与え、シリンジの先端から4センチメートルのワイヤーが露出したままになります。先端を端から1cmのところでL字型に曲げます。先端の長さが0.5センチメートルになるように先端をトリミングします。

この先端は、シリンジに平行に余分なタングステンワイヤーを走らせる電極末端です。これは、2番目の電極が作成された後、電極パルス発生器を接続するために使用されます。一対の電極をテープで固定し、電極端子が1センチ間隔で平行に走るようにします。

最後に、電極をDCケーブルを介して矩形波パルス発生器に取り付けます。カスタムメイドのエレクトロポレーションチャンバーを準備するには、90ミリメートルの皿の底に約5ミリメートルの無毒の石膏シーンモデリング粘土を敷き詰めます。石膏のシーンを浸すエレクトロポレーションメディアを皿に満たします。

次に、5番の時計職人の鉗子を使用して、石膏シーンにT字型の井戸を彫り、エレクトロポレーションを形成します。井戸の長辺は約2ミリメートル×2ミリメートル×10ミリメートルで、短辺は2ミリメートル×2ミリメートル×5ミリメートルである必要があります。この手順用のマイクロピペットは、ケイ酸塩ガラスキャピラリーから作られています。

ニードルプラーを使用して、8〜12ミリメートルの長さのテーパーと細い先端を備えたマイクロピペットを準備し、鉗子を使用して先端から約2ミリメートルの先端を粉砕し、マイクロピペットをセットアップするためのギザギザの切れ目を作成します。まず、約1マイクロリットルの注射液を充填します(このデモンストレーションでは、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドが含まれています)。次に、マイクロピペットをマイクロマニピュレーターで固定し、マイクロピペットを卓上から50度の角度にします。

注入圧力を 20 PSI に設定し、マイクロピペットをキャリブレーションしてパルスあたり 30 リットルを注入します。エレクトロポレーションの準備として、ステージ28のゼノ幼虫を5分間インキュベートして麻酔します。0.1%のベンゾカインを含む正常な両生類培地であるエレクトロポレーション培地では、麻酔されたオタマジャクシをエレクトロポレーションチャンバーに移します。

それはエレクトロポレーション媒体で満たされています。手順の最も難しい部分は、マイクロペットをオタマジャクシに挿入することです。ですから、成功を確実にするためには、胚をしっかりと固定し、マイクロインジェクション後にすぐに電流を流す必要があります。

頭がT字型接合部に留まるように、胚を長いウェル内に配置します。背側を下にして腹側を露出させた状態で、鉗子を使用して頭を尾に比べてわずかに持ち上げ、オタマジャクシを周囲の石膏シーンと一緒に井戸にそっと固定します。オタマジャクシは、エレクトロポレーション中に痙攣し、顔の組織に深刻な損傷を与えるのを防ぐために、固定することが重要です。

この手順を開始するには、マイクロピペットの先端をセメント腺のすぐ後方に挿入し、顔面装置に挿入します。30ナノリットルの溶液を間葉に注入し、マイクロピペットを引っ込めます。電極の先端を胚の頭部と平行にすばやく位置合わせし、50ミリ秒20ボルトの正方形パルスを8回印加します。

次に、鉗子を使用して電極を引っ込めます。オタマジャクシを井戸から慎重に解放します。次に、ピペットを使用して、オタマジャクシを0.025ミリグラム/ミリリットルの4分の3ノムに移します。

ゲンタマイシンオタマジャクシは、この培地で一晩または24時間以上後にインキュベートできます。効率的なエレクトロポレーションのための蛍光顕微鏡法によるオタマジャクシのスクリーニング。蛍光分子を使用することで、エレクトロポレーションされた胚のスクリーニングが容易になります。

この図は、エレクトロポレーションの約1248時間後と96時間後のモルフオリゴヌクレオチドエレクトロポレーションオタマジャクシの典型的なバッチを示しています。ステージ30、34、44でそれぞれ。蛍光モーフオリゴヌクレオチドは、ステージ30および34で頭蓋顔面ミーン内で視覚化できます。

ステージ44では、白い矢印の頭で示される軟骨で蛍光を検出することができます。自己蛍光性の高い領域は腸です。この手順に従うと、エレクトロセルの系統と、目的のタンパク質の分子要件を追跡できます。

このアプローチは、ライブイメージング技術と組み合わせて、頭蓋顔面の発達中の遺伝子機能を経時的に研究することができます。