イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

この手順の全体的な目標は、植物の葉の空隙によって引き起こされる生物学的画像の劣化を最小限に抑えて、葉内の生細胞のより鮮明な画像を取得することです。葉を水性封入剤にマウントし、蛍光色素をレーザーで励起すると、オレンジ色で示されている組織内の多くの未充填の空間と屈折率の変化により、得られる画像内の組織内からの信号の強度が制限されます。代わりにリーフをフルオロデラインまたはPFDごとにマウントすると、結果として生じるフルオロフォアのレーザー励起は減衰が少なくなり、放出された信号の伝送が向上します。

最終的に、PFD封入剤を用いた走査型レーザー共焦点顕微鏡の使用により、水性封入剤を使用した場合の2倍以上の深さで、植物の葉内の生細胞の鮮明な画像が得られます。この技術の主な利点は、葉や水性媒体の固定や埋込などの既存の方法よりも優れているため、メソフィル内の屈折を減らし、問題となっていた葉の深部にある生細胞をより正確にイメージングできることです。この方法は、メソフィル、細胞生物学、in vivoでのシグナル伝達、病原体による葉のコロニー形成、病原体充填相互作用など、植物科学における重要な質問に答えるのに役立ちますが、この方法は基本的な植物生物学への洞察を提供することができます。

また、洞察スパイラルや脊椎動物の肺など、空域が豊富な他の高屈折組織にも適用できます。この手順を実演するのは、私の研究室To Mount LeafのGeorge Littlejohn博士です。PFDのサンプルは、ポリジメチルスローンまたはP-D-M-S-P-D-M-Sのガス透過性ガスケットを備えた顕微鏡スライドを準備することから始まります。

空気で満たされたボトルで少量のPFDを振とうすることにより、PFDを空気と平衡化します。これは、次にPFDを介して空気を泡立て、PFDを開いたペトリ皿にデカントし、苗または物品の葉全体を液体に5分間浮かべることによっても達成できます。組織は、ガラス化組織を彷彿とさせる半透明になるはずです。

葉は、照明条件や使用する組織の年齢に応じて、PFDにさらされる前よりも暗くまたは明るく見える場合があります。最後に、PDMSチャンバーにエアロと同等のPFDを充填し、インキュベーションペトリ皿から組織サンプルをPDMSチャンバーに慎重に移します。スライドをカバーで密封し、スリップしてイメージします。

実験要件に従って、数ヶ月の葉を組換え緑色蛍光タンパク質またはGFPの懸濁液中で5分間インキュベートしました。PFDでは、インキュベートされた葉のサンプルを顕微鏡で観察すると、空気空間の大部分がPFDに懸濁した組換えGFPで溢れていることがわかります。GFPは緑色で、赤色はクロロフィル、ロト蛍光、デリットメソフィルセルを表しています。

PFDとのインキュベーション時に葉が浸水することは明らかですが、時折空気のポケットが残ることがありますこれらの条件下では水が葉に溢れることはありません。ここでは、サイトゾルに局在するYFPの変種であるVenusを発現するopsysの葉をインキュベートし、空気、水、またはPFDレーザースキャンにマウントします。サンプルの共焦点顕微鏡法では、PFDが空気や水よりも優れており、イメージングの深さが約2倍に増加していることが示されています。

PFDと水を比較すると、一度習得すれば、このテクニックは適切に実行すれば5〜10分で完了します。この手順を実行する際には、末梢のデリンがマニキュアとテフロンを溶かしますが、シリコングリースと互換性があることを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、植物の葉の細胞でのイメージングを改善するための封入剤としてper fluro delinを使用する方法についてよく理解できるはずです。

パーフルオロデリンは無毒ですが、この手順を実行する際には標準的な安全対策を採用することをお勧めします。