Name: リフトバレー熱ウイルスワクチンの安全性および有効性を改善するためのMP - 12株のNSS遺伝子を操作する逆遺伝学を使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学ぶリフトバレー熱ウイルスMP-12株の逆遺伝学によるNSs遺伝子操作法。BHK-T7-9細胞を用いたトランスフェクションとVero E6細胞での増殖・プラークアッセイにより、ワクチン候補の開発と免疫原性向上に貢献します。

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この作品は、グラントの数5エクセレンスの西部地域センター（WRCE）を通じて、U54 AI057156 - 07、アレルギーや国立感染症研究所から1 R01 AI08764301 - A1、および大学のワクチン開発のためのシーリーセンターの内部資金によって賄われていたテキサスメディカルブランチ。

<ol><li>Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+infectious+rift+valley+fever+virus+entirely+from+cDNA%2C+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene%2C+and+expression+of+a+foreign+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+I-mediated+expression+of+viral+RNA+for+the+rescue+of+infectious+virulent+and+avirulent+Rift+Valley+fever+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses.</a> Virology. 378, 377-384 (2008).</li>
<li>Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+RNA+polymerase-dependent+and+-independent+systems+for+cDNA-based+rescue+of+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus.</a> J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).</li>
<li>Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NSm+proteins+of+Rift+Valley+fever+virus+are+dispensable+for+maturation%2C+replication+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection.</a> Virology. 359, 459-465 (2007).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+blocks+interferon+production+by+inhibiting+host+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription.</a> J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).</li>
<li>May, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFIIH+transcription+factor%2C+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li>
<li>Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).</li>
<li>Habjan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+interferons+and+the+virus-host+relationship%3A+a+lesson+in+detente%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente.</a> Science. 312, 879-882 (2006).</li>
<li>Bon, A. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+i+interferons+potently+enhance+humoral+immunity+and+can+promote+isotype+switching+by+stimulating+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo.</a> Immunity. 14, 461-470 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+innate+and+adaptive+immunity+via+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between innate and adaptive immunity via type I interferon.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).</li>
<li>Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+as+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity+through+dendritic+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation.</a> Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).</li>
<li>Ito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+recovery+of+rabies+virus+from+cloned+cDNA+using+a+vaccinia+virus-free+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system.</a> Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).</li>
<li>Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+tripartite+RNA+genome+packaging+in+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Diaz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+deletion+of+the+alpha-+and+beta+1-interferon+genes+in+human+leukemia+and+derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).</li>
<li>Constantinescu, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+signaling+specificity+of+the+IFNAR+chain+of+the+type+I+interferon+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).</li>
<li>Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF%28HOS%29+ubiquitin+ligase+mediates+the+ligand-induced+down-regulation+of+the+interferon-alpha+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor.</a> EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).</li>
<li>Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+phlebovirus+expression+strategy+and+protein+glycosylation.+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology.</a> 170, 505-510 (1989).</li>
<li>Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+use+of+recombinant+vaccinia+viruses+to+study+Phlebovirus+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression.</a> J. Virol. 62, 826-833 (1988).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Muller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Le May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SAP30+complex+inhibits+IFN-beta+expression+in+Rift+Valley+fever+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells.</a> PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+Protein+of+Rift+Valley+Fever+Virus+Promotes+Post-Translational+Downregulation+of+the+TFIIH+Subunit+p62%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li>
<li>Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF+family+of+transcription+factors+as+regulators+of+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF family of transcription factors as regulators of host defense.</a> Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).</li>
<li>Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+viral+induction+of+distinct+interferon-alpha+genes+by+positive+feedback+through+interferon+regulatory+factor-7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7.</a> EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+mRNA+is+transcribed+from+an+incoming+anti-viral-sense+S+RNA+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment.</a> J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).</li>
<li>Mims, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+Fever+virus+in+mice.+I.+General+features+of+the+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection.</a> Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).</li>
<li>Bouloy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+lacking+NSm+proteins+retains+high+virulence+in+vivo+and+may+provide+a+model+of+human+delayed+onset+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease.</a> Virology. 362, 10-15 (2007).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もない。

RVFVのために遺伝学のシステムを逆には、T7プロモーター2,4,5またはマウス3またはヒトの4 POL - Iプロモーターを利用していくつかのグループによって開発されている。この原稿では、我々はBHK/T7-9セル15その安定的に発現するT7 RNAポリメラーゼを用いて組換えRVFV MP - 12株を生成するためのプロトコルについて説明します。 BHK/T7-9細胞の状態によって異なるウイルス回収の効率化、プラスミドの量は、トランスフェクションされた細胞の数など。我々は、常に実験のために高力価のウイルスストックを得るためにベロE6細胞でP0ウイルスを増幅する。そのような人間の肺の二倍体（MRC - 5）細胞などのタイプ- I IFN -コンピテントセルは、NSSは、I型IFNやPKRを含む阻害抗ウイルス活動による効率的なウイルスの複製をサポートして機能する場合にのみ、ウイルス増幅を使用することができる。 プラークアッセイでは、MP - 12とNSS変異体を滴定するための非常に有用な方法です...

<table border="1"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>最小必須培地（MEM）、アルファ</td><td>インビトロジェン</td><td> 32561037 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変最小必須培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td>改変イーグル培地（MEM 2倍） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11935046 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td>ハイグロマイシンB </td><td> Cellgro </td><td> 30から240 - CR </td><td></td></tr><tr><td>トリプトースリン酸塩スープ</td><td> MPのバイオメディカル</td><td> 1682149 </td><td></td></tr><tr><td> Noble寒天</td><td> VWR </td><td> 101170-362 </td><td></td></tr><tr><td>トランジット- LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>のOpti - MEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 31985070 </td><td></td></tr><tr><td>エアロゾルタイトな蓋</td><td>エッペンドルフ</td><td> C - 2223〜25 </td><td></td></tr><tr><td> 0.33パーセントニュートラルレッド溶液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> N2889 - 100ML </td><td></td></tr><tr><td> C57/WT MEF細胞</td><td> InvivoGen </td><td> MEF - c57wt </td><td></td></tr><tr><td>ブラストサイジンS </td><td> InvivoGen </td><td> ANT - BL - 1 </td><td></td></tr><tr><td>ゼオシン</td><td> InvivoGen </td><td>アリ - 亜鉛- 1 </td><td></td></tr><tr><td>定量ブルー</td><td> InvivoGen </td><td> REP - QB1 </td><td></td></tr><tr><td> BHK/T7-9細胞15 </td><td>岐阜大学、日本</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベロE6細胞</td><td> ATCC </td><td> CRL - 1586 </td><td></td></tr></table>

リフトバレー熱ウイルスワクチンの安全性および有効性を改善するためのmp - 12株のnss遺伝子を操作する逆遺伝学を使用して

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

出血熱、神経疾患やヒトの失明、そして高レートの中絶と反芻動物1の胎児の奇形を引き起こすリフトバレー熱ウイルス（RVFV）は、選択剤とリスクグループ3の病原体を重ねるHHS / USDAとして分類されている。それは、ブニヤウイルス科の属Phlebovirusに属し、このファミリーの中で最も毒性の強いメンバーの一人です。 RVFV MP - 12ワクチン株2,3だけでなく、ZH548とZH501を含む野生型RVFV株4-6、、のためのいくつかのリバースジェネティクスシステムが2006年から開発されている。 MP - 12株は、（リスクグループ2病原体および非選択剤である）のM -およびL -セグメントでいくつかの変異によって高度に弱毒化ですが、それでも機能的な病原性をコード病原性S -セグメントRNA 3を 、運ぶ要因、NSS。それはとしてeffic複製しながらNSS ORFの欠失、フレームの69％を運ぶrMP12 - C13type（C13type）は、すべての既知のNSSの機能を欠いているIENTは、VeroE6細胞におけるMP - 12は、タイプ- I IFNを欠いていません。 NSSは、インターフェロン（IFN）-βmRNAの7,8を含むホストの転写のシャットオフを誘導し、翻訳後レベルでの二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ（PKR）の分解を促進する。9,10 IFN -βの転写であるインターフェロン調節因子3（IRF - 3）、NF - kBからアクチベーター蛋白質1（AP - 1）、およびIFN-alpha/beta受容体へのIFN -βの結合（IFNAR）によって上方制御は、IFN -αの転写を刺激するNSSによるIFN -β遺伝子を含むホストの転写抑制はウイルス複製に応答してそれらのISGsの遺伝子のupregulationsを防ぐ一方で、宿主の抗ウイルス活性を誘導する遺伝子または他のインターフェロン刺激遺伝子（ISGs）11、もののIRF - 3、NF - kBから活性化因子タンパク質- 1（AP - 1）RVFV7によって活性化することができます。 。このように、NSSはさらにMP - 12を減衰させる、およびIFN -β抑制機能を廃止することによって宿主自然免疫応答を高めるために優秀なターゲットです。ここ、我々は組換えMP - 12エンコーディング変異NSSを生成するためのプロトコルを記述し、IFN -βmRNAの合成を抑制する機能を欠いているNSS変異体を同定するためのスクリーニング方法の例を提供しています。自然免疫におけるその重要な役割に加えて、I型IFNは、樹状細胞と適応免疫応答12-14誘導の成熟にとって重要です。従って、I型IFNを誘導するNSSの変異体は、さらに減衰されますが、同時にそれらのワクチン接種のアプローチのための理想的な候補になる野生型MP - 12、より宿主の免疫応答を刺激するより効率的です。

リフトバレー熱ウイルスMP - 12ワクチン株の逆遺伝学的システムは、追加のMP - 12の増加減衰および免疫原性と変異体を作成するための便利なツールです。我々はNSS変異株を生成し、特徴付けるためにプロトコルについて説明します。

リフトバレー熱ウイルスワクチンの安全性および有効性を改善するためのMP - 12株のNSS遺伝子を操作する逆遺伝学を使用して

リフトバレー熱ウイルス（RVFV）は、ヒトにおいて出血熱、神経疾患、または失明を引き起こし、動物においては高い流産率や胎児の……

この手順では、リバースジェネティクスを用いて、変異型NSSをコードする組換えリフトバレー熱ウイルスMP 12株を作製し、ワクチン開発に向けた表現型の特性解析を行うことを目的としています。まず、T7 RNAポリメラーゼを安定的に発現するBhk T seven nine細胞を用いたトランスフェクションシステムにより、組換えMP 12株変異体を回収します。次に、回収した組換えMP 12株変異体をVero E six細胞で増幅させ、プラークアッセイによって増幅したMP 12変異体のタイターを測定します。手順の最終ステップでは、変異型NSタンパク質によるインターフェロンαまたはβの抑制能の欠如をスクリーニングします。最終的に、これらの結果は、リバースジェネティクス系を用いたリフトバレー熱の候補生弱毒ワクチンの調製を促進することが可能です。化学的窒素によるウイルスゲノムへのランダムな変異導入や連続継代などの既存手法に対する本手法の主な利点は、遺伝子系を用いてウイルスゲノムに特定の変異を導入できる点にあります。この手法は、ワクチン候補の免疫原性における主要な病原性因子NSSの重要性など、リフトバレー熱ワクチン分野における重要な疑問の解決に寄与します。一般的に、この手法に不慣れな者は、リフトバレー熱ウイルス（swift water fever virus）が形態標的ブロックおよびその視覚化に最適化された手法を必要とするため、習得に苦労します。ウイルスの回収および水和ステップは、本手法のステップバイステップのプロトコルが報告されていないため、学習が困難であり、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。6 cmディッシュを用い、T7 RNAポリメラーゼを安定的に発現しているT79ベビーハムスター腎細胞を播種し、細胞コンフルエンシーが70〜80%になるまでインキュベーター内で培養します。培地をハイグロマイシンBを含まない完全MEM alphaに変更します。1時間以内に、リフトバレー熱ウイルスの回収のためのトランスフェクションプロセスを開始してください。フルレングスのウイルスRNA発現用のウイルスゲノムRNAをコードするプラスミドセットと、ウイルス蛋白発現用のウイルス遺伝子オープンリーディングフレームをコードする第2のプラスミドセットを作成します。次に、1.5 mLチューブに385 µLのOptumと30 µLのtransit LT oneを加えます。短時間ボルテックスし、5分間インキュベートします。室温で、得られたリポソームをピペッティングで緩やかに混合した10 microgramのプラスミドセットにゆっくりと加え、室温で15分間インキュベートします。トランスフェクション混合液をbhk T seven nine細胞に滴下するように加え、24時間インキュベートします。培養上清を完全MEM alphaに交換し、さらに4日間培養します。培養上清を50 milliliterチューブに回収し、遠心分離により細胞残渣を除去します。上清をスクリューキャップ付きの5 mLクライオチューブに分注し、このP 0ウイルスストックを-80 °Cで保存して、後続の実験に利用します。インターフェロンαおよびβ遺伝子を欠損した細胞でP 0ウイルスを増幅させます。完全DMEMを用いてVero E6培養細胞を80%コンフルエントまで増殖させ、培地を希釈したP 0ウイルスに交換し、1時間インキュベートします。接種物を除去し、完全DMEM 10 mL中で、Vero E6細胞に細胞変性効果（CPE）が現れるまで3〜4日間培養します。前述の手順に従って上清を回収し、これらのサンプルをE6 P1と指定します。6ウェルプレートを用いて、完全DMEM中でVero E6細胞を80%コンフルエンシーまで増殖させます。Vero E6細胞から培地を吸引し、10倍段階希釈したE6 P1ウイルス調製液 400 µLを添加して、1時間インキュベートします。その間に、アガロバレイ用として15 mLチューブを2本準備します。チューブAには、水で調製した1.2% noble agarを7 mL入れ、チューブBには、2×完全MEMおよび10%トリポスファート緩衝液を7 mL入れます。ウォーターバスで15分間保温した後、チューブBの内容物をチューブAに注ぎ、ピペットを用いて混合します。ウイルス接種液を、チューブAとBを1:1で混合した溶液2 mL/ウェルに置換します。その後、細胞を3〜4日間培養し続けます。1.2% noble agar、2× complete MEM、およびニュートラルレッドをチューブA、B、および「neutral red」と表記した3本目のチューブにそれぞれ加え、オーガーオーバーレイ（auger overlay）を調製します。チューブAを42 °Cのウォーターバスに、他の2本のチューブを37 °Cのウォーターバスに15分間浸します。次に、チューブAから7 mL、チューブBから7 mL、およびニュートラルレッドから0.5 mLを合わせて混合します。この混合液を6ウェルプレートの各ウェルに2 mLずつ分注し、プレートを一晩インキュベートします。ここで、1 mLあたりのプラットフォーム形成単位（platforming units）数を決定します。C57野生型マウス胚性線維芽細胞は、NF-κBおよびIRF 3または7によって誘導可能な、分泌型胚性アルカリホスファターゼ遺伝子をコードしています。ここでは、自然免疫反応により誘導されるSEEP活性を測定します。12ウェルプレート中のサブコンフルエント細胞に、NS変異をコードする組換えMP12またはMP12コントロールを感染させ、1時間インキュベートします。接種液を除去し、各ウェルに1 mLの完全DMEMを加え、14時間培養します。SEEPアッセイのために培養上清を回収し、96ウェルプレートの各ウェルに200 µLのQuantum Blueを加え、各サンプルを50 µLずつ添加します。プレートを密閉し、37 °Cで1時間インキュベートします。プレートリーダーを用いて650 nanometersでODを測定します。リフトバレー熱ウイルスは、MP 12株のNSSと比較して、SMおよびLセグメントと呼ばれる3分構成のネガティブセンスRNAゲノムを有しています。C 13型のオープンリーディングフレームは69%短縮されています。通常、逆遺伝学システムにより、C 13型ウイルスにおいて1 times 10 to the six PFU/mL以上のタイターを持つ生存可能な組換えMP 12ウイルスが生成されます。N'S機能が欠如しているものは大きな混濁プラークを形成したのに対し、MP 12は、感染後14時間の模擬感染細胞と比較して、様々なサイズの透明なプラークを形成した。MP 12に感染させたC 57野生型meth細胞では、培養中のseepレベルは上昇しなかった。対照的に、C 13型の感染では、感染後14時間までにseepのレベルが上昇します。マウスISG 56 mRNAに特異的なRNAプローブを用いたノーザンブロットにより、N'Sの発現がない状態でISG 56 mRNAがアップレギュレートされることが確認されました。この手順をマウスへの免疫および中和抗体試験のような手法として用いることで、NSS変異体の免疫原性などの疑問を検証することができます。この手法は、ココidioイジデス（Valley Fever）分野の研究者が、感染細胞および動物における非構造遺伝子の機能を探索する道を切り拓きました。感染性ウイルスを扱うことは非常に危険であるため、エアロゾルの吸入を避けるなどの予防策を常に講じることを忘れないでください。このビデオを視聴することで、組換えMP 12株の回収とタイター測定方法、およびインターフェロンα/β抑制能を欠くNS1変異体のスクリーニング方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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