Name: カエル精子の化学誘引を検出するためのアッセイの二種類 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学ぶカエル精子の化学誘引アッセイ手法。2つのチャンバーアッセイとジグムンドチャンバー追跡アッセイを比較し、精子遊泳の定量的解析と動的パラメータ測定により受精メカニズム研究に貢献します。

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我々は、彼らのビデオ顕微鏡のワークステーションを使用するためのWMケックバイオイメージング研究室に感謝します。この研究は、NSFの助成IBN - 0615435によってサポートされていました。

<ol><li>Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+Arbacia+punctulata+spermatozoa+to+resact%2C+a+peptide+from+the+egg+jelly+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer.</a> J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).</li>
<li>Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+velocity+and+induction+of+chemotactic+response+in+mouse+spermatozoa+by+follicular+and+oviductal+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Increased velocity and induction of chemotactic response in mouse spermatozoa by follicular and oviductal fluids.</a> J. Reprod. Fertil. 115, 23-27 (1999).</li>
<li>Fabro, G., Rovasio, R. A., Civalero, S., Frenkel, A., Caplan, S. R., Eisenbach, M., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+capacitated+rabbit+spermatozoa+to+follicular+fluid+revealed+by+a+novel+directionality-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of capacitated rabbit spermatozoa to follicular fluid revealed by a novel directionality-based assay.</a> Biol. Reprod. 67, 1565-1571 (2002).</li>
<li>Sugiyama, H., Burnett, L., Xiang, X., Olson, J., Willis, S., Miao, A., Akema, T., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+multimer+formation+of+allurin%2C+a+sperm+chemoattractant+from+Xenopus+laevis+egg+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Purification and multimer formation of allurin, a sperm chemoattractant from Xenopus laevis egg jelly.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 527-536 (2009).</li>
<li>Al-Anzi, B., Chandler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+egg+jelly+releases+a+sperm+chemoattractant+during+spawning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis egg jelly releases a sperm chemoattractant during spawning.</a> Dev. Biol. 198, 366-375 (1998).</li>
<li>Ralt, D., Goldenberg, M., Fetterolf, P., Thompson, D., Dor, J., Mashiach, S., Garbers, D. L., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+attraction+to+a+follicular+factor%28s%29+correlates+with+human+egg+fertilizability%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sperm attraction to a follicular factor(s) correlates with human egg fertilizability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2840-2844 (1991).</li>
<li>Gakamsky, A., Schechtman, E., Caplan, S. R., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chemotaxis+when+the+fraction+of+responsive+cells+is+small--application+to+mammalian+sperm+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of chemotaxis when the fraction of responsive cells is small--application to mammalian sperm guidance.</a> Int. J. Dev. Biol. 52, 481-487 (2008).</li>
<li>Böhmer, M., Van, Q., Weyand, I., Hagen, V., Beyermann, M., Matsumoto, M., Hoshi, M., Hildebrand, E., Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+spikes+in+the+flagellum+control+chemotactic+behavior+of+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ca2+ spikes in the flagellum control chemotactic behavior of sperm.</a> EMBO J. 24, 2741-2752 (2005).</li>
<li>Shiba, K., Baba, S. A., Inoue, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+bursts+occur+around+a+local+minimal+concentration+of+attractant+and+trigger+sperm+chemotactic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ca2+ bursts occur around a local minimal concentration of attractant and trigger sperm chemotactic response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19312-19317 (2008).</li>
<li>Burnett, L. A., Sugiyama, H., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+jelly+proteins+stimulate+directed+motility+in+Xenopus+laevis+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Egg jelly proteins stimulate directed motility in Xenopus laevis sperm.</a> Mol. Reprod. Dev. 78, 450-462 (2011).</li>
<li>Abaigar, T., Barbero, J., Holt, W. V. Trajectory variance and autocorrelations within single sperm tracks as population level descriptors of sperm track complexity, predictability and energy generating ability. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbaigar%2C+T+%22J.+Androl%22">J. Androl</a>. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Mortimer, S. T., Swan, M. A., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractal+analysis+of+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Fractal analysis of capacitating human spermatozoa.</a> Hum. Reprod. 11, 1049-1054 (1996).</li>
<li>Guerrero, A., Carneiro, J., Pimentel, A., Wood, C. D., Corkidi, G., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+locating+the+female+gamete%3A+the+importance+of+measuring+sperm+trajectories+in+three+spatial+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Strategies for locating the female gamete: the importance of measuring sperm trajectories in three spatial dimensions.</a> Mol. Hum. Reprod. 17, 511-523 (2011).</li>
<li>Yoshida, M., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+and+regulation+of+flagellar+movement+by+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+.</a> Mol. Hum. Reprod. 17, 457-465 (2011).</li>
<li>Spehr, M., Schwane, K., Riffell, J. A., Zimmer, R. K., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptors+and+olfactory-like+signaling+mechanisms+in+mammalian+sperm.Mol%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Odorant receptors and olfactory-like signaling mechanisms in mammalian sperm.Mol.</a> Cell. Endocrinol. 250, 128-136 (2006).</li>
<li>Veitinger, T., Riffell, J. R., Veitinger, S., Nascimento, J. M., Triller, A., Chandsawangbhuwana, C., Schwane, K., Geerts, A., Wunder, F., Berns, M. W., Neuhaus, E. M., Zimmer, R. K., Spehr, M., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+Ca2%2B+dynamics+correlate+with+diverse+behavioral+phenotypes+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemosensory Ca2+ dynamics correlate with diverse behavioral phenotypes in human sperm.</a> J. Biol. Chem. 286, 17311-17325 (2011).</li>
<li>Tholl, N., Naqvi, S., McLaughlin, E., Boyles, S., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+of+Xenopus+laevis+sperm+exhibits+multiple+gears+and+its+duration+is+extended+by+egg+jelly+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Swimming of Xenopus laevis sperm exhibits multiple gears and its duration is extended by egg jelly constituents.</a> Biol. Bull. 220, 174-185 (2011).</li>
<li>Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis.</a> Rev. Reprod. 4, 56-66 (1999).</li>
<li>Riffell, J. A., Zimmer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+and+flow%3A+the+consequences+of+fluid+shear+for+sperm-egg+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sex and flow: the consequences of fluid shear for sperm-egg interactions.</a> J. Exp. Biol. 210, 3644-3660 (2007).</li>
<li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+sperm+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 373, 125-129 (2008).</li>
<li>Himes, J. E., Riffell, J. A., Zimmer, C. A., Zimmer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+as+revealed+with+live+and+synthetic+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis as revealed with live and synthetic eggs.</a> Biol Bull. 220, 1-5 (2011).</li>
<li>Sun, F., Giojolas, L. C., Rovasio, R. A., Tur-Kaspa, I., Sanchez, R., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+species-specificity+in+mammalian+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of species-specificity in mammalian sperm chemotaxis.</a> Dev. Biol. 255, 423-427 (2003).</li>
<li>Guidobaldi, H. A., Teves, M. E., Uñates, D. R., Anastasía, A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+from+the+cumulus+cells+is+the+sperm+chemoattractant+secreted+by+the+rabbit+oocyte+cumulus+complex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progesterone from the cumulus cells is the sperm chemoattractant secreted by the rabbit oocyte cumulus complex.</a> PLoS One. 3, e3040-e3040 (2008).</li>
<li>Oren-Benaroya, R., Orvieto, R., Gakamsky, A., Pinchasov, M., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+chemoattractant+secreted+from+human+cumulus+cells+is+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The sperm chemoattractant secreted from human cumulus cells is progesterone.</a> Hum. Reprod. 23, 2339-2345 (2008).</li>
<li>Teves, M. E., Guidobaldi, H. A., Uñates, D. R., Sanchez, R., Miska, W., Publicover, S. J., Morales Garcia, A. A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+for+human+sperm+chemotaxis+mediated+by+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism for human sperm chemotaxis mediated by progesterone.</a> PLoS One. 4, 8211-82 (2009).</li>
<li>Blengini, C. S., Teves, M. E., Uñates, D. R., Guidobaldi, H. A., Gatica, L. V., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sperm+pattern+of+movement+during+chemotactic+re-orientation+towards+a+progesterone+source%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Human sperm pattern of movement during chemotactic re-orientation towards a progesterone source.</a> Asian J. Androl. 13, 769-773 (2011).</li>
<li>Strünker, T., Goodwin, N., Brenker, C., Kashikar, N. D., Weyand, I., Seifert, R., Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CatSper+channel+mediates+progesterone-induced+Ca2%2B+influx+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm.</a> Nature. 471, 382-386 (2011).</li>
<li>Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+activates+the+principal+Ca2%2B+channel+of+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm.</a> Nature. 471, 387-391 (2011).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-465 (1962).</li>
<li>Zigmond, S. H., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Med%22%5BJournal%5D)">Assays of leukocyte chemotaxis.</a> Annu. Rev. Med. 37, 149-155 (1986).</li>
<li>Villanueva-Diaz, C., Vadillo-Ortega, F., Kably-Ambe, A., Diaz-Pérez, M. A., Krivitzky, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+human+follicular+fluid+contains+a+chemoattractant+for+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Evidence that human follicular fluid contains a chemoattractant for spermatozoa.</a> Fertil. Steril. 54, 1180-1182 (1990).</li>
<li>Villanueva-Diaz, C., Arizs-Martinez, J., Bermejo-Martinez, L., Vadillo-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+induces+human+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Progesterone induces human sperm chemotaxis.</a> Fertil. Steril. 64, 1183-1188 (1995).</li>
<li>Olson, J., Xiang, X., Ziegert, T., Kittleson, A., Rawls, A., Bieber, A., Chandler, D. E. A. llurin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+21+kD+sperm+chemoattractant+from+Xenopus+egg+jelly%2C+is+homologous+to+mammalian+sperm-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">a 21 kD sperm chemoattractant from Xenopus egg jelly, is homologous to mammalian sperm-binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11205-11210 (2001).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

アメーバ運動や鞭毛駆動水泳のどちらかで移動する細胞の走化性は、多くの生物学的な文脈で発見され、この現象の研究は、実用的で信頼性の高いアッセイの可用性を必要とします。このようなウニの卵や子実体を形成するために粘菌の細胞の集まりに精子の魅力として、現象のいくつかの例では、、即座に視覚的なインパクトを持っている。この現象の定量は、Eisenbach 18により説明したように、さまざまな方法で行われてきた。これらのアッセイは、毛細血管が精子を引き付けるために満たされた化学誘引物質の使用、精子と化学誘引のために井戸を持っているMaklerチャンバーの勾配と使用を作成するために毛細血管接合貯水池の使用を含む。本論文では、今より頻繁に使用されている二つの&quot;第二世代&quot;のアッセイを説明します。これらのアッセイは、まだ彼らはいくつかの新機能を組み込むグラデーションを作成する必要性に依存しているが。最初に、二つのチャンバーアッセイでは、多数の膜孔SAMPその利点を持っていますルの精子の通路は勾配を越えむしろ複数のキャピラリーの開口部は、単一のアッセイで勾配をテストするために多くの精子を可能にします。 <p c...

<table border="1"><tbody><tr><td> アイテムの名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>ベクトン - ディッキンソン</td><td> 1147分の35 </td><td></td></tr><tr><td> 12μmの細孔膜と12ミリメートル外径インサート</td><td>ミリポア</td><td> PIXP01250 </td><td>我々は以前に使用されるコスター-コーニングトランスウェルプレート＃3403 -現在中止</td></tr><tr><td> Zigmond室</td><td> Neuroprobe </td><td> Z02 </td><td></td></tr><tr><td>シリコーンオイル</td><td>ゼネラルエレクトリック</td><td> SF1154 </td><td>ダウコーニング550流体と同等</td></tr><tr><td>画像Jソフトウェア</td><td>のWayne Rasband、研究サービス部門、国立精神衛生研究所</td><td>無料でダウンロード http://rsbweb.nih.gov/ij </td><td>ウィンドウズ、林上で動作するJavaプログラムUXとMac </td></tr><tr><td> MtrackJソフトウェア</td><td>エリックMeijering / Imagescience / <a href="http://www.bigr.nl/">生物医学イメージンググループ</a> 、エラスムスMC -大学医療センターロッテルダム</td><td>無料でダウンロード<a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/</a> </td><td> Windows、Linux、およびMac上で動作するJavaプログラム</td></tr><tr><td>仮想ダブソフトウェア</td><td> <a href="http://www.virtualdub.org/gpl.html">GNU一般公衆利用許諾</a>ソフトウェア</td><td>経由で無料ダウンロード<a href="http://www.virtualdub.org/index.html">http://www.virtualdub.org/index.html</a> </td><td>プラグインの下の画像JのWebサイトでのセットアップ手順、Windowsの場合のみ</td></tr><tr><td> cellSensソフトウェア</td><td>オリンポス</td><td> Webサイトを参照してください。 <a href="http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070">http://www.olympusamerica.com/seg_section/p</a>roduct.asp？製品= 1070 </td><td>コントロールとカメラの様々な画像が取り込めます。また、画像処理能力を備えている</td></tr></tbody></table>

カエル精子の化学誘引を検出するためのアッセイの二種類

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

無脊椎動物における精子の化学誘引は1つが精子懸濁液に魅力的なペプチドを含むピペットを配置し、顕微鏡下でピペット約1精子の蓄積を可視化できることが十分に堅牢にすることができます。このようなカエル、齧歯類やヒトなどの脊椎動物における精子の化学誘引は、検出することがより困難であると定量的なアッセイが必要です。化学誘引物質の源、いわゆる精子の蓄積アッセイ、および実際に個々の精子の遊泳軌跡を追跡アッセイするために精子の動きを定量アッセイ - そのようなアッセイは、二つの主要な種類があります。 精子の蓄積アッセイは、それによって用量応答曲線と時間のコースが比較的迅速に実施できるように一日で行われるアッセイの比較的急速にできるように、数十から数百、です。アッセイのこれらのタイプは、多くの確立された化学誘引システムを特徴付けるために広く使用されている - 例えば、好中球の走化性細菌に卵胞液に生じたすべてのペプチドと精子走化性。精子の追跡アッセイは、集中的に多くの労働力であるがchemoattractanctsが実際に精子がかかること水泳のパスを変更する方法に関する追加データを提供することができます。このタイプのアッセイは、chemoattrractantグラデーション軸に相対的な精子の運動の方向を示すために、特徴的ターンや卵に近い精子をもたらすの向きの変化を視覚化するために必要です。 ここでは、アッセイのこれらの2つのタイプのそれぞれに使用方法を説明します。利用精子の蓄積アッセイは、&quot;二チャンバー&quot;アッセイと呼ばれています。両生類の精子は12μmの直径の孔を有するポリカーボネートフィルターの床を持つ組織培養プレートのインサートに配置されます。精子とのインサートは、バッファと慎重に床、壁を（図1参照）を満たしているウェル底にピペットchemoatttractantを含む組織培養プレートのウェルに配置されます。インキュベーション後、精子の貯水池を含む最上位の挿入は慎重にRです。emoved、と膜を通過した下部チャンバー内の精子は、削除ペレット化し、血球計またはフローサイトメーターでカウントされます。 精子の追跡アッセイは、もともとは好中球の走化性を観察するために開発されたとGiojalasや同僚2,3によって精子の観察用に修正Zigmondチャンバーを採用しています。チャンバーは2つの垂直方向の谷が機械加工されているに厚いガラスのスライドで構成されています。これらは、1 mm幅の観測プラットフォームで区切られます。カバーガラスの塗布後、精子は他に化学誘引剤、一つの谷にロードされ、個々の精子の動きはビデオ顕微鏡により視覚化した。ビデオ映像は、各精子の軌道を形成する時間（XYTデータセット）の関数としてxy平面における2次元セルの動きを識別するためのソフトウェアを用いて分析される。

卵の周り卵と細胞外コーティングは、頻繁に精子と通信することにより、受精を促進する卵にそれらを導くためにいるペプチド、タンパク質と低分子化合物を放出する。精子の蓄積アッセイと精子のトラッキングアッセイ - 我々は精子の化学誘引を検出するために使用されるアッセイの二つのクラスを記述し、比較するカエルの精子を使用した。

無脊椎動物における精子の化学走性は十分に強力であるため、誘引ペプチドを含むピペットを精子懸濁液の中に配置することで...

本稿では、2チャンバーアッセイを用いて精子の化学走性を評価するための2つの異なる方法について述べる。まず、活性化したカエルの精子を、24ウェルプレートのウェルにセットした多孔性膜底付きインサート内に分注する。その後、精子が配置された状態で、ウェルの底に化学誘引物質を慎重に添加し、化学走性の勾配を形成させる。次に、化学走性勾配に反応して細胞が多孔質膜を通過するための時間を設けるため、精子をインキュベートします。最後に、インサートを取り出し、2室アッセイにおいてウェルの底まで遊走した精子を血球計数計で計測します。最終的に、例えばZigmanチャンバー追跡アッセイの用量反応曲線分析を用いることで、精子化学誘引物質の活性を比較し、定量化することが可能です。まず、シリコンオイルを用いてカバーガラスをジグマンチャンバーに密着させ、顕微鏡の円形開口部の上に逆さまに配置します。次に、チャンバーの一方の側を活性化したカエルの精子で満たします。続いて、もう一方の側を化学誘引物質溶液で満たします。5分後に化学走性勾配が形成され、この時点で、勾配に沿って泳ぐ精子の様子をビデオ撮影することができます。最終的に、ジグムンドチャンバー追跡アッセイで得られた映像を解析することで、精子の速度、および化学誘引物質の勾配に応答した精子の化学走性パターンと移動軌跡を決定できます。精子の化学走性を検出するためのこれら2つの方法は相補的であり、それぞれ異なる種類のデータが得られます。2チャンバーアッセイでは、精子が多孔質膜を通過するため、化学誘引物質に対する精子の反応を定量化することが可能です。2チャンバーアッセイの視覚的な実演は極めて重要です。なぜなら、開始時の精子および化学誘引物質の添加ステップ、ならびに終了時の精子およびインサートの除去ステップにおいて、マイクロピペットの精密な操作が求められるためです。Zigmundチャンバーアッセイでは、ビデオを用いて化学走性勾配の中を泳ぐ精子を記録します。これにより、速度や方向などの動的パラメータの決定が可能になります。2チャンバーアッセイに対するジグムンドチャンバー追跡アッセイの主な利点は、精子の遊泳を可視化し、多くの動的パラメータを用いて分析できることです。カエルの精巣の一端に穴を開け、反対側からシリンジと針を用いて緩衝液を注入し、精子を洗い出します。カエルの精巣から精子を洗い出した後、ヘモにより回収された細胞数を推定します。次に、ストック精子懸濁液を卵母細胞用リンガー液で希釈し、精子密度を 2 × 10⁷ cells/mL に調整します。5 µL の精子を F1 バッファーで 10 倍に希釈し、位相差顕微鏡を用いて運動性を評価します。次に、マイクロピペットを用いて、プラスチック製の24ウェル組織培養プレートの各ウェルに700 µLのF1バッファーを分注します。次に、これから行う各アッセイについて、室温にてマイクロ遠心チューブ内で精子懸濁液100 µLを900 µLのF1バッファーで希釈し、浸透圧ショックによって精子の運動性を活性化させます。バッファーを満たしたウェルに、外径12 mm、孔径12 µmのインサートを配置します。この際、インサートを中央からずらして配置し、片側にスペースを空けるようにしてください。次に、カットオフチップを備えたマイクロピペットを用い、運動活性化精子 400 µL を直ちにウェルに分注します。精子懸濁液をインサートの壁面に沿って滴下し、インサート底部のフィルターに流れ落ちるようにしてください。続いて、プレートの各ウェルの、ウェル壁と中心からずれたインサートとの間の隙間に、化学誘引剤 50 µL をマイクロピペットで慎重に分注します。ウェルの側面と底面が接する箇所に液滴を滴下するように注意します。系を乱さないようにピペットを抜きます。すべてのアッセイの準備が完了した後、最初のアッセイを開始し、50分間インキュベートするまで、プレートを室温で静置します。その後、片手でインサートを慎重に固定しながら、マイクロピペットで上部チャンバー内の精子懸濁液の大部分または全部を除去し、アッセイを停止させます。精子が上部チャンバーから移行したら、直ちにインサートを取り出して廃棄します。次に、各ウェルの精子懸濁液を混合し、底に沈殿した精子を再懸濁させます。その後、各ウェルの精子懸濁液すべてを個別のマイクロ遠心チューブに移します。最終濃度が 0.5% volume per volume になるようにホルムアルデヒドを添加します。各チューブ内の固定済み精子をペレット化します。10秒プッシュボタンを使用し、パーソナルマイクロ遠心機で遠心分離します。その後、各チューブから上清を100 µL残してすべて取り除き、ペレットをその量で再懸濁します。次に、精子懸濁液 20 µLを蒸留水で10倍に希釈し、ヘモサイトメーターで精子数をカウントします。正立顕微鏡の40倍対物レンズを使用することで、この2チャンバーアッセイにより、用量反応試験や誘引物質間の比較に適した定量的な結果が得られます。例として、カエル卵の水には、赤色の記号で示されるような精子誘引物質が含まれています。卵の水は、精子誘引物質の濃度が高くなるにつれて、多孔質膜を通過する精子数の増加とその後の減少を引き起こします。対照的に、白色の記号で示されるウシ血清アルブミンは、同じ濃度範囲においてほとんど影響を与えません。Zigmanチャンバーアッセイを開始する前に、まず倒立顕微鏡ワークステーションがビデオ録画の準備ができていることを確認してください。顕微鏡をセットアップします。カメラ制御ソフトウェアを起動し、1秒間に7フレームの速度で取得するように設定します。カメラが観察プラットフォームにピントが合っていること、および出力がコンピュータモニターに送信されていることを確認します。次に、顕微鏡の視野に観察プラットフォームの幅の大部分または全部が含まれていることを確認します。その後、卵細胞用リンガー緩衝液でカエルの精子懸濁液を調製し、F1緩衝液で化学誘引物質を適切な濃度に希釈し、どちらも使用するまで氷上で保存します。次に、清潔で乾燥したZigmundチャンバーを用意します。マイクロピペットを用いて、各troughの外縁から約5 mm離れた平行な位置に、約4 µLのシリコンオイルを線状に塗布します。その後、22 × 40 mmのカバーガラスをチャンバー上に配置し、シリコンオイルが各troughの外縁まで均一に広がるようにします。次にチャンバーを反転させ、顕微鏡ステージにある大きな円形の切り抜き部分の上に配置します。カバーガラスがステージに接触しないように注意しながら、oocyte ringer's buffer中のxap spermを、F1バッファーと1:10の割合で室温で混合し、20 µL分活性化させます。先端をカットしたマイクロピペットを用いて、直ちに運動性が活性化した精子を70 µL吸引します。次に、マイクロピペットを低い角度で保持し、チップを側面の開口部に配置します。毛細管現象によってt-t-hとブリッジを満たします。その後、xap精子の運動寿命には限りがあるため、同様の手順で反対側のt-t-hに化学誘引物質溶液を満たします。3分以内にビデオ撮影を開始し、5分間継続します。Zigmanチャンバー追跡アッセイでは、化学誘引物質の濃度勾配の中を泳ぐ精子のビデオ顕微鏡観察が可能です。この動画では、観察プラットフォーム上を泳ぐ精子の記録が示されており、この図に示すように、その軌跡が赤色で追跡されています。精子の軌跡は複数のセグメントで構成されており、各セグメントは矢印で示され、連続する動画フレーム間での精子の移動を表しています。軌跡のセグメントは個々の精子の遊泳行動を辿るものであり、円を描く動きや方向転換などのパターンを明確にします。これらのデータから、各セグメントの速度と方向、あるいは1つの軌跡または複数の軌跡グループに含まれる全セグメントの特性を決定することができます。例えば、正味の直線距離についてです。軌跡の開始点と終了点を結ぶベクトルはx軸成分を持ち、ここに赤色で示されているようにx軸から角度thetaの方向に位置しています。化学誘引物質の勾配が存在する場合、thetaは減少し、x軸方向の移動距離は増加するはずです。これらの変化は、精子が化学誘引物質の方向に向かって勾配を遡って泳ぐ傾向があることを意味しています。これら2つのアッセイを実施する際には、各デバイスへの精子および化学誘引物質の適切な充填に注意することが、精子のパフォーマンスにおいて再現性のある走化性勾配を得るために不可欠であるということを覚えておく必要があります。

two-types-of-assays-for-detecting-frog-sperm-chemoattraction

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