の定量的比較シス -調節エレメント（CRE）の活動キイロショウジョウバエ

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエ メラン胃変態発生中に活性な CIS 調節要素または CRE の遺伝子調節活性を定量的に測定することです。まず、レポーター導入遺伝子としてトランスジェネリックに組み込まれたCREの系統を作製するための部位特異的な組み込み法から始めます。実体顕微鏡を使用して、正しい発生段階のトランスジェニック標本を取得します。

アウターパブから標本を取り出し、ガラス顕微鏡に取り付けます。スライドを進めて、共焦点顕微鏡分析により、ホールマウントサンプル中の蛍光レポータータンパク質発現のレベルとパターンを記録します。最後に、Image Jソフトウェアツールを使用して、記録された共焦点画像の蛍光レポータータンパク質発現レベルを定量化します。

これらの結果は、調節要素を補助し、改変CREバージョンでのさらなる遺伝子発現比較研究を促進するための遺伝子調節活性のレベルを割り当てます。この手順は、重要な質問に答えるのに役立ち、遺伝子制御とその遺伝子制御がどのようにコード化されているかに興味を持ちます。DNAは、発生生物学や進化生物学のように感じられます。

この手順は、ショウジョウバエのメラノガスター変成発達中に機能するシス調節要素に関する洞察を提供するために開発されました。しかし、原理的には、他の発生段階で機能するシス制御要素や他のショウジョウバエ種、さらには他のモデル生物にも適用することができます。トランスジェニック系統を拡大するためには、交互に数匹のオスとメスのハエが入った2つのバイアルを設置します。

バイアルの1つからハエを新しいバイアルに移します。これを1週間繰り返します。2週間の終わりまでに、トランスジェニックショウジョウバエが幼虫から成虫の発育段階までの範囲であることを確認します。

ERが形成される第3幼虫期の終わりに標本の病期分類を開始します。試料は非可動性であることに注意してください。ERは白く柔らかくなり、球形はこの時点を指定することを避けました。

ゼロHAPFとして。体の中央点近くに両側に位置する生殖腺の存在によって男性と女性を区別し、変態の長さに基づいてステージングするための半透明の円として現れます。HAPFがゼロの場合、湿らせた絵筆を使用して標本を新しいバイアルに移します。

キムワイプを加え、標本が乾燥しないように水で湿らせます。次に、バイアルを摂氏25度で目的のHAPFになるまでインキュベートします。あるいは、添付のテキストに詳述されているように、いくつかの形態学的マーカーの存在と位置の同定に基づいて標本を分類することにより、標本を分類します。

ラボ用テープを使用して、粘着テープの表面を上に向けて解剖ボードにパッキングテープを接着します。ペイントブラシを濡らし、ペイントブラシを使用して試験片に水分を塗布します。標本をキムワイプに移します。

試料をパッキンテープに移し、背側を上にして接着します。試料を15分間乾燥させます。鉗子を使用してERを徐々に開きます。

前部またはパーマ部から開始し、後端に向かって進みます。次に、顕微鏡スライド上の粘性油滴にpuiを移し、標本を顕微鏡で評価して、マウント全体の標本を評価します。Forexまたは10 x対物レンズを使用して、標本に焦点を合わせます。

共焦点顕微鏡ソフトウェアを使用して、目的の蛍光タンパク質の励起波長を調整し、光退色を防ぎます。レーザー強度を5〜10%から開始する信号が圧倒的な場合は、必要に応じて強度を上げて、信号対雑音比を改善します。共焦点画像の場合、CRE活性の定量的比較のためのカルマン平均化などの複製スキャンからのピクセル測定値を平均化するソフトウェア設定を有効にし、蛍光が最も強く現れるC切片を使用します。

飽和警告ルックアップ テーブルに切り替えて、チャネル電圧ゲインとオフセットを飽和するピクセルが少ない設定に調整します。必要に応じて、共焦点絞りを調整します。最適な設定が決定されたら、ZSスキャンを実行して、Z軸に沿った一連の画像を取得します。

スキャンが完了したら、画像スタックを投影に変換し、この画像ファイルをTIF形式で保存します。CRE活性を定量的に比較するには、すべての複製標本およびレポーター導入遺伝子株に同じ共焦点設定を使用します。Image Jプログラムによる実験では、評価するTIFF画像を開きます。

フリーハンド選択ボタンをクリックして、定量が必要な試料の領域の輪郭を描きます。ピクセル値の統計情報を取得するには、[分析] タブをクリックし、[メジャー] を選択します。結果ボックスから平均ピクセル値スコアを記録します。

また、CRE がアクティブでない背景領域から 2 番目の平均ピクセル値も収集します。調整された平均ピクセル値を導出するには、反復標本のピクセル値統計の生成を続けます。次に、レプリカの調整済み平均ピクセル値から、A CRE の平均調節活性を決定し、平均の標準誤差も計算します。

この実験では、ホワイトレスキューアイの表現型の強度を使用して、トランスジェニック系統をホモ接合にします。A TTPランディングサイト配列を持つ白色遺伝子変異体の遺伝的背景は、部位特異的な導入遺伝子の統合に利用されます。統合されたベクターのトランスジェニック個体、半接合体およびホモ接合体は、救助された眼の色表現型の強度によって、統合されたミニ白色遺伝子のコピー数によって区別されます。

次に、ホモ接合系統は、最も暗い目の色の表現型を持つオスとメスのハエを交配することによって確立されます。形態学的マーカーは、幼虫から成虫のショウジョウバエへの変態中のショウジョウバエの変成段階を決定するために使用されます。標本は、性別を決定し、発達段階を近似するために使用できる一連のステレオタイプの形態を遷移します。ここは。

二形要素と呼ばれるA CREの野生型バージョンは、雌のピュイのASIC腹部セグメントで高レベルのEGFPレポーター発現を促進します。このCRE内の13塩基対配列がDSX転写因子の結合部位であることがわかり、この結合部位が変異した場合のCREの制御活性を定量化することで、この配列のin vivo重要性が実証されました。定量的解析では、このDSX部位の変異により、ここで使用された導入遺伝子挿入部位の状況において、調節活性が野生型発現の28±3%に減少したことが示されている。

同様の比較では、特定のCRE対立遺伝子または異なる種からの自家CRE間の調節活性を、たとえば、女性セグメントのEGFPレベルと比較して評価します。D覚醒剤とDウィリ種のためのDメリン胃カニンS株自家CREsによって駆動される6は、それぞれ75プラスまたはマイナス4%とゼロプラスマイナス0%に等しい調節活性を持っています。RNA干渉などの以下の手順法を転写因子遺伝子とともに使用して、これらの転写因子遺伝子がCYS調節要素とどのように相互作用するかについての追加の質問に答えることができます。

これは、CIS調節要素によって駆動される蛍光レポータータンパク質発現の増減によって示されます その開発後。この手順は、遺伝子制御の分野の研究者が、シス制御要素のモチーフと進化した突然変異が遺伝子発現に及ぼす機能的重要性を探求する道を開きました。