Name: イメージングのための簡単な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: 学ぼう、ペルフルオロデカリンを用いたシロイヌナズナ葉の浸潤イメージング法。空気による屈折を低減し、生細胞の深部イメージング深度を2倍以上向上させる革新的な植物細胞生物学手法です。

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著者は、彼のアドバイスとエクセターのバイオイメージング施設の大学のためにエクセター大学の教授ニコラススミノフを感謝したいと思います。資金は、英国バイオテクノロジー生物科学研究会議（助成基準BB/E002682/1）によって提供されていました。

以下のプロトコルは、 シロイヌナズナの葉の浸潤性封入剤としてPFDは使用するためのシンプルな方法を説明しますが、我々は、このメソッドは画像空気が豊富な組織が ​​望まれる様々なアプリケーションで使用される場合があることを期待しています。 1。 PFDの取付け葉サンプル<ol><li>ポリジメチルシロキサンのガス透過性のガスケット（PDMS、ノースカロライナ観測ジェル）と顕微鏡のスライドを準備します。 PDMSは、粘弾性ポリマーであり、実験の要件に合わせたチャンバーを提供するように成形することができます。 </li><li>空気とPFDは平衡化させます。これは、空気バブリングによってまたは空気で満たされたボトルのPFDの小さな体積を振ることによって達成することができる。 </li><li>デカントは、開いているシャーレにPFDと5分間PFD上に全体実生または切除された葉をフロートさせます。組織は、ガラス固化体組織（ 図2（））を彷彿とさせる半透明になるはずです。葉は、PFD、依への曝露前より暗くまたは明るく表示されることがあります照明条件や使用する組織の年齢で丁。 </li><li>空気平衡PFDとPDMSチャンバーを記入し、慎重にPDMSチャンバーにインキュベーションペトリ皿から組織サンプルを転送する。実験的な要件に応じてカバースリップと画像でスライドを密封する。 </li><li>注：PFDもカバースリップ上に構築されたオープンなチャンバー内にまたは灌流チャンバ内のよく実行し、シリコングリスと互換性がある。それはそれらを溶解するとPFDは、テフロンのコンポーネントと互換性がありません。 </li></ol> 2。代表的な結果： PFD -インキュベートした葉サンプルの顕微鏡検査は、空域の大部分が浸水していることを示している。 図2（b）は PFDに懸濁した組換えGFPが殺到する空域を示しています。それは葉がPFDとインキュベーションにより浸水していることは明らかであるが、空気のその時々ポケットが残る場合があります。水は、これらの条件下で葉をフラッディングしません。サンプルのLSCMはでインキュベートし、マウントさ IR、水またはPFDが可能なイメージング（ 図3）の深さで水と空気以上に優位に立つことPFDを示しています。 図3に示す例では、空気、水とPFDマウントされているシロイヌナズナが cytosolicallyローカライズされた金星、35Sプロモーターの制御下に恒常的に発現されたYFP 11の変形を表現する葉を示しています。 PFDと水を比較するときに我々は、イメージングの深さでおおよそ2倍の増加を見ることができます。それは、PFDを使用するときに見られる精密な改善がレンズと使用される組織の種類の開口数によって変化すること、しかし、注意する必要があります。我々は、PFD治療苗における細胞質流動と根毛の伸長、健康な植物の各指標を見てきました。さらに、我々 は FV / Fmは 、植物12の光合成機能の測定は、イメージングに使用されるタイムスケール上の許容限度内であること2を示している。 3394fig1.jpg"/&gt; 図1。植物の葉の複雑さと光学的影響 A.の解剖学的特徴を示すダイヤグラム表示光学セットアップに関連したシロイヌナズナの葉。使用される略語はobjです。 =対物レンズ、IMM。 =液浸液、COV。 =カバースリップ、MNT。 =封入、カット。 =キューティクル、広告。 EP。 =向軸表皮、ST。 =気孔孔、SP。 =エアスペース、PALなど=海綿状葉肉、。 =柵状葉肉、VB =維管束、広告。 EP。 =向軸表皮。細胞壁は黒い線で示されます。 <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3394/3394fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2。"> 図2。 PFDは、容易にシロイヌナズナの葉を貫通する （）空気、水の中でインキュベートまたは5分間PFDは葉とライカMZ16F顕微鏡（ライカマイクロシステムズ（英国）（株）、ミルトン - ケインズ、英国）とライカDCF3000FXデジタルカメラを用いて画像化。 Joveのロゴは、アセテートフィルムに印刷し、あちこちに照らされたライトボックスで下にはM。露光時間は89 msであり、すべての画像を収集し、同じように処理されました。スケールバーは2mmを表す。 （b）の組換え緑色蛍光タンパク質を精製運ぶPFD（GFP）は、 生体内で空域を区切ります。 GFPは、偽色の緑で、赤は葉肉細胞を区切るクロロフィル自家蛍光を、表示するために使用されます。 （ 図2（b）許可とリトルジョンらで利用可能な完全な技術的な詳細に再現。2010 2）。スケールバーは25 mを表す<img alt="図3。" src="/files/ftp_upload/3394/3394fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3。"> 図3。 PFDは、葉に共焦点イメージングを向上させる 無傷のシロイヌナズナで細胞質局在化金星蛍光（緑色）とクロロフィルの自家蛍光（赤色）を示すLSCMの画像は、空気、水またはPFDで結像される葉。励起波長は514 nmであると蛍光発光は、金星は604 nmの518 nmで記録し、少なくとも657 nmの葉緑体のための679 nmの。各パネルは、5μmの間隔で取得した11共焦点画像のZ -スタックから取り出した単焦点セクションです。これらは、補足的なムービーを生成するために使用されている1μmの間隔で取得した59個のイメージのフルZ -スタックから抽出した。深さの測定は、上皮表面に対して与えられる。同様に処理された代表的なイメージは、表示されます。そのような顕微鏡の設定などの実験の詳細は、リトルジョンらに見られるものと同じです。、2010 2。スケールバーは20μmを表す。

<ol><li>Inoue, S. Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInoue%2C+S+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%2C+3rd%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd</a>. Pawley, J. P. , Springer Science & Business Media, LLC. New York. 1-16 (2006).</li>
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<li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+fluorescence%3A+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

これは、空気充填または光学的に複雑な組織の顕微鏡を向上させるためにシンプルで使いやすい手法です。私たちは、テクニックはいくつかの強力な利点を持っていることが示されていると我々は、それが空気が豊富な組織に関連する生物学的疑問を解明するために使用されることを願っています。例えばそれは、植物の葉肉や肺内の病原体の攻撃の研究のための自然な選択になるでしょう。我々はまた、技術の限界を認識しています。我々は、長いタイムスケールの実験中に優れた屈折率のマッチング、顕微鏡の他のモードでの使用、及びパーフルオロカーボン封入補充に取り組んでいます。我々はまた、PFCガスの主な利点の一つは、すなわち生物学的に不活性なフリップサイドを持っていること、しかし、認識する。 PFCは容易にまたそれらが容易にそのようなホルモン、薬物、および他の小分子やイオンのような関心の化合物を送達するために使用することはできないことを意味する生物学的分子を溶解しない。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> Perfluorodecalin </td><td> F2ケミカルズ</td><td> N / </td><td>順番に電話。 </td></tr><tr><td>カロライナ観測ジェル</td><td>生物ブレード</td><td> 13から2700 </td><td></td></tr></tbody></table>

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてperfluorodecalinを使って葉

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

生体試料に深く高解像度の画像を取得する問題が広く1を認めている。このような植物の葉の海綿状の葉肉のような空気で満たされた組織または肺の脊椎動物、さらに困難は細胞成分との間の、細胞と空域の間及び生体組織や光学系の他の部分との間の屈折率の複数の遷移から生じる。また、屈折率の不一致は、蛍光物質の励起および蛍光顕微鏡における信号の放出の減衰につながる。我々は光学的にレーザパワーでダメージが増加するに頼ることなく、深さで焦点顕微鏡（LSCM）サンプル画像をスキャンするレーザーを改善し、最小限の生理的影響2を有する浸潤のイメージング媒体としてここにパーフルオロカーボンのアプリケーション、perfluorodecalin（PFD）を、記述する。我々は、その結果として光学的に複雑であるシロイヌナズナの葉組織、とPFDの使用のためのプロトコルを記述する構造（ 図1）。 PFDは、この使用3に適するよう、属性の数を持っています。 PFDの屈折率（1.313）が水（1.333）と同等ですし、空気（1.000）よりも細胞質ゾル（約1.4）のそれに近いです。さらに、PFDは非蛍光、容易に入手可能であり、非毒性です。それは洪水を可能にする気孔貫通4、のための- PFDの低い表面張力（19ダインcm -1には ）水（72ダインcm -1）のそれより低く、また上限（30ダインcm -1の 25）以下です。潜在的に破壊的な真空または界面活性剤の応用せずにスポンジ状の葉肉の空域。最後にと決定的に、PFDは、CO 2とガス交換がこうしてサンプルについての生理学的影響を最小限に抑え、浸水組織で維持できるようにするO 2を 、溶解させるための偉大な能力を持っています。これらのプロパティは、部分的液体呼吸と肺のインフレを含む様々な用途で使用されているる5,6、手術7、人工血8、増殖培地9、及び植物10の氷の結晶形成の研究の酸素化。現在のところ、それは、ライブ共焦点イメージングのための水または水性緩衝液に組織をマウントするのが一般的です。私たちは、封入剤として、PFDの使用は、既存の慣行の改善を表し、イメージングのためのライブ全体の葉のサンプルの簡単な製造を可能にすることを検討してください。

我々は浸潤性封入剤としてperfluorodecalinの使用を説明しています。これは、撮像の深さを改善するための簡単​​な方法です。<em&gt;シロイヌナズナ</em最小限の生理的影響と&gt;葉組織。

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

生物学的試料の深部から高解像度画像を取得することは、広く認識されている課題である1。...の海綿状葉肉のような、空気を含む組織では...

この手順の全体的な目的は、植物の葉にある気隙によって引き起こされる生物学的画像の劣化を最小限に抑え、葉内部の生細胞のより鮮明な画像を取得することです。葉を水溶性の封入剤で封入し、レーザーで蛍光色素を励起させた場合、オレンジ色で示されている組織内の多くの未充填の気隙や屈折率の変化が、得られた画像における組織深部からの信号強度を制限します。代わりに葉をパーフルオロデカリン（PFD）で封入すると、蛍光色素のレーザー励起による減衰が抑えられ、放出された信号の透過性が向上します。最終的に、PFD封入剤を用いた共焦点走査型レーザー顕微鏡の使用により、水溶性封入剤を用いた場合に比べて2倍以上の深さまで、植物葉内の生細胞の鮮明な画像を得ることができます。固定法や葉の封入および水溶性媒体などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、葉肉組織内の屈折を低減し、これまで困難であった葉の深部にある生細胞のより正確なイメージングを可能にする点にあります。この手法は、葉肉細胞の生物学や生体内（in vivo）でのシグナル伝達、病原体による葉への定着および病原体と植物の相互作用への対応など、植物科学における重要な疑問の解決に寄与し、基礎的な植物生物学への洞察を提供することができます。本手法は、蝸牛や脊椎動物の肺など、空気腔に富む他の高屈折組織にも適用可能です。この手順の実演は、私の研究室のGeorge Littlejohn博士が行います。PFDサンプルにおいては、まずポリジメチルシロキサン（PDMS）のガス透過性ガスケットを用いて顕微鏡スライドを準備します。PDMSは、実験要件に合わせて調整したチャンバーを形成できる粘弾性ポリマーです。空気で満たしたボトルの中で少量のPFDを振とうし、PFDを空気で平衡化させます。これは、PFDに空気をバブリングすることでも達成可能です。次に、PFDをオープン Petri ディッシュにデカンテーションし、苗全体または切り出した葉を液体に5分間浮かべます。組織は、ガラス化組織を彷彿とさせる半透明の状態になります。照明条件や使用した組織の齢によって、葉はPFDにさらされる前よりも色が濃く、あるいは薄く見える場合があります。最後に、PDMSチャンバーにエアレーションしたPFDを満たし、培養用ペトリ皿から組織サンプルを慎重にPDMSチャンバーへ移します。スライドをカバーガラスで封じ、イメージングを行います。実験要件に従い、数ヶ月経過した葉を組換え緑色蛍光タンパク質（GFP）懸濁液中で5分間インキュベートした。PFD顕微鏡観察の結果、PFDでインキュベートした葉サンプルの大部分の気腔に、PFD中に懸濁した組換えGFPが充満していることが示された。GFPは緑色で表示され、赤色はクロロフィル、自家蛍光、および葉肉細胞を表している。PFDでインキュベートすると葉が浸されたことは明らかですが、時折気泡が残る場合があります。これらの条件下では、水では葉に浸透しません。ここでは、細胞質に局在するYFPのバリアントであるVenusを発現させたopsysの葉を、空気、水、またはPFD中でインキュベートし、マウントしてレーザースキャニングを行いました。サンプルの共焦点顕微鏡観察の結果、PFDは空気や水よりも優れており、イメージングの深さが約2倍に向上することが示されました。PFDと水を比較した場合、この手法を習得すれば、適切に行うことで5分から10分で完了させることができます。この手順を行う際は、perfluorodecalinがマニキュアやテフロンを溶解させますが、シリコングリスとは適合することに留意することが重要です。このビデオを視聴することで、植物の葉の細胞におけるイメージングを改善するための封入剤として、perfluorodecalinを使用する方法について十分に理解できるはずです。per fluoro delinは無毒ですが、本手順を実施する際は標準的な安全基準に従うことを推奨します。

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