子宮組織の自動移植による外科的に誘発される子宮内膜症のマウスモデル

本手順の全体的な目的は、子宮組織を腸間膜の動脈系に自家移植することにより、マウスに子宮内膜症を外科的に誘発することです。まず、子宮の子宮内膜を結紮、切除、および露出させることでこれを達成します。次に、2 mmのバイオプシーパンチを用いて、露出させた子宮内膜から3つの子宮内膜様インプラントを作成します。

本手順の第3ステップは、3つの子宮内膜様インプラントを腸間膜の動脈カスケード内の動脈に縫合することです。本手順の最終ステップは、腹壁と皮膚を閉鎖し、動物に子宮内膜様病変を回復させることです。マウスから切除された病変は、組織学的解析および遺伝子とタンパク質の発現パターンによって決定される通り、子宮内膜症の女性に見られるものと類似しています。

一般的に、この手法に不慣れな方は、主に3つの理由で苦労します。第一に、マウスの組織が非常に小さいこと。第二に、腸間膜が損傷しやすいこと。そして第三に、縫合をきつくしすぎると、腸管壊死を引き起こすことです。

まず、鎮痛剤および麻酔薬を含む、無菌手術を成功させるために必要なすべての手術器具を準備します。吸入イソフルランを用いて動物を麻酔した後、足指へのピンチ刺激に対する反応がないことを確認して完全な麻酔状態であることを確認し、手術中の乾燥を防ぐために眼に眼軟膏を塗布した後、小型バリカンで手術部位を除毛します。クロルヘキシジン洗浄剤と70%エタノールを交互に3回拭いて手術部位を消毒し、その後、滅菌ドレープで動物を覆います。

小さなハサミまたはメスを用いて、膣開口部から吻側へ0.5〜1.0 cmの位置で終わるように、正中線に小さな切開を加えます。術後の閉鎖を容易にするため、鈍的に体壁を腹壁から剥離します。鈍的剥離の後、腹壁の正中線に小さな切開を加えます。

次に、小型のピンセットを使用して、左子宮角を慎重に探します。子宮は腸の背側に位置しており、切開部位に最初に進入した際に通常最初に見えるのは腸です。子宮角をそっと上に引き上げ、開いたピンセットをその下に滑り込ませて、レトラクター（牽引器）として使用します。この時点で、卵巣と子宮の外見を確認しておくことも有用です。

発情周期の特定を容易にするため。2枚目のスライドのように、5-0の黒色編組シルク縫合糸を6〜8 cmの長さに切り、伸展させた子宮角の下に通します。子宮管接合部で子宮角をしっかりと結紮します。

卵管と子宮頸管接合部をそれぞれ結紮します。各部位をスクエアノットで結び、縫合糸の端は切らずに残しておきます。2か所の結紮部の間の子宮角部分を切り出し、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む PBS 約 100 µL が入ったガラス製ペトリ皿に組織を置きます。

最後に、シルク縫合糸の端をカットします。縫合が緩んでいるか、あるいは出血がある場合は、切り口を確認し、小さな鋏を用いてもう一度結紮します。子宮角から脂肪組織を取り除きます。

小型の鋏の片方の刃を管腔に挿入し、子宮角を開きます。鉗子で子宮角を保持しながら、鋏をゆっくりと子宮角に沿って滑らせます。ガラス製ペトリ皿の中で、2 mmのバイオプシーパンチを用いて、同サイズのインプラントを3箇所切り出します。その際、乾燥させないように注意してください。

切開部位の直上に滅菌ガーゼを置き、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む滅菌PBSで十分に湿らせます。以下の手順において、小型の平鉗子を用いて水分を維持することが重要です。優しく盲腸を探し、小腸に沿ってゆっくりと移動させます。

4～5 cmほどの短い腸管を引っ張り出し、腸間膜の動脈カスケードが明確に見えるように、事前に濡らしたガーゼの上に扇状に広げます。腸管は常に滅菌生理食塩水で湿らせておいてください。インプラントを針に載せ、6-0の黒色絹縫合糸を用いて、腸管から約0.5 cm離れた部位の動脈にインプラントを緩やかに固定します。

1本のみ使用してください。鉗子に掛けて結紮し、縫合糸を強く締めすぎないようにします。強く締めすぎると血流が遮断され、その結果として腸管壊死に至る可能性があるためです。

2つの結び目に対し、さらに1つの結び目を加え、各結び目を締め、インプラントから2 mm以内の位置で縫合糸をカットし、腸管を湿潤させます。次に、吻側方向へ移動します。次に3～4 cmの腸管を引き出し、すでにインプラントが挿入されている部位をそっと戻します。

前回のインプラント部位から1〜2本の動脈を飛ばし、次のインプラントを縫合します。3つ目のインプラントについても同様に繰り返します。最後に、腹壁を縫合し、創傷クリップで皮膚を閉じます。手術部位を閉鎖し、鎮痛剤を投与した後、動物が回復するまで、腹側を下にしてケージ内に置き、部分的に循環式温水パッドの上に保持します。

子宮内膜様病変を回収するために、腸間膜にある黒色の縫合糸を確認します。キャリパーを用いて、各子宮内膜様病変の長さと幅を測定します。病変を穿刺しないよう注意しながら、子宮内膜様病変を切り出します。

病変部から子宮内膜様ではない組織をすべて除去します。縫合糸を除去する前に、液体が充満した3つの子宮内膜様病変を軽く揺らします。慎重に縫合糸を除去し、2つの子宮内膜様病変を穿刺します。

組織処理に進む前に、これらを再度的に計量します。次に、残りの子宮角を摘出し、計量します。女性およびここで示すマウスモデルにおける子宮内膜症の組織学的解析では、子宮内膜様病変に子宮内膜腺と間質が含まれていることが示されています。マウスの子宮内膜症病変には、女性の子宮内膜症に共通する特徴であるヘモジデリン含有マクロファージも含まれています。誘導から3日後にマウスから摘出した子宮内膜様病変は、左図に示すように炎症および出血を伴っており、その後2〜4週間の成長が見られます。

マウスモデルにおける子宮内膜症病変は、誘発時の病変重量と比較して、嚢胞状で液体が充満しており、腹膜癒着に囲まれていました。液体充満病変は、誘発から1ヶ月後で306%、2ヶ月後で862%大きく、槍状病変は1ヶ月後で51%、2ヶ月後で172%大きくなっていました。液体充満病変および槍状の子宮内膜症病変。

この手順に従った5つの異なる実験において、導入から1ヶ月後の体重は一貫して維持されました。本モデルは、子宮内膜症の病態生理に関する疑問への回答や、この疾患に伴う疼痛および不妊症に対する新規治療薬の探索に活用できます。