Name: その後の3Dと頭蓋内注入インビボでの生物発光イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 学ぶマウス神経膠腫モデル構築と生体内バイオルミネセンスイメージング法。GL261細胞を用いた立体定位的頭蓋内移植とIVIS Spectrumによる3D腫瘍追跡技術を習得し、神経腫瘍学の治療効果評価に活用できます。

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我々は、GL261 - lucの細胞の調製に関する有用な提案のためのレンチウイルスのシステムだけでなく、Mahilラオのためのプラスミドの寛大な贈り物のために博士ジョシュアB.ルービンに感謝します。 我々は、脳腫瘍研究（SSBTR）、バロー神経財団とその寛大な支援のためのウォレス財団を支援する学生に感謝する。 動物実験は、セントジョセフ病院と医療センターの動物実験使用の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

<ol><li>Candolfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology%3A+neuropathological+characterization+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> J Neurooncol. 85, 133-148 (2007).</li>
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</ol>

この記事へのフリーアクセスは、キャリパーライフサイエンスが主催している。

細胞の播種は、0.4mmのポケットを作成した後、脳の表面から2.6 mmの深さで注入される。針の適切な配置と深さを確保するためにX線は、C -アームまたは類似のX線画像の激化デバイスを使用して取得できますが、これはオプションです。動物が適切に鎮静されていない場合、手術の合併症は、動物の細胞の注入の間に移動できる点で、発生する場合があります。これは、針のトラックからの細胞の混合または出血の漏洩を引き起こす可能性があります。セルのリーク電流は、腫瘍細胞の異所性増殖を引き起こす。またburrholeはプロトコル4で説明されている2.3ミリメートルの内側行われた場合に行うことができます心室ではない穿刺することが重要です。針と細胞拡散の適切な配置は、2μlのメチレンブルー色素でマウスを注入し、注入された色素の場所を確認するために脳組織を解剖することによって試験した。 このプロトコルでは、in vivoイメージングシステムとt で IVISスペクトラムを使用している彼はこの楽器で使用するために設計されたイメージのソフトウェア（V 4.0）リビング。 （キャリパーライフサイエンス）。 in vivoイメージングシステムと画像解析ツールであらゆる匹敵するが、同様の結果を得るために使用することができます。これらのシステムは、実験的な頭蓋内腫瘍の成長をフォローするために従来の磁気共鳴画像（MRI）に比べていくつかの利点を提供します。最も明白な2楽器の相対的なコストである-動物MRI装置は、はるかに高価であり、一般的に熟練したMRI技術者のサービスを必要とする。ここに記載されたものとin vivoイメージングでは 、エンドユーザが行うことができます。 MRIデータの定量には時間がかかり、やや不正確である間の生物発光データは、定量的である。また、MRI画像は腫瘍細胞に加えて、浮腫や炎症を表示し、それが治療効果から腫瘍を分離することが困難な場合があります。これらの理由から成長する腫瘍の正確な体積測定値を得ることが困難な場合があります。生物発光は、ATPが必要ですしたがって、唯一の生きている腫瘍細胞は、腫瘍の大きさのデータに貢献する。マシンが使用可能であればそれにもかかわらず、MRIにはいくつかの利点があります。細胞は、MRIで可視化するために生物発光マーカーで標識する必要はありません。周囲の腫瘍浮腫を視覚化する能力は、いくつかの実験的なプロトコルのための利点があります。両方の技術の強さは、いずれかを使用すると、他の使用を排除しない、両方のテクノロジが利用可能になったとき、そのデータは腫瘍の成長だけでなく、同​​じ動物からペリ腫瘍浮腫や炎症の存在を得ることができることです。研究者に。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や供給の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> GL261 - luc2バイオウェアウルトラ</td><td>キャリパーライフサイエンス</td><td> GL261 - luc2 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td>インビトロジェン</td><td> 10313039 </td><td></td></tr><tr><td>ジェネティシン（G418） </td><td> GIBCO（インビトロジェン） </td><td> 11811-023 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FCS） </td><td>インビトロジェン</td><td> 26140079 </td><td></td></tr><tr><td> Phospateは緩衝生理食塩水（PBS） </td><td>インビトロジェン</td><td> 70011044 </td><td></td></tr><tr><td> C57BL/6-cBrd/cBrd/Crマウス</td><td> NCI -フレデリック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アクワの涙の潤滑眼軟膏</td><td> Akorn株式会社</td><td> 17478-062-35 </td><td></td></tr><tr><td> Ketaset（塩酸ケタミン） </td><td>ワイエス</td><td> 11570775 </td><td></td></tr><tr><td> Sedazine（キシラジン塩酸塩） </td><td>ワイエス</td><td> 10031894 </td><td></td></tr><tr><td>小動物の定位音源</td><td> Kopfは楽器</td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> SYS - Micro4コントローラとUltraMicroPump </td><td>世界の精密機器</td><td> UMP3 - 1 </td><td>利用できない場合は、手動で注入することが可能です</td></tr><tr><td> 26ゲージと10μlのシリンジは、針の面取り</td><td>世界の精密機器</td><td> SGE010RNS </td><td></td></tr><tr><td> Adison鉗子</td><td>世界の精密機器</td><td> 500092 </td><td></td></tr><tr><td>ペンフィールド解剖</td><td>タラ漁船</td><td> 65から1015 </td><td></td></tr><tr><td> 16グラム1 ½精密グライドニードル</td><td> Beckton、ディッキンソン社（BD） </td><td> 305198 </td><td></td></tr><tr><td>外科ブレードハンドル</td><td> BD </td><td> 371030 </td><td></td></tr><tr><td>サイズ15ブレード</td><td> BD </td><td> 371315 </td><td></td></tr><tr><td> 4から0 Vicryl縫合糸</td><td>エチコン</td><td> VCP496G </td><td></td></tr><tr><td>骨ろう</td><td> MEDLINE </td><td> DYNJBW25 </td><td></td></tr><tr><td> Povidine -ヨウ素綿棒スティック</td><td> MEDLINE </td><td> MD93901 </td><td></td></tr><tr><td> D -ルシフェリンカリウム塩</td><td>キャリパーライフサイエンス</td><td> 122796 </td><td></td></tr><tr><td> Forane（イソフルラン） </td><td>バクスター</td><td> 1001936060 </td><td></td></tr><tr><td> OPMI Pentero顕微鏡</td><td>カールツァイス株式会社</td><td></td><td>どんな手術用顕微鏡で十分です</td></tr><tr><td>オプションの麻酔システムとXenogen IVISスペクトラム</td><td>キャリパーライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

その後の3dと頭蓋内注入インビボでの</emマウス神経膠腫の>生物発光イメージング

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

マウス神経膠腫261（GL261）はin vivoでのモデル系として認識されているヒトの多形性膠芽腫（GBM）の機能の多くは反復する。細胞株は、もともとC57BL / 6同系マウスの系統1に3 -メチル- cholantreneの頭蓋内注射によって誘発されたので、免疫学的に有能なC57BL / 6マウスを使用することができます。我々はGL261を使用していますが、次のプロトコルは、任意の頭蓋内のマウス腫瘍モデルの移植とモニタリングに使用することができます。 GL261細胞を安定的に発現するホタルルシフェラーゼ（GL261 - LUC）に設計された。我々はまた、CMVプロモーターから発現luc2遺伝子の安定なトランスフェクションにより、明るくGL261 - luc2細胞株を作成した。国立癌研究所、フレデリック、MDからC57BL/6-cBrd/cBrd/Crマウス（C57BL / 6のアルビノ変異体）は黒の皮と毛皮による光の減衰を除去するために使用されていました。 in vivoイメージング生体 IM で IVISのスペクトラムを使用して、アルビノC57BL / 6マウスを使用するとシステムの老朽化と、移植の日（キャリパーライフサイエンス、ホプキントン、MA）から可能です。 GL261 - lucおよびGL261 - luc2細胞株は、親のGL261細胞として生体内挙動に同じことを示した。人間性GBMに存在する共有組織学的特徴とこのマウスモデルのようなものがあります：腫瘍壊死、pseudopalisades、血管新生、浸潤、細胞過多、および炎症1。 移植前の動物には、以上のメスで作成された定位装置や切開に入れ、ケタミン（50 mg / kgの）、キシラジン（5 mg / kg）をし、ブプレノルフィン（0.05 mg / kg体重）の腹腔内注射により麻酔し、頭蓋正中線。 burrholeはブレグマ後方0.1ミリメートルと正中線の右側に2.3ミリメートルとした。針は2.6mmの深さに3mmから撤退0.4mmの深さに挿入した。 GL261リュックまたはGL261 - luc2細胞（10 7細胞/ ml）の二つの液を3分間かけて注入した。 burrholeが閉じられましたbonewaxと切開を縫合したと。 定位の移植後の生物の細胞は、移植の日から検出され、腫瘍は、IVISのスペクトラム測定器の3次元画像再構成機能を使用して分析することができます。動物は、150μgルシフェリン/イメージングの前に体重20分の皮下注射を受ける。全身腫瘍組織量が時間の経過とともに平均腫瘍の生物発光を用いて定量される。担癌マウスは、罹患率を評価するために、毎日観察し、以下のいずれかまたは複数の現象が存在するときに安楽死さ：無気力、歩き回るに失敗、猫背の姿勢、新郎への障害、食欲不振、体重の&gt; 10％が失われる。腫瘍は剖検上の動物のすべてに明白であった。

C57BL / 6マウスにGL261細胞の頭蓋内注入は、人間の多形性膠芽腫の特徴の多くを再現悪性神経膠腫を生成します。私達は私達が使用できるようにするために安定的にルシフェラーゼを発現するGL261細胞を用い<em&gt; in vivoで</em&gt;イメージングは​​腫瘍の進行に従うこと。手術と3D<em&gt; in vivoで</em&gt;画像が実証されています。

その後の3Dと頭蓋内注入インビボでの</emマウス神経膠腫の>生物発光イメージング

マウス神経膠腫261（GL261）は、ヒトの膠芽腫（GBM）の多くの特徴を再現するin vivoモデルシステムとして認識されています。

本手順の最終目的は、in vivoイメージングによって経時的な定量的追跡が可能な、神経膠腫（グリオーマ）の頭蓋内モデルを作成することです。まず、ルシフェラーゼ発現グリオーマ細胞を回収・培養し、1 mLあたり1×10⁷から2×10⁷個の細胞懸濁液を調製します。次に、回収した細胞をマウス脳の右前頭葉に定位的に移植します。続いて、動物にLuciferianを皮下注射し、Luciferian発現のキネティックカーブを作成します。IVUS spectrum 生体イメージングシステムを用いて、動物を連続的に撮像し、腫瘍の増殖を追跡するのが本手順の最終ステップです。最終的に、IVUS spectrum 生体イメージングシステムで検出可能な生物発光信号を通じて、腫瘍細胞の増殖と腫瘍の3D局在を示す結果を得ることができます。MRIなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、生物発光イメージングによって生存している腫瘍細胞のみを特定でき、専門のMRI技師を必要としない点にあります。また、短時間で複数の動物を同時にイメージングすることが可能です。この手法は、脳腫瘍に対する新規治療法の有効性はどの程度かという、神経腫瘍学における重要な課題を解決するのに役立ちます。in vivoにおいて、この手法は脳腫瘍の知見を得るのに有用ですが、肺がん、前立腺がん、肝がんなどの他の臓器系にも適用可能です。本手順の準備として、26Gのベベル針を装着した10 µL、50 mmのシリンジに、3 µL以上の神経膠腫細胞（グリオーマ細胞）接種液を充填します。細胞が凝集していないことを確認してください。凝集している場合は、シリンジへの充填をやり直す必要があるかもしれません。麻酔をかけたマウスを定位固定フレームに設置し、この写真に示すようにマウスの頭部をマウスクランプで固定します。充填済みのシリンジをマイクロインジェクターに装着してください。外科手術を開始するために、15番メスと止血鉗子を用いて皮膚切開を行います。動物の両目の間から耳に向かって10～15 mmの切開を加え、bgmaを露出させます。bgmaを正確に特定してください。bmaより遠位にある静脈洞領域と混同しやすいため注意してください。16ゲージの1.5インチ針を使用し、冠状縫合から後方に0.1 mm、正中線から右に2.3 mmの位置に穿孔します。針を軽く押し込みながら回転させて頭蓋骨を貫通させ、脳を露出させます。その後、マイクロインジェクターを用いて、注入針が脳表面にわずかに触れる位置まで移動させます。この位置から、針を3 mmの深さまで進めます。針を3分間そのまま保持します。次に、針を0.4 mm引き抜き、脳表面から合計2.6 mmの深さに調整します。これにより、細胞を注入するための小さなポケットが形成され、適切な配置と深さが確保されます。Cアームを用いて針の刺入深さのX線写真を撮影してもよい。マイクロインジェクターを容量2000 nanoliters、注入速度667 NANOLITERS/分に設定し、3分間かけて細胞懸濁液を注入する。注入後、注入部位からの漏出を防ぐため、針を2分間そのまま保持する。その後、ゆっくりと針を完全に引き抜く。針を抜いた後、Penfieldディセクターを用いて、骨孔をボーンワックスで塞ぎます。最後に、4-0 Vicryl縫合糸を用いて切開部を縫合し、皮膚に大きな隙間が残っていないことを確認します。in vivo。生物発光イメージングは、IVIS Spectrumイメージングシステムを用いて行います。LivingImageソフトウェアを起動し、コントロールパネルの右下にある「initialize IVIS system」ボタンをクリックして、IVIS Spectrumイメージングシステムを初期化します。コントロールパネルの左上にある発光イメージングモードを選択し、生物発光イメージングの最適な時間を決定します。動物にルシフェラーゼを注射した後、まず鎮静状態の動物をイメージングチャンバー内でキネティックスタディに供する必要があります。ルシフェラーゼ発現のキネティックカーブを作成するため、ルシフェラーゼ注射の約5分後に最初の画像を撮影します。その後、最大1時間にわたり3分間隔で画像を撮影するシーケンスを作成してください。コントロールパネルにあるシーケンス設定ボタンをクリックします。コントロールパネルで、中程度のビニング（medium binning）とオート露光から始めて、シーケンス内の最初の生物発光画像の設定を指定します。最適な露光量を決定するために、タイムコースの設定が推奨されます。シーケンスエディターでディレイボタンを選択し、各取得間に3分間のディレイ時間を指定します。シーケンスエディターの「add」をクリックすると、取得パラメータがテーブルに追加されます。曲線が確定したら、シーケンス内の各画像に対してこのステップを繰り返します。信号強度を時間に対してプロットし、最も強く正確な信号が得られる時間を確認することで、最適なイメージング時間を決定できます。この曲線に示されているように、動物はin vivoでの光子数が最大となる時間、すなわちLuciferian投与から約25分後にイメージングする必要があります。実験動物の画像を取得するには、取得時間（acquisition time）の「auto」オプションを使用してください。これにより、ソフトウェアがビニングおよび画像取得に最適な時間を決定します。プログラムファイルおよびその後の画像コメントは、ユーザーのコンピュータディレクトリに保存してください。3Dイメージングを開始するには、イメージングウィザードを使用してfireflyリポータープローブを選択します。生物発光（bioluminescence）ウィンドウで「次へ（next）」を選択すると、取得する6つのスペクトル選択肢が画面に表示されます。「取得シーケンス（acquire sequence）」を選択すると、表面トポグラフィー（surface topography）タブの各設定に従って画像が撮影されます。ツールパレットを使用して、動物の輪郭に合わせて写真をマスクします。動物の表面トポグラフィーの再構成メッシュを作成するには、ツールパレットのDLI 3D reconstructionタブに進み、信号再構成に適した画像取得を選択します。組織特性（tissue properties）にmuscle、光源スペクトル（source spectrum）にfireflyが指定されていることを確認してください。analyzeタブのreconstructをクリックすると、動物表面の3D再構成と、それに対応する信号源の再構成が表示されます。画像の取得および保存後、データ解析を開始できます。参照ボタンをクリックしてファイルを選択し、プログラムファイルにアクセスしてください。画像情報は、「画像情報の表示（view image information）」から確認できます。「関心領域（ROI）」ツールボタンを選択して、信号強度の定量化を行ってください。photonを選択し、画像がフォトンモードで解析されていることを確認します。画像コントロールパネルの左上にあるドロップダウンリストから、タイプドロップダウンリストで測定ROIボタンを選択し、目的のROI形状を選択します。オプションには、円形、正方形、またはグリッドがあります。ROIシェイプ選択を生物発光信号を含む領域までドラッグして、ROIの位置を設定します。取得した画像内のすべての輝度領域をカバーするようにしてください。最後に、[measure]ボタンをクリックして、ROIの信号強度を算出します。ROIラベルが表示されます。細胞がluck遺伝子またはluck two遺伝子にトランスフェクトされているかに関わらず、手術当日にバイオルミネッセンスイメージングで移植細胞が検出できれば、細胞の移植が成功し、強度が出ていることがわかります。このグラフは、アルビノC 57 black sixマウスにおけるGL 2 6 1 luck腫瘍細胞の増殖を追跡したものです。バイオルミネッセンスは3日ごとに測定され、in vivo光子数対移植後日数の形式でプロットされています。写真は、さまざまな時間経過における生物発光を示しています。着色は生物発光の指標であり、腫瘍細胞数に相関しています。動物は、発症または福祉状態の悪化が見られた時点で安楽死させます。これらの解析における標準的な手順ではありませんが、脳を摘出してルシフェラーゼを局所的に投与することで、ex vivo 画像を得ることができます。生物発光反応にはATPが必要であるため、この操作は動物を安楽死させた直後に行わなければなりません。このグラフは、GL 2 6 1 lux 細胞由来の腫瘍と GL 2 6 1 L two 細胞由来の腫瘍から得られたフォトン数を比較したものです。平均5匹の動物を用いた結果、L two 遺伝子の方がより高いレベルの生物発光を示すことが明らかになりました。次の図は、マウスの骨格および脳と共登録された、GL 2 6 1 L 2 細胞の頭蓋内移植の3次元再構成の複数のビューを示しています。皮下注射と腹腔内注射の速度論的な比較も行われました。Luciferを注入した3分後、マウスを鎮静し、その後1時間までは3分ごとに、それ以降は6分ごとにイメージングを行い、生物発光の速度論的曲線を生成しました。ここで示されているように、赤色で示されたLuciferの皮下投与ルートは、黒色で示された腹腔内注射よりも優れており、動物をイメージングする最適なタイミングはLucifer注入後約25分後です。この手術手技を習得すれば、適切に行うことで1時間で完了させることができます。本手順の後、さらなる疑問を解消するために、MRIや蛍光イメージングなどの他の手法を実施することが可能です。例えば、腫瘍周囲に浮腫が存在するかどうか、あるいは腫瘍内およびその周囲でどのような分子レベルまたは生化学的な変化が起きているかなどを確認できます。このビデオを視聴することで、マウス神経膠腫（glioma）細胞の頭蓋内移植および3D in vivoイメージングの手法について十分に理解することができます。

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