Name: 同所性マウス脳腫瘍モデルのコンビネーション放射線治療 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学ぶマウス脳内グリオブラストーマ細胞の移植法と放射線治療の効果評価。Kaplan-Meier生存曲線で治療効果を解析し、新規治療法の開発に貢献する実験モデルを構築する方法を解説します。

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この研究は、NIHの学内プログラムからの資金によってサポートされています。

I.細胞の調製<ol><li>細胞が移植されるすべての5匹のマウス用の80％コンフルエント225センチメートル3フラスコ約10％FBSを含むDMEM中でコンフルエンスまで増殖されています。 </li><li>細胞のメディアをオフに吸引し、カルシウムまたはマグネシウムなし10 mlのPBSで洗浄する。細胞からPBSを吸引除去する。 </li><li>トリプシンの3 mlで細胞をトリプシン処理、10〜15分待ってから、メディアの15mlでトリプシンを中和する。 </li><li>ピペットで50 mlコニカルにすべてのセルとメディア。二つの大きなフラスコは、1つの50 mlコニカル収まる。 </li><li> 4℃で7分間1600 rpmで細胞をスピン完全に上清を吸引除去する。冷PBS 10mlに細胞を再懸濁し、ゆっくりと上下にピペッティングで細胞をリンス。細胞ペレットをPBSで均一に混合していることを確認します。懸濁液は、曇りでなければなりません。 </li><li>この時点で細胞数をコールターカウンターを用いて行われます。細胞を4℃で7分間1600 rpmで再度遠心分離してい</li><li>セルの第2回遠心分離した後、として1mlのPBSで海賊すべてのPBSと再懸濁する。 </li><li>細胞を4℃で10分間3000rpmでPBS 1mlのでスピンされているPBSを吸引し、PBSはU87細胞を5μLあたり1×10 6に、最終濃度を調整するために追加され、他の細胞株は、最適な腫瘍の成長のための細胞の数が異なると集中が必要な場合があります。 </li><li>最終的なボリュームと濃度が得られた後、細胞をエッペンドルフチュー​​ブに氷の上に保持されます。 </li></ol> II。異種移植片<ol class="ualpha"><li>マウスの準備<ol><li>マウスは、ケタミン/キシラジン/生理食塩水の注入ミックスを使用して麻酔する。混合物は、ケタミン120 mg / kgで、16 Rompunのmg / kgおよび食塩水である。マウスは、個別に秤量し、自分の体重に基づいて、10グラムあたり0.1mlが与えられます。麻酔薬は、1 mlのシリンジIPに接続された26G針で与えられます。それは痛み応答の睡眠段階に到達するためにマウスの約15分かかります。あなたの疼痛反応を確認することができます彼らの足蹠をつまんでマウス。 </li><li>マウスが完全に麻酔した後、眼軟膏は乾燥からそれらを防ぐために、彼らの目に投与されています。 </li><li>マウスは、口のバーでノッチのフロントアッパー歯と定位のベッドの上に配置されます。ベッドはその後定位に配置されます。 </li><li>鼻ガードが頭部の動きを防ぐためにマウスの鼻の上に配​​置されており、耳のバーは、静かにマウスの外耳道に配置されています。頭蓋骨が骨折および/または呼吸からマウスを防ぐ可能性があるので、きつすぎる鼻バーや耳バーの配置のいずれかを行うことがないように注意してください。 </li><li>マウスの頭部は定位上の目盛りを使用してレベルがこのプロセスの間に有用であることを確認してください。 </li><li>準備には、マウス、アルコールとp​​rovidineヨウ素はヨウ素のアルコールと3アプリケーションの3アプリケーションの合計の交互マウスの頭の上に自由に適用されます。 70％アルコールパッドのいずれかの最終的なアプリケーションは、に適用されます頭。 </li></ol></li><li>外科的処置<ol><li>プロシージャ内のすべての機器は、操作を始める前に70％エタノールで楽器をオートクレーブまたは浸漬のいずれかによって滅菌されるべきである。 </li><li>切開が斜め後ろの頭蓋骨の左側後部に右眼の後ろの頭蓋骨の上に作られています。切開は10 mm〜15 mm程度長くなければなりません。 </li><li> Q-ティップを使用して、徐々に頭蓋骨を露出させ、頭蓋骨と皮膚の間にある膜を払拭するために切開を分離します。過度の出血のために血をブロットおよび監視するためにQ-ティップを使用しています。 </li><li>ブレグマを視覚化するために頭蓋骨の上部を公開します。ハミルトンシリンジポイントを使用して、ブレグマの上に配置します。頭蓋骨にドリルする穴の位置が正しいことは、ブレグマ（図2）の前方2mmの右側に1 mmである。無菌購入された外科医のフェルトマジックは、掘削する穴の位置をマークするために使用されています。穴の近くに配置されることに注意してくださいterior縫合線。 </li><li>次に、18G針を介してピンの花瓶や飼料に22G針のポイントを使用してマークされた位置に頭蓋骨に小さな穴をドリルダウンします。 </li><li>細胞の5μlを10μlのガラスハミルトンシリンジをロードします。ハミルトンシリンジは、それに接続されている33Gニードルに鈍い30G 10μlです。それらをピペッティングあるいは接続されている25G針で1ミリリットル注射器を使用するか、それらをロードする前に細胞を混在させるようにしてください。ハミルトンシリンジが読み込まれた後、頭蓋骨に穴でそれを並べるために腕に戻します。 </li><li>針が頭蓋骨のレベルになると、頭蓋骨の表面に針のバントエンドを下げ、それは頭蓋骨の表面下3mmの深さになるまで針を下げます。 </li><li>針が低下した後、それが脳に影響を与える針からの主要な外傷を避けるために2分間が残っているものとします。細胞を移植しても、backfloに注意して、6-8分の合計で1分あたり1μlの割合であるワットセルの最後が注入された後、すべてのセルが入って安定させるために、別の2分の場所に針を残す</li><li>脳から針を外して、Q-ティップで穴を清掃してください。各溶液中で、その順番で3倍、50％Actone、100％エタノール、PBSで針と注射器をきれいに進みます。 </li><li>頭蓋骨の皮膚は、この時点で縫合する準備ができました。 5-0使用すると、PBSは約3針で切開を閉じます。 </li><li>マウスは、熱パッドの上に目を覚ますと、必要に応じて眼軟膏を再適用することができます。それは自分自身で動きを示した後マウスをケージに戻すことができます（つまり、頭を持ち上げたり、肩を動かす）。 </li></ol></li></ol> III。放射線と薬物によってICインプラントの治療<ol class="ualpha"><li>放射線治療<ol><li>細胞株に応じて、マウスの治療は、5から7日後にインプラントを行うことができる。私たちの部門は、放射線治療のため常用電圧放射線治療装置を使用していますメンター·。 </li><li>そのようなBLI（生物発光イメージング）、MRIやCTなどのイメージングは​​、ランダム化前（図3A）に腫瘍を視覚化するために使用することができます。 </li><li>マウスは、以前のようにケタミン/キシラジン/生理食塩水カクテルで麻酔し、眼軟膏は、彼らの目に適用されます。 </li><li>マウスは、マウスの頭が中心に向かって指しているパイの車輪のように設定されているカスタムメイドの放射線治具に配置されています。マウスの体は鉛で放射線から遮蔽されています。 </li><li>薬物治療は、別の配送ルート、すなわちSQ、IPおよびIVを通しての前または放射線のいずれか指定することができます。 </li></ol></li></ol> IV。結果マウスは麻酔注射後45-60分以内に手続きからウェイクアップする必要があります。手順と時間が1を超えた後、マウスが難しく目覚めている場合は½時間を手続きした後、マウスが回復しない可能性があり、安楽死は、効果的な代替手段かもしれません。目の場合EREは、過度の出血であるか、またはプロシージャの安楽死の間の任意の時点で割れた頭蓋骨になるにはお勧めします。すべてがうまくいくと細胞株に依存している場合の手順が行われた後、腫瘍は2-4週間以内に形成開始する必要があります。頭蓋内異種移植モデルを使用する場合は、治療効果は、通常、生存着床後5として測定されます。これはしかし、ICモデルの兆候および症状には、死の前に発生します。マウスが示すことができる物理的な徴候のいくつかは、猫背姿勢、体重の減少、不活発である。神経学的徴候のいくつかは、発作、頭部の傾き、バランスの損失かもしれません。図3Bは、彼は死亡時に腫瘍の染色を示しています。 Kaplan-Meier法のプロットは、データ（図4）を評価するために使用されます。 50％の生存日数を算出し、コントロールに比較されます。併用群は、個々の放射線や薬物武器の追加よりも長く住んでいた場合の組み合わせが成功したされています。 <img alt='"図1"' src="/files/ftp_upload/3397/3397fig1.jpg" files> 図1。Stoelting定位装置。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig2.jpg"> 図2マウスの頭蓋骨にドリル穴の位置の図を示します。 <img alt="図3A" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig3A.jpg"> GBM注入後の図3A。BLIイメージング。 <img alt="図3B" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig3B.jpg"> 死亡率ではGBM腫瘍の図3B。HとE。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig4.jpg"> 図4。PARP阻害剤7日後の手術で注入されたU87 ICインプラントの結果。

<ol><li>Bleau, A. M., Holland, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+the+mouse+genome+to+hunt+human+alternations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Trapping the mouse genome to hunt human alternations.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7737-7738 (2007).</li>
<li>McGrady, B. J., McCormick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+intracranial+invasion%3A+morphological+observations+on+central+nervous+system+invasion+by+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">A murine model of intracranial invasion: morphological observations on central nervous system invasion by melanoma cells.</a> Clin. Exp. Metastasis. 10, 387-393 (1992).</li>
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<li>Candolfi, M., Curtin, J. F., Nichols, W. S., Muhammad, A. K. M. . G., King, G., Pluhar, G. D., McNiel, G. E., Ohlfest, E. A., Freese, J. R., Moore, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology%3A+neuropathlogical+characterization+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathlogical characterization and tumor progression.</a> J. Neurooncol. 85, 133-148 (2007).</li>
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<li>Purow, B., Schiff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+genetics+of+glioblastoma%3A+are+we+reaching+critical+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advances in the genetics of glioblastoma: are we reaching critical mass.</a> Nat. Rev. Neurol. 5, 419-426 (2009).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

このような多形性膠芽腫などの悪性神経膠腫は、最も一般的な原発性脳腫瘍を表しており、予後不良4を持っています。 GBMの影響を受けた患者の生存率は手術、放射線、化学療法5の進歩にもかかわらず（すなわち、9〜12ヶ月後の診断）過去10年間ほぼ横ばいで推移している。神経膠腫の治療の研究のための適切なモデルの特徴は、比較的離散的な腫瘍として再現性腫瘍の位置と細胞の増殖を含めるべきである。細胞はできるだけ密接に人間の神経膠腫の組織学的特徴のようになり、予測可能な成長があるはず腫瘍の発生率は、組織培養とモデルで腫瘍を成長させる能力は、費用6を減らすために小さな動物でなければなりません。効果的な治療法は密接に新しい治療法をテストしwidesprの分子基盤の正確な理解を提供するためのヒトGBMの特徴に似ている実験的なモデルに依存EAD神経膠腫の浸潤7。脳腫瘍の生物学への調査も定期的に情報8を得るために、in vitroで増殖または維持細胞株を使用しています。腫瘍の浸潤と血管新生の阻害は、悪性神経膠腫9に対...

<table border="1"><tbody><tr><td>ラボ標準定位Instrutment </td><td>マウスおよびラットアダプターをStoelting </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> 100パーセントエタノール</td></tr><tr><td> 70パーセントエタノール</td><td> 50％のアセトン</td></tr><tr><td> 6 &quot;Q-のヒント</td><td>アルコール綿棒</td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ80008 </td><td>エチコン5から0 PD </td></tr><tr><td> 1701 SN 31-33G / 1 &quot;/ PT3針</td><td> 1 mlのシリンジ</td></tr><tr><td> 25G針</td><td>加温パッド</td></tr><tr><td>人工涙液軟膏</td><td>非常に微細な先端が永久的なマーカー</td></tr></tbody></table>

同所性マウス脳腫瘍モデルのコンビネーション放射線治療

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

多形性膠芽腫（GBM）は1、最も一般的で積極的な成人の原発性脳腫瘍である。近年、そこに腫瘍浸潤のメカニズムの理解にかなりの進展が、腫瘍の直接の脳内接種では、生理学的に適切な環境2で侵襲的なプロセスを観察する機会を提供しています。限り人間の脳の腫瘍が懸念されるとして、現在利用可能な同所性モデルは、複雑な開頭手術から3腫瘍の固体片の細胞懸濁液または注入の定位注射のいずれかによって確立されています。我々の技術では、脳に直接注入するのに用いられた細胞懸濁液を作成するために組織培養から細胞を収穫します。手術時間は約30分で、マウスが一定の外科的平面にする必要があるため、注射麻酔薬が使用されます。マウスがStoetling（図1）によって行われた定位ジグ内に配置されます。船尾にER外科領域を洗浄し、準備し、切開が行われている、そしてブレグマは、開頭の位置を決定するために位置しています。開頭の位置が右に2ミリメートルとブレグマへ吻側1mmである。深さは、頭蓋骨の表面から3 mmであり、細胞は2μlを2分ごとの速度で注入されています。皮膚が5から0 PDS縫合され、マウスは、加熱パッド上で目を覚ますために許可されています。我々の経験から、細胞株に応じて、治療は手術後7〜10日から行われることができます。薬物送達は、薬剤の組成に依存しています。放射線治療のためにマウスを麻酔しており、治具カスタムメイドに入れられます。鉛は、マウスの体をカバーし、マウスの脳だけを公開しています。 GBMの腫瘍形成と新しい治療法の評価の研究は、正確で再現性脳腫瘍動物モデルが必要になります。したがって、私たちはeffectivenをテストするために、脳や腫瘍の微小環境の相互作用を研究するために、この同所脳モデ​​ルを使用して、放射線とせずに別の治療薬のESS。

この記事の目的は、放射線研究のための同所性神経膠芽腫モデルの使用を記述することです。この資料では、注入、セル処理かかわらず移動して、頭蓋モデルを用いてマウスの放射線治療になります。

膠芽腫（GBM）は、成人における原発性脳腫瘍の中で最も一般的かつ侵襲性の高い腫瘍である1。近年、……において大幅な進展があった。

この手順の全体的な目的は、マウスの脳内に頭蓋内移植した膠芽腫細胞を記述し、提示し、治療することです。これは、まず細胞を調製し、次にそれらをマウスの脳に移植することで達成されます。手術後、脳内に腫瘍が成長し、さまざまな治療法を用いた実験を行うことが可能になります。最終的に、生存曲線によって治療が有効であったかどうかを示すことができます。この手法の意義は、薬剤や放射線などの新しい治療法を試験する際、組織培養よりも効果的な方法となる可能性があるため、膠芽腫の治療への応用が期待されます。まず、U 87細胞などの目的の細胞を80%コンフルエントまで培養します。10% FBS含有DMEMを用い、125 cm³フラスコ1本でマウス5匹に移植するのに十分な細胞数を得られます。細胞から培地を吸引除去し、カルシウムおよびマグネシウム不含のPBS 10 mLを用いて、手動で揺らしながら細胞を短時間洗浄します。洗浄液を吸引した後、10〜15分間トリプシンで細胞を処理し、15 mLの培地でトリプシンを中和します。次に、すべての細胞と培地を50 mLコニカルチューブに移します。2フラスコ分の細胞を1本のチューブにまとめることができます。細胞を1600 RPMで7分間遠心分離し、上清を吸引して完全に除去します。ペレットを10 millilitersの冷PBSに再懸濁させ、溶液中で緩やかにピペッティングして、均一な濁った懸濁液になるまで細胞を洗浄します。細胞計数機を用いて細胞濃度を測定した後、最適な腫瘍増殖を得るためにPBSによる洗浄を繰り返します。U 87細胞の最終濃度を1µLあたり200,000個に調整します。腫瘍の最適な増殖には、他の細胞株では異なる濃度が必要な場合があります。注入用に細胞を準備したら、氷上に保持し、動物の準備に進みます。ホストマウスに麻酔薬を投与し、準備を開始します。約15分後、足指をピンチして、マウスに痛覚がないことを確認します。麻酔後、乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布します。次に、マウスを脳定位固定装置のベッドの上に置きます。マウスの歯をマウスバーの切り欠きに掛けます。その後、ベッドを固定装置に取り付けます。次に頭部を固定するため、マウスにノーズガードを装着し、イヤーバーを耳管にゆっくりと挿入します。頭蓋骨の骨折やマウスの窒息を招く恐れがあるため、どちらのバーも締めすぎないように注意してください。この時点で、頭部が水平であることを確認します。最終的な準備として、頭部をアルコールとヨードでそれぞれ3回ずつ交互に拭き、最後に4回目でアルコールで仕上げます。右目の後方から頭蓋骨の左後方に向かって斜めに切開し、植込手術を開始します。切開線は約10〜15 mmの長さにします。綿棒を使用して切開部位をゆっくりと広げて頭蓋骨を露出し、頭蓋骨と皮膚の間にある膜を拭き取り、血液や過剰な出血を吸い取ります。次に、bgmaを確認し、フェルトペンを用いてその上に10 µLのガラス製ハミルトンシリンジを配置します。前方の縫合線に近い、bgmaから右に2 mm、前方に1 mmの位置に印を付けます。次にシリンジを取り外し、マークした位置の頭蓋骨に小さな穴を開けます。ドリルのビットは22ゲージの針と同等のサイズです。無理に力を入れず、ビットで頭蓋骨を穿孔させてください。追加の加圧は不要です。30～33ゲージの針付きシリンジを使用し、十分に混合した細胞を5 µL充填して、フレームに再装着します。針を頭蓋骨の孔に合わせ、頭蓋骨表面まで降ろします。針を3 mm下げ、2分間待ちます。この待機時間を設けることで、組織への損傷のリスクを軽減できます。プランジャーをゆっくりと押し下げ、約1 µL/minの速度で細胞を移植します。細胞の移植がすべて完了した後、逆流が起こらないよう細心の注意を払ってください。すべての細胞が定着するまで、さらに2分間針を留置します。待機後、脳からゆっくりと針を抜き、綿棒で穿刺孔を丁寧に拭き取ります。次に、5-0 PBS縫合糸を用いて、約3針で切開部を閉鎖します。マウスをヒートパッドの上に置き、必要に応じて眼軟膏を再度塗布します。マウスが頭を持ち上げるか、あるいは肩を動かしたら、ホームケージに戻します。麻酔薬の投与から、この手順には30分から60分かかります。90分経ってもマウスに動きがない場合は、回復しない可能性があるため、安楽死が有効な代替手段となります。また、処置中のいずれかの時点で過度の出血があったり、頭蓋骨に亀裂が入ったりした場合は、安楽死させることを推奨します。使用する細胞株によって異なりますが、マウスへの放射線治療は移植後5〜7日後に行うことができます。例えば、放射線治療にはオルソボルテージ放射線治療装置を使用することが可能です。マウスを実験群にランダムに分ける前に、B-L-I-M-R-IやCTなどのイメージング技術を用いて腫瘍を可視化します。細胞移植後、細胞株に応じて通常2～4週間以内に腫瘍が形成されます。マウスが死亡した後、脳組織に対して染色の処置を行い、腫瘍を検査しました。治療 efficacy（有効性）を評価する上で重要な手法の一つに、カプラン・マイヤー生存曲線のプロットがあります。これにより、薬剤投与、放射線治療、または併用療法を受けた動物の注入後の平均生存期間を比較します。この手法の開発により、腫瘍学の分野における脳腫瘍およびマウスを用いた治療法の研究に道が開かれました。

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