イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

本手順の全体的な目的は、植物の葉に含まれる気腔による生物学的画像の劣化を最小限に抑え、葉内の生細胞のより鮮明な画像を取得することです。葉を水性封入剤で封入し、レーザーで蛍光色素を励起させると、オレンジ色で示されている組織内の多くの未充填の気腔や屈折率の変化により、得られる画像において組織深部からの信号強度が制限されます。これに対し、葉をパーフルオロデカリン（PFD）で封入した場合、蛍光色素のレーザー励起による減衰が軽減され、放出される信号の透過性が向上します。

最終的に、PFD封入剤を用いた共焦点レーザー走査顕微鏡を使用することで、水性封入剤を使用した場合に比べて2倍以上の深さにある植物葉内の生細胞の鮮明な画像を得ることができます。固定法や葉の水性封入などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、葉肉組織内の屈折を低減し、これまで困難であった葉の深部にある生細胞のより正確なイメージングを可能にすることです。この手法は、葉肉細胞の生物学やin vivoでのシグナリング、病原体による葉への定着および病原体と細胞の相互作用など、植物科学における重要な課題の解決に寄与し、植物生物学の基礎的な理解を深めることができます。

この手法は、蝸牛や脊椎動物の肺など、空気層を多く含む他の高屈折組織にも適用可能です。この手順のデモンストレーションは、私の研究室のGeorge Littlejohn博士が担当します。PFDサンプルの準備は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）製のガス透過性ガスケットを用いて顕微鏡スライドを作成することから始めます。PDMSは粘弾性ポリマーであり、実験要件に合わせてチャンバーを成形することが可能です。

空気で満たしたボトルの中で少量のPFDを振ることで、PFDを空気と平衡化させます。これは、PFDに空気をバブリングすることでも達成可能です。次に、PFDをオープンペトリ皿にデカンテーションし、液体の上に苗全体または切り出した葉を5分間浮かべます。組織は、ガラス化組織のような半透明の状態になります。

PFDに曝露させる前と比較して、葉の色は照明条件や使用する組織の齢によって、より濃く、あるいはより淡く見える場合があります。最後に、PDMSチャンバーにエアレーション済みのPFDを満たし、インキュベーション用のペトリ皿から組織サンプルを慎重にPDMSチャンバーへ移します。スライドをカバーガラスで密閉し、撮影します。

実験要件に従い、数ヶ月経過した葉を、組換え緑色蛍光タンパク質（GFP）懸濁液中で5分間インキュベートしました。PFD顕微鏡検査により、PFDでインキュベートした葉のサンプルの大部分の気腔が、PFDに懸濁された組換えGFPで満たされていることが示されました。GFPは緑色で示され、赤色はクロロフィル、自発蛍光、および葉肉細胞を表しています。

PFDでインキュベートすると葉が浸されることは明らかですが、時折、気泡が残ることがあります。これらの条件下では、水では葉に浸透しません。ここでは、細胞質に局在するYFPのバリアントであるVenusを発現しているopsysの葉を、空気、水、またはPFD中でインキュベートし、固定しました。サンプルの共焦点顕微鏡観察の結果、PFDは空気や水よりも優れており、イメージングの深さが約2倍に向上することが示されました。

PFDと水を比較した場合、この手法を習得すれば、正しく行った場合に5～10分で完了できます。この手順を実施する際、perfluorodecalinはネイル varnishやテフロンを溶解させますが、シリコングリスとは適合性があることを覚えておくことが重要です。このビデオを視聴することで、植物の葉の細胞におけるイメージングを改善するための封入剤としてperfluorodecalinを使用する方法について、十分に理解できるはずです。

パーフルオロデカリンは無毒ですが、本手順を実施する際は標準的な安全管理策を講じることを推奨します。